Introduction
本研究では、ドナー組織と受信者のベッドの上に溶接する近赤外ダイオードレーザーを製造するためのフェムト秒レーザーの使用に基づいて内皮角膜移植への独創的なアプローチを提示します。ドナー角膜の術中測定が正しくドナー組織の大きさを設計する必要があります。内皮角膜内皮疾患1,2の治療に貫通角膜移植を置き換えるために提案されています。この技術の主な利点は、手術、移植片拒絶のリスクが減少し、目の整合性の保存時に角膜移植、減少麻酔を貫通に対して、より高速視力回復です。主なリスク要因は、手術後のドナーレンチキュラー転位です。標準的な技術は、それが気泡の注入によって維持され、その最終的な位置にドナー内皮を挿入することによって実行されます。何の縫合糸があるため、機械的な生物物理学的および次元キャラの使用されていません内皮のcteristics。また、視力の回復が原因で、移植厚い組織に主な理由は、ドナーとレシピエントの組織との間のミスマッチのために制限することができます。
ここでは、これらの主要な問題を克服することができる内皮角膜移植を行う際の手順を紹介します。ドナー内皮はレーザー溶接技術を用いて、その最終位置に確保することができます。これは、制御され、ローカライズされた光熱過程である：それは、ドナー/レシピエントの界面に誘導することができます。これは、過去10年間に研究し、角膜を貫通および内皮3-5の移植で提案されています。近赤外光（波長810 nm）の低電力ダイオードレーザーによって放射され、創傷部位での生体組織に向かって送出されます。角膜は、この波長に対して透明であり、当然ながら、レーザ光を吸収するために、この組織を作るためには、発色団でそれを染色する必要があります。提案された染料は、無菌飽和でありますインドシアニングリーン（ICG）のd水溶液。我々は、角膜組織が 適切にこのICG製剤で染色されている場合、それは810ナノメートル6に吸収ピークを示すことを実証しました。また、ICGは、広く臨床診断で使用され、その安全性は既にヒト被験体において実証されています。染色された角膜は、ダイオードレーザー光のエネルギーを吸収し、得られた主な効果は、溶接部位での制御された温度上昇です。熱的効果は無染色の組織において誘導されていません。温度拡張機能は、冷却時の傷の壁のすぐclosuringで、間質コラーゲンで可逆的熱変性を誘導します。このレーザ溶接効果がまず白内障手術7,8及び角膜移植9,10を貫通するに実証されました。私たちはこの論文で提示されている最適化されたアプローチは、内皮角膜移植に応用するために研究されています。
提案された手術では、単一のレーザスポット（ミリ秒の持続十）AReは、スポット寸法（直径ミクロンの数百）内に局在光熱効果で、その結果、組織に送達：誘導された効果は、ドナー/ホストインターフェイスに閉じ込められたコラーゲンの光凝固からなる、ハードレーザー溶接です。溶接部位でのコラーゲンの変性の結果は、このように標準的な技術（ステッチ）で取得することは不可能である縫合効果を提供する、ドナーとホスト組織との間に強い接着力です。組織は、短いフォローアップ（1ヶ月）に彼の自然な外観を取り戻し、ドナー/宿主組織との間の接着は、治癒期の非常に早い段階で提供溶接することによって改善されます。
厚いドナー組織の移植、すなわち内皮角膜移植の他の主要な危険を回避するために、intrasurgical光コヒーレンストモグラフィー（OCT）を使用する：正しいカットプロファイルで設計することができるように、商用デバイスは、ドナー角膜の厚さを測定しますザfemtosecレーザー。提案された「すべてのレーザー「内皮移植は、このように、この低侵襲手術の臨床結果を改善するように思われます。
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Protocol
研究は、病院の倫理委員会の承認を得て、将来に向かって行きました。インフォームドコンセントを得ました。研究は、ヘルシンキ宣言の教義を遵守していました。
1.ドナー内皮準備
- 室温でローカルアイバンクにより調製したドナー角膜を使用してください。
- 手術室では、その送達コンテナからドナー角膜を引き出し、角膜の輸送に使用されている組織保存と栄養のためのソリューションを離れて設定します。
- 液体が流れ、可変圧力を作成することができますその中に人工前房、上のドナー角膜 - 強膜リムを配置。組織保持ヘッドで角膜をカバーしています。
- 角膜の保存と栄養の液体で満たされたシリンジに3ウェイコネクタを介して人工前房（AAC）を接続します。
- 所定の位置にしっかり保持器を保持するために圧縮リングを使用してください。
- SYRを使用してください（1.7参照）を最適圧力に達するまで組織保存溶液で前房を満たす：房内の圧力を維持するために、AACに接続インゲ。コネクタを閉じます。
- 指で前方のチャンバー内の圧力をテストします。 （範囲60〜70 mmHgの中で）右内の圧力に到達するまでの内部の圧力を変更します。 3ウェイコネクタを閉じます。
- 光コヒーレンスThomography（OCT）とドナー角膜の厚さを測定します。機器の光学系の前に固定された位置に、その角膜と前房を維持した後、全厚-OCT取得を取ります。
ドナー内皮の2フェムト秒レーザーの準備
- フェムト秒レーザ装置の下でドナー角膜の圧平を実行します。後部サイドカット、完全な層状と前サイドカット：3その後のカットで、ドナー組織を切断するfemtosecレーザーを使用してください。 3カットのために、以下のパラメータを設定します。
