Summary
颅面骨细胞组织长期以来一直推测但从未直接显现。多光谱细胞标记和体内活 成像可以在斑马鱼下颌动态细胞行为的可视化。在这里，我们详细的协议来操作Zebrabow转基因鱼，直接观察细胞嵌入和麦克尔软骨细胞的形态变化。
Abstract
脊椎动物颅面结构的发展，需要的细胞迁移，增殖，粘附和分化精确协调。该麦克尔软骨，第一咽弓衍生物的图案涉及颅神经嵴（CNC）细胞的组织分化软骨细胞的迁移和逐步分区，增殖和。期间下颚形态几项研究描述数控迁移，但的软骨细胞如何实现组织中梅克尔软骨的生长和扩展的细节仍不清楚。的SOX10限定，化学诱导Cre重组介导的重组产生截然不同的荧光蛋白（RFP，YFP和CFP）的排列，从而产生祖细胞和它们的后代的多光谱标记，反映不同的克隆群。使用共聚焦延时摄影，也能够观察到软骨细胞behavi或斑马鱼梅克尔软骨的发育过程中。
多光谱细胞标记使得科学家能够证明延伸梅克尔软骨细胞。在麦克尔软骨，这预示了下颌骨的推广阶段，软骨细胞插层，以实现扩展，因为他们在一个有组织的单细胞层排叠加。该组织嵌入过程中未能介导细胞扩展提供了蜂窝机械的解释下颌骨发育不良，我们观察下颌骨畸形。
Introduction
颅面发展需要复杂的分子，细胞和组织的相互作用来驱动细胞的增殖，迁移和分化1,2,3。此严格调节和复杂的过程，受遗传和环境扰动，使得颅面畸形是其中最常见的出生畸形1-9。虽然外科手术仍然是主要的治疗方法为颅面畸形，了解发展的基础是至关重要的创新，未来的治疗方法。因此，研究的形态发生和机制中的收敛和延伸和细胞融合提供了新的见解的颅面骨1的形成。
颅神经嵴迁移和填充第一咽弓，进而形成配对下颌流程延伸到形成麦克尔软骨，这预示着下颌骨。形态Øf显示麦克尔软骨需要通过定向增殖，细胞分化和分化1,10软骨组织。然而，软骨细胞组织中的梅克尔软骨的生长和扩展的复杂仍不清楚。理解动态细胞行为是对理解影响下颌大小，如发育不全颌骨表型11先天性畸形的关键。
斑马鱼胚胎提供了对麦克尔软骨形态详细研究的许多发育和遗传的优势。其遗传易处理性，透明度， 离体快速发展的强大优势，通过实时成像6放贷很好的观察细胞的运动和组织。采用谱系追踪工具，如SOX10：枫转基因线，我们和其他人已经圈定了胚胎颅面骨1,5的神经嵴起源。 USI纳克的SOX10：ERT2 Cre重组与UBI：Zebrabow-M的转基因系，现在有可能颅面发育过程中，探索细胞运动的细节。所述Zebrabow-M，是转基因线工程与泛素启动子驱动的荧光团不同的表达，每个由lox位点8侧翼。该Zebrabow-M默认荧光红，表达RFP。诱导Cre的表达后，Zebrabow-M的构建重组和细胞表达不同的荧光团（RFP，CFP和YFP）创建在胚胎多光谱表达的组合。所有的子细胞从重组事件后的标记的细胞分裂，然后克隆标记，从而使细胞群，从不同的并列祖派生是克隆标记。由该克隆细胞标记，细胞增殖和迁移与克隆分辨率可以跟随（图1 和2）。
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Protocol
马萨诸塞州总医院实验动物管理和使用委员会（IACUC）批准根据协议号＃2010N000106的所有程序。这是符合协会的评估和实验动物国际（AAALAC）的指导方针的认可。
1.试剂和材料准备
- 制备1升的50X E3胚胎培养基（ 见表 1）和制备1升1X E3胚胎培养基（ 见表 2）。
- 加入PTU 30毫克到1升1X E3的准备与N-苯基硫氧嘧啶（PTU）E3胚胎中期。搅拌O / N，以确保机动部队已完全溶解。存储在RT。
- 为了制备链霉蛋白酶溶液，稀释150微升链霉蛋白酶（0.5毫克/毫升）的15毫升1X的E3。这一数额是足够的1培养皿。立即使用。
