Summary
Organizzazione delle cellule di ossa cranio-facciali è stato a lungo ipotizzato ma mai visualizzato direttamente. Marcatura delle cellule Multi-spettrale e in vivo vivo l'imaging consente di visualizzare il comportamento delle cellule dinamica mandibola zebrafish. Qui, abbiamo dettaglio il protocollo di manipolare Zebrabow pesci transgenici e osservare direttamente intercalazione cellulare e cambiamenti morfologici di condrociti nella cartilagine di Meckel.
Abstract
Sviluppo delle strutture cranio-facciali vertebrati richiede coordinazione precisa di migrazione cellulare, la proliferazione, l'adesione e la differenziazione. Patterning della cartilagine del Meckel, un primo arco faringeo derivata, prevede la migrazione di cranico cresta neurale (CNC), le cellule e il partizionamento progressivo, la proliferazione e l'organizzazione dei condrociti differenziati. Diversi studi hanno descritto la migrazione CNC durante inferiore morfogenesi mascella, ma i dettagli di come i condrociti raggiungono organizzazione nella crescita e l'estensione della cartilagine di Meckel rimane poco chiaro. Il SOX10 limitata e indotto chimicamente Cre ricombinasi mediata ricombinazione genera permutazioni di proteine fluorescenti distinti (RFP, YFP e CFP), creando così un sistema di etichettatura multispettrale delle cellule progenitrici e la loro progenie, riflettendo popolazioni clonali distinte. Utilizzando confocale fotografia time-lapse, è possibile osservare i condrociti behavio durante lo sviluppo della cartilagine del pesce zebra di Meckel.
Etichettatura cella multispettrali consente agli scienziati di dimostrare l'estensione dei condrociti della Meckel. Durante la fase di estensione della cartilagine del Meckel, che prefigura la mandibola, condrociti intercalare di effettuare estensione come impilano in una cella singola fila stratificato organizzata. Fallimento di questo processo intercalante organizzato mediare estensione cella fornisce la spiegazione meccanicistica cellulare per mandibola ipoplasia che osserviamo in malformazioni mandibolari.
Introduction
Sviluppo craniofacciale richiede, interazioni cellulari e tissutali complessi molecolari di guidare la proliferazione cellulare, la migrazione e la differenziazione 1,2, 3. Questo processo strettamente regolato e complesso è soggetto alle perturbazioni genetici e ambientali, in modo tale che deformità cranio facciali sono tra le malformazioni congenite più comuni 1-9. Mentre gli interventi chirurgici rimangono il cardine del trattamento per le anomalie cranio-facciali, la comprensione della base di sviluppo è essenziale per innovare terapie future. Pertanto, lo studio della morfogenesi e meccanismi nella convergenza ed estensione e integrazione cella fornisce nuove intuizioni nella formazione dello scheletro craniofacciale 1.
Cranica migrazione cresta neurale e popolano il primo arco faringeo, poi formare coppie di processi mandibolare che si estendono a formare cartilagine di Meckel, che prefigura la mandibola. Morfogenesi of cartilagine di Meckel richiede organizzazione condrociti via proliferazione direzionale, la polarizzazione cellulare e la differenziazione 1,10. Tuttavia, la complessità di organizzazione condrociti nella crescita e l'estensione della cartilagine del Meckel rimane poco chiaro. Capire il comportamento delle cellule dinamico è fondamentale per comprendere malformazioni congenite che colpiscono le dimensioni della mandibola, come ad esempio ipoplasia fenotipi mandibola 11.
Embrioni di zebrafish offrono molti vantaggi evolutivi e genetici per lo studio dettagliato della cartilagine morfogenesi di Meckel. Il loro trattabilità genetica, la trasparenza, ex vivo e rapido sviluppo sono potenti vantaggi prestito bene per l'osservazione del movimento e l'organizzazione delle cellule per l'imaging dal vivo 6. L'utilizzo di strumenti di lineage tracing, come SOX10: Kaede linea transgenica, noi e altri abbiamo delineato le origini della cresta neurale dello scheletro cranio embrionale 1,5. Using il SOX10: ERT2-Cre con la ubi: linea transgenica Zebrabow-M, è ora possibile esplorare i dettagli dei movimenti cellulari durante lo sviluppo craniofacciale. Il Zebrabow-M, è una linea transgenica ingegnerizzata con il promotore ubiquitina guidare l'espressione di diversi fluorofori, ogni fiancheggiato da siti Lox 8. Il Zebrabow-M predefinita fluoroforo è rosso, che esprime RFP. Dopo l'induzione di espressione Cre, il Zebrabow-M costrutto ricombina e le cellule esprimono una combinazione di diversi fluorofori (RFP, CFP e YFP) creando espressione multispettrale nell'embrione. Tutte le cellule figlie che dividono dalle cellule marcate dopo l'evento di ricombinazione sono poi clonale etichettati, in modo che le popolazioni di cellule che derivano da diverse progenitori giustapposte sono clonale etichettati. Con questa marcatura cellulare clonazione, cellule proliferazione e migrazione con risoluzione clonale può essere seguito (figura 1 e 2).