- フルラメラカット（ラスターパターン、アウトスタート）の場合は、必ず95ミクロンを減算、ドナー角膜（1.8で説明したように10月で測定）の最も薄い点に対応する切り込み深さを設定します。範囲（作業深さに応じて）0.8〜0.9μJにパルスエネルギーを設定します。 8.7ミリメートルに直径を設定します。 2ミクロンの接線スポット分離を設定します。 2μmのラジアルスポット分離を設定します。
- 前方サイドカットについては、前回の完全ラメラカット30μmより深い後部の深さを設定します。 2.10μJにパルスエネルギーを設定します。 8.6ミリメートルの直径。層分離しながら3以上3μm以下にスポット分離、。
- 後部サイドカットのために、後側の前方深さを見つける前方フルラメラカット30μmよりをカット。 900ミクロンの後方の深さを設定します。 2.10μJにパルスエネルギーを設定します。 8.3ミリメートルの直径。 2ミクロンのスポット分離; 2ミクロンの層分離。
3.受信者の目の準備
- 手術のために患者を準備します。刃を予め較正4.0ミリメートルと12時1 4.00ミリメートル角膜切開を行います。 2時位置に配置された1.2ミリメートル予め較正刃と1輪部穿刺を作ります。 30°刺すナイフで6時位置に別の輪部穿刺を行います。
- 2時穿刺を介して、患者の前室に前室のメンテナを挿入します。
- 専用フックで1 8.2ミリメートルの直径の円形descemetorexisを実行します。
- 後部間質からデスメ膜および内皮を除去し、デスメフックで組織を削除します。
4.発色団の準備
- 1.5ミリリットルマイクロチューブにインドシアニングリーン粉末1mgを置きます。
- 滅菌水の9 mgの追加（ICG水溶液はw / wの10％です）。
- 手動金属攪拌機を備えたICG粉末と水を混ぜます。
ドナー内皮の5染色
- インジェクタ表面に接触する内側と、ビジネスサービスインジェクタの広い部分にドナー内皮を置きます。
- スパチュラを使用して、その周辺部に、発色団溶液でドナー内皮の内側を染色します。正しく染色された組織は、均一な緑がかった色をしています。ステップ5.3を起動する前に3分を待ちます。
- ビジネスサービスインジェクタの前方部分にドナー内皮を引き出し、ロールバックされます。
6.ドナー内皮の挿入
- 内皮レンチキュラのための非外傷性の同軸鉗子を使用して、折り畳まれたドナー内皮をつかみ、挿入します。
- 前房のメンテナを削除します。
- ナイロン10.0単一シュティッヒと角膜切開と（ステップ3.1で実行）穿刺を縫合。
- ドナー組織を展開し、受信者の角膜に対してそれを押すように気泡を注入します。気泡必見カンプletely前房の空間を埋めます。
7.レーザー溶接
- フックやヘラで角膜の外側から気泡を移動させると内側から、受信者の角膜の中心にドナーレンチキュラを配置します。
- 開口数（NA）として0.22で、300μmのコア径の滅菌光ファイバを装備した810 nmの発光ダイオードレーザーを使用します。
- 眼球外ファイバ先端を維持し、透明な角膜組織を通して、染色された内皮に向かってレーザ光を実現します。ファイバチップは、非接触構造です。
- 単一スポット発光モード、70〜80ミリ秒のパルス持続時間、パルス当たり35〜40ミリジュール：レーザーは、次の設定を使用します。彼は-Neが上のビームを目指しています。
- ドナー内皮の染色周囲に単一のレーザスポットを提供します。順次スポットを配信：最終的な側面は、ドナーレンチキュラの周辺のスポットの環です。 2 ADJA間の距離セントスポットセンタースポット径のダブルです。
- 0.3％トブラマイシンおよび0.1％デキサメタゾン眼科用懸濁液と一緒に、患者の目にコンタクトレンズを適用します。
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Representative Results
「全てのレーザ」外科手術を低侵襲角膜移植を行うことが提案されています。手順は、（ 図1参照）を実行するのは簡単である：標準内皮移植に関して、角膜の厚さを測定ドナー組織を染色し、レーザー光を送達する唯一のステップが追加されます。達成される利点は、主に、数分の増加の外科時間を補償します。ドナー角膜の厚さとドナーレンチキュラー寸法をカスタマイズするために使用されるフェムト秒レーザーを測定するための手術、OCTの用途は、ドナー/ホストインタフェース接着の向上を可能にする（ 図2参照 ）。そうすることで、外科手術は、単一の患者の必要性および形態学的特徴に従って設計されています。レーザー溶接手順は、ドナー/ホストインターフェイス4の即時閉鎖を提供しています。 Oので、標準的な技術で、それは、どのような方法で、ドナー組織を縫合することは不可能ですその生体力学的特性と位置F。一般的な術後のリスクは、ドナーレンチキュラ転位です。我々の経験では、ドナー内皮転位は15治療を受けた患者のいずれにおいても発生しませんでした。この目標を達成するためには、ドナー/レシピエントインターフェースの外径をカバーするスポットの完全なリングを提供することが重要です。臨床試験の開始時に、我々は、選択された患者では、半円形の溶接軌跡を行いました。角膜赤字とフックスジストロフィーに罹患している、これらの患者の1人で、レンチキュラの部分転位は（ 図3参照 ）が観測された：界面接着は、溶接部位で明らかでした。このような理由から、我々は、最適化された結果と、スポットの完全なリングを提供する手順を実験を行いました。
