Introduction
Massiver diaphysären Knochendefekte sind eine große Herausforderung für den orthopädischen Chirurgen. Knochenersatz mit autologem Knochentransplantat, als derzeit als Gold-Standard-Behandlung ist nur in begrenztem Umfang und ist im Zusammenhang mit der Ernte-bedingten Morbidität. Aus diesen Gründen Tissue-Engineering Knochenkonstrukte Knochenmark mesenchymale Stammzellen mit osteokonduktiven Gerüste kombiniert wurden als Alternative für autologe in der orthopädischen Chirurgie erforscht.
Bis heute wurden in klinisch relevanten Tiermodellen wie Hunde, Schweine und Schafe 1-3, aber vorläufige Bewertung dieser Konstrukte in orthotoper, segmentale, kritische Größe von Knochendefekten in Kleintiermodellen (wie ausgeführt die meisten Studien Mäuse) kann mehrere Vorteile aufweisen: (i) geringe Kosten, (ii) eine große Anzahl von Tieren betrieben werden kann; (Iii) im Gegensatz zu Großtiermodellen, Homogenität der Mausstämme begrenzt individuellen Schwankungen in ein Gerüst Resorptionnd Knochenbildung und; (Iv) am wichtigsten ist, die Verfügbarkeit von spezifischen Antikörpern und Gen-Zieltiere ermöglichen die Bewertung des biologischen Prozesses in Knochenheilung beteiligt. Last but not least Verwendung von immundefizienten Mäusestämme können auch Studien entweder Transplantate oder Zellen menschlichen Ursprungs ohne nachteilige Immunreaktionen in Mäusen.
Trotz der oben genannten Vorteile, massiven diaphysär Modelle Knochendefekt bei Mäusen sind spärlich. Die meisten dieser Modelle verwenden Knochenfixierung mit einem Marknagel, der die Knochenmarkshöhle füllt ( und somit das Volumen des Materials zu begrenzen getestet werden) und verhindert auch die Reproduzierbarkeit von nicht Rotations- und axiale Stabilität 2,4-7 bereitstellt.
Die Ziele der aktuellen Studie sind (i) eine klinische Knochen nicht gewerkschaftlich Situation nachahmt, eine reproduzierbare, kritische Größe, segmentale, Oberschenkeldefektmodell in Mäusen zu beschreiben, die durch genaue und reproduzierbare Verriegelungsplatte osteosynth stabilisiertesis , die 8-10 eine sehr stabile biomechanische Umgebung zur Verfügung stellt; (Ii) zu veranschaulichen das vorliegende Modell mit zwei potentiellen Knochenersatz und Knochenbildung zu beschreiben Analysen, die verwendet werden könnten.
Protocol
Ethik - Erklärung: Die Mäuse in der vorliegenden Studie verwendet wurden in Übereinstimmung mit den vom Europäischen Komitee für "Pflege und Verwendung von Labortieren" (Richtlinie 2010/63 / EU und des Europäischen Übereinkommens ETS 123) veröffentlichten Richtlinien behandelt. Das experimentelle Protokoll wurde von der Ethikkommission der Medizinischen Fakultät der Lariboisière Saint-Louis (CEEA LV / 2010-01-04) zugelassen.
1. Tiere
- Verwenden Sie athymische Mäuse (10 Wochen alt). Verwenden Sie eine minimale Anzahl von 6 Mäusen mit Defekt leer geblieben als negative Kontrollgruppe.
2. Scaffolds Vorbereitung
- Syngene Transplantate
- Verwenden Sie Knochen Isotransplantat den Defekt zu füllen Kontrollgruppe mit einer minimalen Anzahl von 6 Tieren zur Verfügung zu stellen.
- Erhalten Knochen Isotransplantate durch die Ernte ausgeschnitten Oberschenkelknochen von der Maus gehören, entweder auf "Mängel leer geblieben oder" Defekte gefüllt mit Korallen Gerüst "Gruppen (thdie Verwendung von zusätzlichen Tier vermeidet Knochen Isotransplantat) 11 zu sammeln.
- Spülen Sie die reseziert Knochen mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und halten Sie sie steril feuchte Gazekompresse verwenden.
- Coral Scaffold Vorbereitung
- Verwenden Gerüst , das aus natürlichen Korallen sind: Acropora sp. Koralle Exoskelett Würfel, 3 x 3 x 3 mm als potentielle Knochenersatz mit mindestens 6 Tiere.
- Schnitzen mit der Hand jedes Korallenwürfel an die Form des Zylinders (3.5 Höhe; 2 mm Durchmesser).
- Sterilisieren jedes Gerüsts durch Autoklavieren (121 ° C für 20 min), waschen Sie es mit sterilem PBS und eingetaucht in komplettem Kulturmedium (α-MEM) für 24 Stunden vor der Implantation in Mäuse.