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Protocol
Massachusetts General Hospital Istituzionale Cura e Comitato uso degli animali (IACUC) ha approvato tutte le operazioni in numero di protocollo # 2010N000106. Ciò è in accordo con l'Associazione per la valutazione e l'accreditamento di laboratorio Animal Care International (AAALAC) le linee guida.
1. Reagenti e materiali di preparazione
- Preparare 1 L di 50X medio E3 embrione (Vedi Tabella 1) e preparare 1 l di 1X E3 medio embrione (vedi tabella 2).
- Preparare E3 medio embrione con N-feniltiourea (PTU) con l'aggiunta di 30 mg di PTU a 1 L di 1X E3. Mescolare O / N per garantire che il PTU completa dissoluzione. Conservare a temperatura ambiente.
- Per preparare la soluzione pronasi, diluire 150 ml di pronasi (0,5 mg / ml) con 15 ml di 1X E3. Tale importo è sufficiente per il piatto 1 Petri. Utilizzare immediatamente.
- Preparare la soluzione metilcellulosa.
- Preparare la soluzione E3-tricaine mescolando 75 ml di 0,2% tricaine con 25 mldi 1X E3. Far bollire 3 g di metilcellulosa in 75 ml di soluzione di E3-tricaine.
- Portare il volume finale a 100 ml con la soluzione E3-tricaine. La soluzione metilcellulosa finale è viscoso e opaco con una tinta giallastra. Conservazione: RT al riparo dalla luce.
- Tamoxifene magazzino e la soluzione ad induzione
- Preparare 5 mM tamoxifene soluzione madre sciogliendo 4 hydroxytamoxifen in 100% di etanolo. Conservare magazzino a -80 ° C.
- Preparare la diluizione fresco di tamoxifene alla concentrazione desiderio 1X E3 per ottenere la soluzione di induzione. ATTENZIONE! Si prega di consultare Scheda di Sicurezza prima dell'uso.
- Preparare 1 L di 0,2% tricaine come da Tabella 3.
- Ottenere diapositive confocale. Colla quattro coprioggetti (18 x 18) per formare un blocco poi posto 2 blocchi su un 24 x 60 cm di distanza coprioggetti 2 per consentire il montaggio di un embrione nel mezzo.
2. Preparazione Embrione
- Linee transgeniche.
- SOX10: ERT2-Cre
NOTA: Genera il vettore targeting pDestTol2- SOX10: ERT2-Cre utilizzando metodi di clonazione molecolare standard e commercialmente ottenuto ricombinazione tecnologia di clonazione.- Combina 5 'entrata clone (pENTR5'- sox10p) contenente 7.2Kb del promotore SOX10, un clone di mezzo Gateway (PME-ERT2-Cre), ea 3' entrata clone (pENTR3'-polyA) in una reazione di LR con destinazione lente vettore pDestTol2- α-cristallina: YFP.
- Purificare costrutto pDestTol2- SOX10: ERT2-Cre. Co-iniettare il costrutto purificato (100 ng / mL) con Tol2 trasposasi mRNA (50 ng / ml) in embrioni WT (F0) nella fase una cella.
- Schermo fondatori F0 per adulti per la trasmissione germinale basate su una forte fluorescenza gialla in embrioni di F1.
- SOX10: ERT2-Cre, Zebrabow-M
- Outcross il Zebrabow-MLinea (2.1.1) con la SOX10: linea transgenica ERT2-Cre.
- Selezionare gli embrioni che presentano una forte espressione RFP ubiquitaria e marcatore lente YFP e farle crescere fino adulti.
3. embrioni Collection
- Impostare diverse paia di SOX10: ERT2-Cre, Zebrabow-M zebrafish transgenico 05:00-06:00 il giorno 1.
- Il giorno seguente, tirare i divisori al mattino e raccogliere le uova intorno a mezzogiorno.