図1：内皮移植。 >（A）ドナー内皮インジェクタに置かれ、その内面は、インドシアニングリーンの水溶液で染色されます。 （B）内皮は、患者の眼内に挿入し、その最終的なものであり、正しい位置に配置されています。 （CおよびD）レーザー溶接が300μmのコア径の光ファイバを有する単一のスポットを提供する、外部から供給され、ハンドピースに取り付けられました。
図2：術後の結果 、移植眼の（A）スリットランプの画像、手術後1週間。残留ICGが存在しない、ドナー/ホストインターフェイスで光熱損傷は明らかではありません。提案されている「すべてのレーザー」技術とドナー角膜厚測定を行うことなく（B）移植内皮のOCT画像（1手術後の週）。移植内皮は、周辺部で接着不良で、厚さです。提案された「すべてのレーザー」技術と10月のドナー角膜厚測定（手術後1週間）を移植した内皮の（C）10月の画像。厚さレンチキュラは規則的であるとの密着性が良好です。
図3：レーザー溶接効率フックスジストロフィー、手術後1日目の患者で部分的に溶接された内皮細胞のOCT画像。この患者では、内皮細胞の一部のみが受信者の間質に溶接した。転位レンチキュラドナーは手術後の最初の日を観察しました。この画像は、接着効果が唯一の溶接部位（白矢印）で存在したという証拠を示しています。
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Discussion
「すべてのレーザー「内皮移植は低侵襲性角膜移植に独創的なアプローチです。
プロトコル内で説明するすべての手順は、滅菌手袋、ガウン、マスクとキャップの使用などの手術中に一般的な慣行である衛生と消毒の手順を観察し、手術室で行いました。 ICG溶液は、すぐにドナー内皮の染色におけるその適用前に、手術室で調製しました。 ICG粉末、水および染色溶液を調製するために使用されるすべてのツールは、滅菌およびヒト被験体における使用のための商業的に入手可能でした。それは、手術用顕微鏡下で使用することができるように、レーザー光ファイバを滅菌し、これは、特定のハンドピースに装着しました。
提案手法では、術中10月の使用はドナー組織の厚さの正確な測定を提供します。この情報は、DESIするために使用されGNパーソナライズ切断プロファイルは、所望の縮小ドナーレンチキュラー厚で、フェムト秒レーザーを使用することによって、ドナー組織を切断します。レーザ溶接手順は、このように、レシピエントベッドにおけるドナーレンチキュラー位置を安定させる、提供されます。この技術は、ドナー組織の脱臼リスクを軽減することができます：私たちの知る限り、それは、受信者のベッドにドナー内皮を縫合するための唯一の方法です。
この手順の重要な側面は、ICG溶液はすぐに、その使用の前に、手術室で準備しなければならないことです。これはすぐに劣化するICGの光学特性に起因するものです。改善は、すぐに使用できるキットの実現可能性があります。もう一つの重要な側面は、外科医が、ドナーレンチキュラの内側を染色する必要があるため、染色手順は、内皮移植手順の困難を紹介することです。また、レーザー溶接手順は、50ミクロンより薄いドナー組織で行うことができません。 しかし、術後の結果は、他の外科分野での手続きとさらなる活用の普及を奨励しています。それがアクセス不能サイトに配置されている薄い組織を縫合するための方法を提供するように、同じ手順の可能な用途は、微小血管吻合またはレンズカプセルバッグのclosuringです。これらの目標を達成するため、研究活動の次のステップは、さまざまな外科的シーンや目標に適合させることができる組織を溶接するレーザ光のためのビジョンシステムおよび自動配信システムを統合したプラットフォームを設計し、手順の標準化されます組織。
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Acknowledgments
著者らは、部分的に研究活動をサポートし、FP7 BiophotonicPlusプロジェクト「LITE」が付与されたトスカーナ地方（POR CREO FESR 2007-2013、坂東ユニコR＆S 2012）から資金提供を受けFORTEプロジェクト、EU FP7 ECHORD ++実験LA-ROSESに感謝したいですトスカーナ地域による。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Indocyanine Green | Pulsion Medical Systems, Germany | ICG-PULSION (http://www.pulsion.com/international-english/perfusion/icg-pulsion/) | Alternative product: IC-GREEN, Akorn Inc., Lake Forest, Illinois- US (http://www.icginjection.com/) |
| Femtosecond Laser | Abbott Medical Optics, Abbott Laboratories Inc. Abbott Park, Illinois, USA | iFS150 (http://www.abbottmedicaloptics.com/products/refractive/ilasik/ifs-advanced-femtosecond-laser) | |