- 准备甲基纤维素溶液。
- 制备E3-三卡因溶液通过混合75 ml的0.2％三卡因的用25ml的1X E3。煮沸3克甲基纤维素在75毫升E3-三卡因溶液。
- 补足终体积到100毫升，E3-三卡因溶液。最终的甲基纤维素溶液是粘稠和不透明带黄色调。贮存：RT保护的光。
- 他莫昔芬的股票和感应解决方案
- 通过将4-羟基在100％乙醇制备5mM的他莫昔芬原液。商店的股票在-80℃。
- 准备新鲜的稀释他莫昔芬在1X E3的愿望，得到浓缩感应解决方案。注意！使用前请咨询MSDS。
- 制备1升0.2％三卡因的按表3中。
- 获取共聚焦幻灯片。胶4玻璃罩（18×18）在一起，形成一个块，然后把2个街区，在24×60的玻璃罩相距2厘米，以便安装在中间的胚胎。
2.胚胎制备
- 转基因株系。
- SOX10：ERT2 Cre重组
注：使用标准的分子克隆方法ERT2 Cre重组和商业上获得重组克隆技术：生成靶向载体pDestTol2- SOX10。- 结合5'进入克隆（pENTR5'- sox10p）含有7.2Kb的SOX10的启动子，一个网关中间克隆（PME-ERT2-Cre的），和一个3'进入克隆（pENTR3'-polyA的），其与透镜目的地LR反应矢量pDestTol2-α晶状体 ：YFP。
- 净化构建pDestTol2- SOX10：ERT2 Cre重组。共注入纯化构建体（100毫微克/微升）用TOL2转座的mRNA（50纳克/微升）到WT胚胎（Fo）的一个小区的阶段。
- 屏幕F0成人创始人为种系传递的基础上强劲的黄色荧光F1胚胎。
- SOX10：ERT2 Cre重组; Zebrabow-M
- 异交的Zebrabow-M行（2.1.1）与SOX10：ERT2-Cre转基因。
- 选择胚胎表现出较强的无处不在RFP的表达和YFP镜头标记和成长，直到他们成年。
3.胚胎收集
- 建立了几个对SOX10的：ERT2 Cre重组; Zebrabow-M转基因斑马鱼下午5点和下午6点第1天之间。
- 第二天，拉早上分频器和收集中午前后鸡蛋。
- 他们转移到培养皿中，并新增15毫升链霉蛋白酶的解决方案，以dechorionate胚胎。
- 孵育胚胎进行1〜5分钟，直到胚胎的约60％已被dechorionated。停止反应通过滗析链霉蛋白酶溶液，并用新鲜的E3介质洗胚胎3-4倍。
- 孵育在E3的dechorionated胚胎在室温O / N，让他们发展，达到10体节阶段。每孵育50-60离合器胚胎，以避免不同的发育生长。 4.治疗
- 检查光场显微镜下胚胎的发育阶段，以确保他们在10体节阶段。
- 使用荧光显微镜与红色荧光蛋白（RFP）过滤，分离出亮红色的胚胎。
- 加入10的羟基他溶液到培养皿μM和孵育所述分离的胚胎在28.5℃下进行3小时进行到Cre的重组的诱导。
- 滗他莫昔芬溶液和E3洗胚胎几次。
注意！丢弃在一个特殊的生物废料容器中的他莫昔芬的解决方案。 - 孵育胚胎在28.5°CO / N。
- 当胚胎是大约28-29体节阶段（约24小时受精后），孵化的胚胎在28.5℃，在E3-PTU解决方案以后。
注：PTU是这里用来抑制在发育中的胚胎形成黑素细胞的。这种治疗是必要的，以避免荧光的由自体荧光黑色素细胞的信号失真。 - 孵育胚胎在28.5℃，
- 以可视化的全面发展颅面结构中，选择红色信号和表达Cre的标记阳性（黄色视网膜）的强度的胚胎在4天后施肥。
- 麻醉与E3 / 0.015％三卡因溶液的胚胎。当没有活跃的走势或鳍活动时，轻轻地捅了捅胚胎观察麻醉被确认。
- 传输用于成像所选胚胎成含有一滴甲基纤维素的培养皿中，并轻轻薰胚胎与甲基纤维素。