- Trasferirli al di Petri e aggiungere 15 ml di soluzione di pronasi dechorionate gli embrioni.
- Incubare gli embrioni per 1-5 minuti fino a circa il 60% degli embrioni sono stati dechorionated. Arrestare la reazione per decantazione la soluzione pronasi e lavare gli embrioni 3-4 volte con fresco medio E3.
- Incubare gli embrioni dechorionated in E3 a RT O / N e far loro sviluppare per raggiungere la fase 10 somiti. Incubare 50-60 embrioni per la frizione per evitare la crescita di sviluppo diverso. 4. Trattamento
- Controllare fase dello sviluppo degli embrioni al microscopio campo di luce per garantire che siano in fase di 10 somiti.
- Utilizzando un microscopio a fluorescenza con una proteina fluorescente (RFP) filtro rosso, isolare gli embrioni di colore rosso vivo.
- Procedere alla induzione della ricombinazione Cre-aggiungendo 10 mM di soluzione hydroxytamoxifen alla capsula di Petri e incubando gli embrioni isolati a 28,5 ° C per 3 ore.
- Decantare la soluzione tamoxifene e lavare gli embrioni più volte con E3.
ATTENZIONE! scartare la soluzione di tamoxifene in un apposito contenitore per rifiuti biologici. - Incubare gli embrioni a 28,5 ° CO / N.
- Quando gli embrioni sono circa il 28-29 fase somiti (circa 24 ore dopo la fecondazione), incubare gli embrioni a 28,5 ° C a E3-PTU soluzione qui di seguito.
NOTA: PTU è qui utilizzato per inibire la formazione di melanofori negli embrioni di sviluppo. Questo trattamento è necessarioevitare la distorsione del segnale di fluorescenza melanofori auto-fluorescente. - Incubare gli embrioni a 28,5 ° C
- Per visualizzare le strutture craniofacciali completamente sviluppati, selezionare gli embrioni a 4 giorni dopo la fecondazione per l'intensità del segnale rosso e Cre marcatore espressione positività (giallo nella retina).
- Anestetizzare gli embrioni con una soluzione di E3 / 0,015% tricaine. L'anestesia è confermata quando non movimenti attivi o attività pinna si osserva quando incitando delicatamente l'embrione.
- Trasferire l'embrione selezionato per l'imaging in una capsula di Petri contenente una goccia di metilcellulosa e imbalsamare delicatamente l'embrione con metilcellulosa.
- Su un confocale vetrino pulito, una goccia di metilcellulosa fresca e montare la embrione all'interno della goccia con una punta microloader. Posizione embrione dorsale prendere attenzione a non toccarel'embrione direttamente.
- Coprire l'embrione montato con 25 x 25 coprioggetto e regolare la posizione dell'embrione eventualmente manipolando il coprioggetto.
- L'embrione è ora pronto per l'immagine.
- Utilizzare l'obiettivo 20x secca obiettivo (apertura numerica 0,75; dimensione pinhole 2.0 micron) per mettere a fuoco l'embrione.
- Premere il tasto L100 sul microscopio e selezionare i canali nel software.
- Selezionare il pulsante di configurazione confocale e fare clic su 'auto' e selezionare i seguenti canali prima di chiudere la finestra: Ch1: CFP, Ch2: GFP, Ch3: RFP o mCherry
- Accendere Ch2 e Ch3 prima di fare clic sul pulsante 'rimuovere blocco'. Fare clic su 'play' per iniziare la scansione.
- Focus sulla struttura di interesse, che è meglio farlo partendo da ½ telaio / sec e alta tensione (HV) 150 e quindi regolando le impostazioni di conseguenza fino a quando la qualità di immagine desiderata è achieved. La richiesta di offerta sarebbe più luminoso di altri colori, quindi regolare l'alta tensione. Cambiare la posizione Z per trovare sia YFP e cellule positive RFP.
- Una volta impostato con le impostazioni, acquisire l'immagine della vostra dell'embrione. Salvare l'immagine nel formato confocale format software di imaging e TIFF per l'elaborazione delle immagini in ogni canale di divisione.
- Quindi, per l'imaging CFP, spegnere Ch2 e Ch3 e accendere Ch1. Re-regolare le impostazioni come nel passaggio 5 senza modificare l'area di messa a fuoco.