3. Anästhesien und Analgesie
- Bieten präventiven Analgesie, 15 min vor der Anästhesie, durch subkutane Injektion von Buprenorphin (0,1 mg / kg Tierkörpergewicht).
- Bewerben Salbe im TierAugen Trockenheit alle 30 min, während die Tiere in Narkose zu verhindern.
- Legen Sie die Mäuse auf eine wärmende Unterlage Hypothermie zu verhindern.
- Anästhesie und Analgesie während des chirurgischen Eingriffs
- Injizieren intraperitoneal eine Lösung mit Xylazin (8 mg / kg) und Ketamin (100 mg / kg).
- Liefern Sauerstoff über Strömungs-by (50 ml / min).
- Bestätigen ausreichende Narkosetiefe durch die Anwesenheit des guten Muskelrelaxation und Mangel an Tier Reaktion auf einen schädlichen Reiz (z. B. feste toe pinch).
- Injizieren subkutan eine Einzeldosis von Enrofloxacin (0,05 mg / kg) als mikrobielle Prophylaxe.
- Die postoperative Analgesie
- Geben postoperativen Analgesie durch subkutane Injektion von Buprenorphin (0,1 mg / kg) alle 12 Stunden für 3 aufeinander folgenden Tagen.
- Anästhesie während Diagnostic Imaging Verfahren
- Legen Sie die Mäuse in einer anesthetizing-Box, und dann induzieren und Anästhesie halten ca. 4% und 2% Isofluran in Sauerstoff auf.
- Bestätigen Sie eine ausreichende Tiefe der Anästhesie durch gute Tiermuskelentspannung und der Mangel an Bewegung.
- Behebungsbedingungen
- Halten Sie die Mäuse auf Erwärmung Pad bis zur vollständigen Genesung
- Verwenden Sie kein Tier unbeaufsichtigt lassen, bis es genügend Bewusstsein zu halten Brustlage nach der Operation wiedergewonnen hat.
- Nicht ein Tier zurück, die Operation an die Firma von anderen Tieren unterzogen wurde, bis sie vollständig erholt.
- Post-operative Bedingungen
- Moderator die Mäuse separat während der ersten 3 Tage Gastgeber die Mäuse durch 4 in Käfigen nach Tag 3.
- Geben Sie Wasser und angepasst Nahrung ad libitum. Lassen Sie die Mäuse an Gewicht-tragen, ohne Aktivität Beschränkung in der gesamten postoperativen Phase.
4. Chirurgische Verfahren:Femoral segmentalen Defekt Modell 11,12
- Nach der Anästhesie, platzieren Sie jede Maus in ventralen recumbency mit dem linken Hinterbein in der Verlängerung.
- Scrub die Extremität für die aseptische Chirurgie mit 10% Povidonjodid für 5 min und setzen Sie dann ein steriles Tuch unter dem Schenkel einer sterilen Oberfläche zu erzeugen (ein steriles transparenten Tuch wird verwendet, um in der Lage sein Atembewegung während des Verfahrens zu überwachen). Vorsicht ist die Sterilität des Operationsfeldes während des Verfahrens aufrecht zu erhalten genommen.
- Machen Sie eine 15 - 17-mm-Längshautschnitt über die anterolaterale Seite des Oberschenkels, von dem Hüftgelenk Kniegelenk erstreckt.
- Inzision der Fascia lata, spaltete sich die M. vastus lateralis und der Bizeps femoris über die volle Länge des Femurdiaphyse zu belichten. Vorsicht sollte den Ischiasnerv kaudal und die Gelenkkapsel nach distal (Abbildung 1) zu erhalten genommen werden.
- Um Femurdiaphyse expo verbessernsicher, transect die Gesäßmuskel und Bizeps femoris vom 3. Trochanter.
- Durchführen einer kreisförmigen Präparation des Femurs in der Mitte der Diaphyse.
- Tragen Sie eine 6-Loch-Titan Mikro-Verriegelungsplatte (10 mm lang, 1,5 mm breit, Gewicht: 30 mg) an der vorderen Oberschenkelseite.
HINWEIS: Die Löcher der Platte, die mit einem zylindrischen Abschnitt konisch ausgespart sind, aufnehmen Titan selbstschneidend Verriegelungsschrauben (2 mm lang, 0,47 mm Außendurchmesser, Gewicht: 5 mg, mit Unterseite der Kopfschraube mit Gewinde nach innen zu ermöglichen Verriegelungs das Plattenloch), die mit einem Schaft verbunden sind, die aus Drehungen, wenn gesperrt. - Bohren Sie die meisten proximalen Loch der Platte mit einem 0,3 mm Bohrer und entweder spezielle Motorleistung oder nicht-dedizierten Motorleistung bei 2.500 Umdrehungen pro Minute betrieben bei etwa 500 mW 12).