- 在干净的共焦幻灯片，将一滴新鲜的甲基纤维素和使用微加载提示下拉内安装的胚胎。位置胚背采取谨慎不要碰直接胚胎。
- 覆盖安装胚用25×25盖玻片并在必要时通过操纵盖玻片调节胚胎的位置。
- 胚胎是现在已经准备好形象。
- 使用20X干透镜物镜（数值孔径0.75;针孔大小2.0微米）对焦胚胎。
- 按下显微镜L100按钮，并在软件中选择的通道。
- 选择激光共聚焦设置按钮，然后单击“自动”，并关闭窗口前选择以下途径：CH1：CFP，CH2：GFP，CH3：RFP和mCherry
- 点击“删除互锁”按钮前，打开CH2和CH3。点击“播放”开始扫描。
- 专注于感兴趣的结构，这是最好的开始半帧/秒的高电压（HV）150，然后相应地调整设置完成，直到所需的图像质量是交流hieved。招标书会比其他颜色更亮，从而调节高压。改变Z位置找到这两个YFP和RFP阳性细胞。
- 一旦设定的设置，捕获胚胎的形象。保存你的照片进行图像处理的每个分割通道的共焦成像软件格式和TIFF格式。
- 接下来，CFP成像，关闭CH2和CH3并打开通道1。重新调整设置如在步骤5，而不改变焦点区域。
注：CFP可真难以检测由于在蓝色通道的背景信号，可以通过调节针孔大小被规避。较大的针孔大小允许更好的检测荧光的减少信号/背景噪声比。然而，一个较大的针孔会降低共焦效果，影响图像质量。因此，仔细调整的设置是必需的以获得所需的图像质量和强度。 - 捕获图像，并将其保存在两种格式（共聚焦软件和TIFF）进行图像处理。图像然后可以使用通用图像处理软件来合并层和所描述的水平和同事8提高颜色设置处理。
5.胚胎选择
6.安装在甲基纤维素的胚胎
通过荧光显微镜7.分析
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Representative Results
传统的可视化软骨通过整装阿辛兰污渍是非常宝贵的观察开发麦克尔软骨和常用的可视化最终细胞组织12（ 图1A）。为了进一步分析发展中的软骨细胞加班，使用SOX10谱系追踪：枫的转基因品系，使我们能够研究细胞的迁移，融合和延伸活胚胎2,12（ 图1B）。然而，软骨细胞在颅面骨骼结构的组织仍然知之甚少。通过实时成像，所述Zebrabow-M的转基因系是能够揭示软骨嵌入和伸长，其介导的麦克尔软骨（图1C-G）的延伸和生长的过程。
在这个协议中，UBI：Zebrabow-M; SOX10：ERT2-Cre的胚胎在10体节和软骨治疗他莫昔芬在下颚核细胞发育过程中显现在不同时间点（从3旦至5旦）。下颌最好描绘腹，让欣赏到清晰的麦克尔软骨无筛片和脑颅背部的干扰。在稳定地保持和遗传颜色允许容易谱系追踪和集物流细胞命运的映射由黑色箭头在图2A-2D所示。单蓝色单元格显示迁移和插层及其相邻小区。然后，它沿前后轴伸长，以形成一个均匀的成形软骨细胞从而保持了梅克尔软骨的全球形状，因为它向前延伸。
这种技术允许的下颚生长畸形在如罗宾序列，其中小颌是所描述的突出特征之一的条件的细胞和器官水平的研究。失败的增殖，延期或嵌入可在T得到有效显现他成长的软骨细胞随着时间的推移。
| 氯化钠 | 14.61克 |
| 氯化钾 | 0.65克 |
| 氯化钙 | 1.83克 |
| 硫酸镁 | 1.99克 |
| 去离子H 2 O的 | 千毫升 |
| *存储：RT | |
| **添加1滴亚甲基蓝作为抗真菌 | |
表1. 50X E3胚胎培养基配方
| 50X E3 | 20毫升 |
| 去离子H 2 O的 | 980毫升 |
| *存储：RT | |
| 1M三Cl（pH值9.5） | 9毫升 |
| 三卡因 | 2克 |
| 去离子H 2 O的 | 补至1L |
| *存储：RT | |
表3. 0.2％三卡因配方