NOTA: CFP può essere davvero difficili da individuare a causa di segnale di fondo in blu canale che può essere aggirato regolando la dimensione del foro stenopeico. Una dimensione più grande foro stenopeico permette una migliore rilevazione della fluorescenza, riducendo il rapporto segnale rumore / sfondo. Tuttavia, un più ampio foro stenopeico ridurranno effetto confocale, compromettere la qualità dell'immagine. Pertanto, un'attenta regolazione delle impostazioni è necessario per ottenere la qualità dell'immagine desiderata e intensità. - Catturare l'immagine e salvarla in formato sia (software confocale e TIFF) per l'elaborazione delle immagini. Le immagini possono poi essere elaborati con software comune elaborazione delle immagini per unire i livelli e migliorare le impostazioni di colore, come descritto da Pan e colleghi 8.
Selezione 5. Embrione
6. Montaggio del Embryo in metilcellulosa
7. Analisi per microscopia a fluorescenza
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Representative Results
Visualizzazione cartilagine tradizionale da tutto il monte Alcian macchie blu è stato prezioso per osservare la sviluppo della cartilagine di Meckel e comunemente usato per visualizzare finale cellulare organizzazione 12 (Figura 1A). Per analizzare ulteriormente i condrociti in via di sviluppo straordinario, lignaggio tracciando con SOX10: linee transgeniche Kaede ci ha permesso di studiare la migrazione delle cellule, la convergenza e l'estensione in embrioni vivi 2,12 (Figura 1B). Tuttavia, l'organizzazione dei condrociti nella struttura scheletrica cranio-facciale rimane poco compresa. Con l'imaging dal vivo, la linea transgenica Zebrabow-M è in grado di rivelare il processo di condrociti intercalazione e l'allungamento che media l'estensione e la crescita della cartilagine del Meckel (Figura 1C-G).
In questo protocollo, ubi: Zebrabow-M; SOX10: ERT2-Cre embrioni sono stati trattati con Tamoxifene a 10 somiti e condrociti nella mandibola sono stati visualizzati in diversi momenti durante lo sviluppo (da 3 a 5 dpf dpf). La mascella inferiore è meglio raffigurato ventralmente per permettere una visione chiara della cartilagine di Meckel, senza l'interferenza del piatto e neurocranio etmoide dorsale. I colori stabilmente mantenuti e ereditati consentono un facile lineage tracing e CNCC cellule destino mappatura come indicato dalle frecce nere in Figura 2A-2D. La singola cellula blu sembra migrare e intercalare con le cellule vicine. Poi allunga lungo l'asse anteriore-posteriore per formare una forma regolare condrociti mantenendo così la forma globale della cartilagine di Meckel quanto si estende anteriormente.
Questa tecnica permette lo studio di malformazioni crescita mascella inferiore a livello cellulare e organo in condizioni come sequenza Robin dove micrognazia è una delle caratteristiche importanti descritte. Fallimento nella proliferazione, estensione o intercalazione può essere efficacemente visualizzata in t egli crescente condrociti nel corso del tempo.
| NaCl | 14.61 g |
| KCl | 0,65 g |
| CaCl 2 | 1,83 g |
| MgSO4 | 1.99 g |
| Deionizzata H 2 O | 1.000 ml |
| * Conservazione: RT | |
| ** Aggiungere 1 goccia di blu di metilene come un anti-fungine | |
Tabella 1. 50X E3 embrionale ricetta medio
| 50X E3 | 20 ml |
| Deionizzata H 2 O | 980 ml |
| * Conservazione: RT | |
| 1M Tris-Cl (pH 9,5) | 9 ml |
| tricaine | 2 g |
| Deionizzata H 2 O | Portare a 1 litro |
| * Conservazione: RT | |
Tabella 3. 0.2% Tricaine ricetta
Figura 1. (A) la cartilagine di fluorescenza Meckel di SOX10:.. GFP (B) la cartilagine di Dissected Meckel di un 4 dpf Tubinga embrione colorate con Alcian blu (C) le linee di zebrafish transgeniche ubi: Zebrabow-M croce con SOX10: ERT2-cre. (DG) ubi: Zebrabow-M; SOX10: ERT2-Cre immagine a RFP (D), YFP (E), CFP (F) canali e fondere (G). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. (AD) Timelapse fotografia di Zebrabow-M: SOX10: ERT2-Cre a 3dpf (A), 3.5dpf (B), 4dpf (C) e 5dpf (D). Frecce nere indicano lo stesso singolo clone. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Alcian blue linee transgeniche e fotoconvertibile come descritto sopra complementi tra loro per definire il complesso processo di cartilagine e sviluppo osseo. Tuttavia, la migrazione cellulare dal vivo e organizzazione durante l'organogenesi è stato a lungo ipotizzato e dimostrato indirettamente ma mai visualizzato. Linea transgenica Zebrabow-M accoppiata con una cartilagine specifica Cre permette simultaneamente l'osservazione dal vivo di tutti questi eventi distinti coinvolti nella formazione delle ossa e della cartilagine. Questa tecnica permette lo studio di difetti di crescita mascella inferiore a livello cellulare e organo in condizioni come sequenza Robin dove micrognazia è una delle caratteristiche importanti descritte. Fallimento nella proliferazione, estensione o intercalazione può essere efficacemente visualizzate nelle crescenti condrociti nel corso del tempo.