| Optical Coherence Tomography (OCT) | Carl-Zeiss Meditec, Dublin, California- US (http://www.zeiss.com/meditec/en_de/home.html) | Visante | |
| Diode Laser | E.l.En. Group s.pa., Calenzano-FI, Italy (http://www.elengroup.com/en/divisions/medical) | Mod. WELD 800 | |
| Artificial Anterior Chamber | CORONET, corneal graft products. Network Medical Products Ltd. Coronet House, Kearsley Road, Ripon, North Yorkshire, HG4 2SG, UK | Artificial Anterior Chamber (A.A.C.) with large and small tissue-retaining heads. Code 51-935 (http://www.networkmedical.co.uk/ophthalmic_artificial_ anterior_chamber.html) |
|
| Solution for tissue preservation and nutrition | AL.CHI.MI.A. Srl, Viale Austria 14, 35020 - Ponte S. Nicolò - PD ITALY |
Carry-C media for corneal deturgescence and transport at room temperature - 12 x 50 ml (http://www.alchimiasrl.com/en/organ-culture-at-31°-c-eb/carry-c-eb) |
References
- Tan, D. T., Dart, J. K., Holland, E. J., Kinoshita, S.
- El Husseiny, M. A., Manero, F., Gris, O., Elies, D. Historical Review and Update of Surgical Treatment for Corneal Endothelial Diseases. Ophthalmol Ther. , (2014).
- Rossi, F., et al. Laser tissue welding in ophthalmic surgery. J Biophotonics. 1 (4), 331-342 (2008).
- Pini, R., et al. Combining femtosecond laser ablation and diode laser welding in lamellar and endothelial corneal transplants. Proc. SPIE Ophthalmic Technologies XVIII. 6 (844), 684411-1-684411-7 (2008).
- Rossi, F., et al. All-laser' endothelial corneal transplant in human patients. Proc. SPIE Ophthalmic Technologies XXII. 8209, 82091O-1-82091O-3 (2012).
- Rossi, F., Pini, R., Menabuoni, L. Experimental and model analysis on the temperature dynamics during diode laser welding of the cornea. J Biomed Opt. 12 (1), 014031-1-014031-7 (2007).
- Menabuoni, L., et al. Laser-assisted corneal welding in cataract surgery: retrospective study. J Cataract Refract Surg. 33 (9), 1608-1612 (2007).
- Buzzonetti, L., et al. Laser Welding in Penetrating Keratoplasty and Cataract Surgery in Pediatric Patients. Early Results. J Cataract Refract Surg. 39 (12), 1829-1834 (2013).
- Menabuoni, L., et al. The 'anvil' profile in femtosecond laser-assistedpenetrating keratoplasty. Acta Ophthalmol. 91 (6), e494-e495 (2013).
- Canovetti, A., et al. Laser-assisted penetrating keratoplasty: one year’s results in patients, using a laser-welded “anvil”-profiled graft. Am J Ophthalmol. 158 (4), 664-670 (2014).