图1（A）荧光麦克尔SOX10软骨：。4 DPF图宾根胚胎沾上阿辛蓝绿色荧光蛋白（B）解剖麦克尔软骨（C）的转基因斑马鱼线UBI：Zebrabow-M十字架SOX10：ERT2-CRE。 （DG）UBI：Zebrabow-M; SOX10：ERT2铬在RFP（四）电子图像，YFP（E），CFP（F）通道和合并（G）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2（AD）时光倒流的Zebrabow-M摄影：SOX10：ERT2-Cre重组酶在3dpf（A），3.5dpf（B），4dpf（C）和5dpf（D）。黑色箭头指向同一个克隆。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
阿尔新蓝和photoconvertible转基因株系上述相得益彰确定软骨和骨骼发育的复杂的过程。然而，器官在现场细胞迁移和组织长期以来一直推测，间接证明了，但从来没有显现。 Zebrabow-M的转基因系加上软骨特异性表达Cre允许同时实时观测参与骨和软骨形成所有这些不同的事件。这种技术允许的下颚生长缺陷在诸如罗宾序列，其中小颌是所描述的突出特征之一的条件的细胞和器官水平的研究。失败的增殖，延期或可插在不断增长的软骨细胞随着时间的推移得到有效的可视化。
颜色的多样性优化
优化的Cre水平通过滴定的4-羟基的浓度可以控制分配延长重组和色彩的多样性叔不会导致胚胎致死。雌激素是正常视网膜发展的关键，因此，高剂量的他莫昔芬（>25μM）的可诱导视网膜变性，高死亡率（〜60〜80％），颅面畸形和发育迟缓。此外，4-羟基稀释于乙醇中，这本身是胚胎发育13中的毒性。因此，为了确定最佳的浓度和阐述，以获得一个良好的复合速率的持续时间，但限制了胚胎毒性是重要的。
4-羟基他所希望的浓度进行了优化在此协议。不同浓度（5-25微米），诱导时间点（10体节，24个，36＆48 HPF）和持续时间（30分钟至6小时）进行试验（数据未示出）。他莫昔芬（5微米）的低剂量产生一个有限的重组，而较高剂量（从10至20μm）生产的卡ILAR重组和色彩的多样性。剂量大于20微米的损害胚胎的正常发育，因此不适合研究颅面畸形。感应的持续时间小于2小时，并不足以创建适当重组而超过6小时的诱导诱导的毒性和在胚胎发育异常的。感应3或4小时没有在重组和最终结果的量不同。
诱导后的24 HPF胚胎阶段并未产生所需的重组和荧光表达。因此，在正常发育和适当量的颜色之间的最佳折衷，而不会导致在显著高数量胚胎死亡率的测定为3小时的诱导在10体节用他莫昔芬的10μM浓度。
画面质量
获得一致和高品质的图像可以是具有挑战性的。如果VI的单场EW是无法想象整个麦克尔软骨或感兴趣的颅面结构，整体结构可以通过利用Z-堆栈进行映射。然而，获得的Z堆栈可以在活胚胎成像具有挑战性，因为运动伪影。因此它具有Z堆叠图像的质量之间的折衷是重要的，信息期间较长期激光曝光成像会话和预防激光诱导光致漂白的过程中所需的量。
这种技术的另一个限制是荧光蛋白不显示成像期间相同的稳定性。例如RFP是一个相对稳定的蛋白质，但YFP可以是不稳定的。因此，根据经验来确定最佳成像设置，以检测在给定的胚胎具有合适强度的最大色彩数是很重要的。