Ottimizzazione diversità di colore
Ottimizzare i livelli di Cre titolando la concentrazione di 4-hydroxytamoxifen in grado di controllare l 'estensionet di ricombinazione e diversità di colore, senza conseguente letalità embrionale. Estrogeni è essenziale per il normale sviluppo della retina e di conseguenza, più alte dosi di tamoxifene (> 25 micron) può indurre la degenerazione della retina, i tassi di mortalità elevati (~ 60-80%), le malformazioni cranio-facciali e ritardi nello sviluppo. Inoltre, 4 hydroxytamoxifen viene diluito in etanolo, che di per sé è tossico durante lo sviluppo embrionale 13. Pertanto, è importante determinare la migliore concentrazione e la durata dell'esposizione per ottenere un buon tasso di ricombinazione ma limitare la tossicità per gli embrioni.
La concentrazione desiderata di 4-hydroxytamoxifen è stato ottimizzato in questo protocollo. Diverse concentrazioni (5-25 micron), punti di tempo di induzione (10 somiti, 24, 36 e 48 HPF) e durata (30 min a 6 ore) sono stati testati (dati non mostrati). Una bassa dose di tamoxifene (5 micron) ha prodotto una ricombinazione limitata mentre dosi più elevate (da 10 micron a 20 micron) prodotte simricombinazione ile e la diversità di colore. Dosi superiori a 20 micron compromesso il normale sviluppo degli embrioni e quindi non adatto per studiare le malformazioni cranio-facciali. Durate induzione a meno di 2 ore non sono stati sufficienti per creare un adeguato ricombinazione mentre oltre 6 ore di induzione indotto tossicità e anomalie dello sviluppo nei embrioni. Induzione per 3 o 4 ore non differisce nella quantità di ricombinazione e risultati finali.
Induzione dopo il 24 HPF fase embrionale non ha prodotto ricombinazione desiderato e di espressione fluorescente. Pertanto, il miglior compromesso tra sviluppo normale e adatta quantità di colori senza conseguente significativo numero elevato di mortalità embrionale è stato determinato in 3 ore di induzione a 10 somiti con una concentrazione di 10 micron di tamoxifene.
Qualità dell'immagine
Ottenere immagini coerenti e di alta qualità può essere difficile. Se un singolo campo di view non è in grado di visualizzare l'intero cartilagine di Meckel o la struttura craniofacciale di interesse, l'intera struttura può essere mappato prendendo Z-stack. Tuttavia, ottenere Z-stack può essere difficile nella diagnostica per immagini embrione vivo a causa di artefatti da movimento. Pertanto è importante avere un compromesso tra la qualità dell'immagine Z-stack, la quantità di informazioni richieste durante la sessione di imaging e la prevenzione di indotta da laser fotometabolismo durante l'esposizione laser lungo termine.
Un altro limite di questa tecnica è che le proteine fluorescenti non mostrano la stessa stabilità durante l'imaging. Ad esempio RFP è una proteina relativamente stabile, ma può essere YFP instabile. Pertanto, è importante determinare le migliori impostazioni di imaging empiricamente per rilevare il numero massimo di colori in un determinato embrione con intensità adeguata.
Oltre alla stabilità del colore, il microscopio confocale è un'altra limitazione poiché è in grado di leggere il PCPe canali YFP insieme. Ciò è dovuto al fatto che l'emissione da PCP viene rilevata in entrambi i canali 470nm e 535nm. Inoltre, lo spettro di emissione della PCP (470-535nm) e lo spettro di eccitazione di YFP (530nm) si sovrappongono, creando un FRET (fluorescence resonance trasferimento di energia) manufatto. In altre parole, quando viene rilevata la fluorescenza PCP, eccita YFP fluorescenza creando così un segnale non specifico. Per questo motivo, questo protocollo delinea la scansione di tutti i canali di fluorescenza erano separatamente e fondere le singole immagini separatamente utilizzando un comune software di elaborazione delle immagini. Per aggirare le limitazioni del microscopio confocale, un microscopio a due fotoni può essere utilizzato come descritto in carta Pan et al dove tutte tre espressioni di fluorescenza possono essere letti contemporaneamente permettendo un maggiore diversità di colore 8. Pan et al ha descritto un ampio spettro di colore diversità nelle loro linee Zebrabow-M (fino a 30 colori). Seguendo le condizioni descritte in questo protocol, diverse intensità di fluorescenza e ricombinazioni possono essere ottenuti come mostrato in figura 2, anche se alcune permutazioni colore avrebbero potuto essere persi durante l'elaborazione post-imaging.
Eredità di colore e le analisi clonali
Pan et al ha descritto l'eredità colore stabilmente mantenuta in Zebrabow-M da progenitore alla progenie che consente la mappatura destino 8. Questo protocollo focalizzata sulle cellule neurali CNCC per caratterizzare la formazione della cartilagine del Meckel. L'uso di CreERT2 in zebrafish consente un'efficiente tamoxifen indotta cassette loxP ricombinazione e la capacità di controllare l'insorgenza di etichettatura lignaggio CNCC durante lo sviluppo craniofacciale. Questo metodo può essere facilmente adattato per visualizzare tutti i derivati della cresta neurale oltre cartilagine di Meckel. Inoltre, utilizzando una diversa linea di giornalista transgenici per l'analisi clonale in vari sistemi di organi diversi metterà in evidenza diversi modi di crescita delle cellule durante l'organogenesi.
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Acknowledgments
Gli autori ringraziano Alex Schier per gentilmente condividere la linea transgenica Zebrabow-M, Geoffrey Burns per il vettore pDEST e Renee Ethier-Daigle per un'eccellente cura della struttura pesce e le linee.
FINANZIAMENTO:
Siamo grati per il generoso sostegno finanziamento NIDCR RO3DE024490 e Shriners Hospitals for Children (ECL) e borse di formazione post-dottorato da Shriners Hospitals for Children (LR e YK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pronase | Roche Life Sciences | 10165921001 | Prepare 500 μl stock aliquots at 50 mg/ml |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0262 | |
| PTU (N-Phenylthiourea) | Sigma-Aldrich | P7619 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 4-HydoxyTamoxifen | Sigma-Aldrich | T176 | |
| 24 x 60 coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| 18 x 18 coverslips | Fisher Scientific | 12-540A | |
| 25 x 25 coverslips | Fisher Scientific | 12-540C | |
| pENTR5'-TOPO TA Cloning Kit | Life technologies | K591-20 | |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Life Technologies | K2400-20 | |
| pENTR3'-pA | Tol2Kit | 302 | |
| pDEST | Gift from Geoffrey Burns labs | ||
| Bright field microscope | |||
| Fluorescent microscope | |||
| Confocal microscope | |||
| Image processing software |
References
- Dougherty, M., et al. Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis. Development. 140, 76-81 (2013).
- Dougherty, M., et al. Embryonic fate map of first pharyngeal arch structures in the sox10: kaede zebrafish transgenic model. The Journal of craniofacial surgery. 23, 1333-1337 (2012).
- Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133, 1069-1077 (2006).
- Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature reviews Genetics. 12, 167-178 (2011).
- Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50525 (2013).
- McCollum, C. W., Ducharme, N. A., Bondesson, M., Gustafsson, J. A. Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth defects research. Part C, Embryo today : reviews. 93, 67-114 (2011).
- Mossey, P. Dental education and CPD: are you being served. British dental journal. Suppl, 3-4 (2002).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
- Vieira, A. R. Journal of dental research. 87, 119-125 (2008).
- Le Pabic, P., Ng, C., Schilling, T. F. Fat-Dachsous Signaling Coordinates Cartilage Differentiation and Polarity during Craniofacial Development. PLoS genetics. 10, e1004726 (2014).
- Ricks, J. E., Ryder, V. M., Bridgewater, L. C., Schaalje, B., Seegmiller, R. E. Altered mandibular development precedes the time of palate closure in mice homozygous for disproportionate micromelia: an oral clefting model supporting the Pierre-Robin sequence. Teratology. 65, 116-120 (2002).
- Javidan, Y., Schilling, T. F. Development of cartilage and bone. Methods in cell biology. 76, 415-436 (2004).
- McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140, 3254-3265 (2013).