除了颜色稳定性，共焦显微镜是另一个限制，因为它是不能读取CFP和YFP通道在一起。这是由于从CFP发射两个470nm的和535nm通道中检测的事实。另外，CFP（470-535nm）的发光光谱和YFP（530nm处）重叠的激发光谱，形成FRET（荧光共振能量转移）的工件。换言之，当检测到的CFP荧光时，它激发YFP的荧光从而产生非特异性信号。由于这个原因，这个协议轮廓扫描所有荧光通道分别单独和合并的各个图像分别使用共同的成像处理软件。规避共聚焦显微镜的局限性，双光子显微镜可以如Pan等人的论文，其中所有的三个荧光表达式可以同时读出，允许获得更多的颜色多样性8中所述使用。 Pan等人已经在他们的Zebrabow-M行（最多30种颜色）描述颜色多样性的一个大的光谱。按照本PROT描述的条件ocol，荧光和重新组合的不同强度可以如图2中获得，虽然有些颜色的排列可能已在后成像处理期间丢失。
颜色继承和克隆分析
潘等人描述了在Zebrabow-M中稳定地保持颜色继承从祖先到后代，允许命运映射8。这个协议集中在神经细胞集物流来表征梅克尔软骨的形成。在斑马鱼中使用CreERT2的允许有效他莫昔芬诱导的loxP盒重组和颅面发育过程中，以控制的国家会议谱系标记开始的能力。这种方法可以容易地适用于可视化除了麦克尔软骨所有神经嵴衍生物。此外，使用不同的转基因报告行克隆分析以各种不同的器官系统将突出不同米细胞生长的器官形成期的颂歌。
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Acknowledgments
作者感谢亚历克斯Schier的亲切共享Zebrabow-M转基因株系，杰弗里·伯恩斯的pDEST载体和Renee西尔 - Daigle提供无微不至的关怀鱼设施和线路。
资金来源：
我们感谢来自NIDCR RO3DE024490和施赖纳斯医院慷慨的资金支持儿童（ECL）和博士后培训奖学金从圣地兄弟会儿童医院（LR和YK）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pronase | Roche Life Sciences | 10165921001 | Prepare 500 μl stock aliquots at 50 mg/ml |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0262 | |
| PTU (N-Phenylthiourea) | Sigma-Aldrich | P7619 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 4-HydoxyTamoxifen | Sigma-Aldrich | T176 | |
| 24 x 60 coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| 18 x 18 coverslips | Fisher Scientific | 12-540A | |
| 25 x 25 coverslips | Fisher Scientific | 12-540C | |
| pENTR5'-TOPO TA Cloning Kit | Life technologies | K591-20 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Life Technologies | K2400-20 | |
| pENTR3'-pA | Tol2Kit | 302 | |
| pDEST | Gift from Geoffrey Burns labs | ||
| Bright field microscope | |||
| Fluorescent microscope | |||
| Confocal microscope | |||
| Image processing software |
References
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