- Legen Sie die erste Schraube mit einem speziellen Schraubenzieher und dann sperren sie (Abbildung 2).
HINWEIS: Da die Ausrichtung von ter Platte durch Anwendung dieser ersten Schraube bestimmt wird, ist es wichtig, die Platte parallel zum Femur zu positionieren, wenn die Schraube einsetzen. - Bohren Sie das distalste Loch der Platte in ähnlicher Weise einsetzen und verriegeln Sie die Schraube (Abbildung 3).
- Legen Sie, aber tun Sie kein Schloss, die beiden anderen äußeren Schrauben.
- Setzen Sie den Draht von 0,22 mm Gigli sah eng um den Knochen in einer medio-lateralen Ausrichtung und dann legen Sie sie in die Schlitze der Spannvorrichtung (Abbildung 4).
- Setzen Sie die spezielle Spannvorrichtung auf dem Schaft der beiden letzten Schrauben und wenden Sie es über der Platte (Abbildung 5).
- Führen Sie eine 3,5-mm lang Mitte diaphysär Oberschenkel Ostektomie mit der Gigli unter Bewässerung sah (unter Verwendung von steriler isotonischer Kochsalzlösung) thermische Nekrose zu verhindern. Haben die Assistentin die Schablone nehmen des Chirurgen. Haben der Chirurg eine konstante stetige Spannung anzuwenden. Achten Sie darauf, nicht die Säge Draht zu verwirren und die mittleren zwei Drittel des Drahtes zu verwenden. vermeiden Sie excess Bewegung , um einen geraden Knochenschnitt (Abbildung 6) zu erhalten.
- Nach dem Ostektomie, entfernen Sie die Gigli sah. Um eine Beschädigung des Weichgewebes zu vermeiden, schneiden Sie den Sägedraht dicht am Knochen auf einer Seite.
- Entfernen Sie die Spannvorrichtung und verriegeln Sie die beiden letzten Schrauben (Abbildung 7).
- Entweder lassen Sie die segmentalen Defekt leer oder chirurgisch füllen es durch Materialien setzen in den Defekt zu prüfen.
- Reichlicher spülen Sie das OP-Feld mit steriler isotonischer Kochsalzlösung.
- Setzen Sie den vastus lateralis Muskel lose über der Platte. Schließen Sie die Blende und die subkutane Ebenen mit einem einfachen fortlaufenden Naht Muster und 5,0 glycomer 631 Naht; schließen Sie die Haut mit einem einfachen Muster unterbrochene Naht mit 4,0 glycomer 631 Naht. Alternativ ist es auch möglich, die Haut mit Hautkleber zu schließen.
5. In vivo - Beurteilungen von Knochenregeneration
- Bei den Mäusen unter Narkose, führen röntgenologischenBeurteilungen in einer Längs Weise sowohl konventionelle Röntgenstrahlen (26 kV, 10 s; 2-facher Vergrößerung; 20 Linien / mm räumliche Auflösung) mit und hochauflösende Mikro-Computertomographie (μCT).
- Für μCT Analyse erwerben Bilder mit einer Auflösung von 36 & mgr; m (50 kV und 478 mA bei 40 ms Belichtungszeit, um eine 0,5 mm Aluminiumfilter, Drehschritt von 0,7 º, und tomographische Drehung von 180 º). Analysieren Sie die Bilder, um die Bewohner Software.
6. Ex - vivo - Assessments von Knochenregeneration
- Zehn Wochen nach der Operation veran Anästhesie Isofluran in Sauerstoff und dann opfern, um die Mäuse durch intraperitoneale Injektion einer Überdosis Barbiturat (1 ml Pentobarbital).
- Excise die Oberschenkelknochen entfernen Muskelgewebe überlagern, und befestigen Sie die Knochenproben in 4% Paraformaldehyd (pH 7,4) für vier Tage.
- Entfernen Sie die Platte und Schrauben aus jedem herausgeschnitten Knochenprobe nach Paraformaldehyd fixation.
- Ex Vivo & mgr; CT - Analyse
- Platzieren Sie jede ausgeschnitten und fixiert Knochen in Polyethylenröhrchen gefüllt mit 75% Alkoholgehalt und analysieren sie mit ex vivo μCT.
- Erwerben Sie Bilder bei 80 kV und 100 & mgr; A (Belichtungszeit von 1.000 ms, Aluminium 0,5 Filter und 4 um Kamerapixelgröße (2.400 x 4.000 mit einer Voxel - Größe von 7 & mgr; m), durchschnittlich vier Frames pro Umdrehung Zuwachs von 0,9 º.
- Rekonstruieren 3-dimensionale Bilder (mittlere Voxelgröße von 13 & mgr; m) mit einem Hamming-gefilterten Rückprojektion mit dem residenten Software.
- Für die quantitative Analyse der Knochenbildung, verwenden Sie residente Software das Volumen von mineralisiertem Gewebe (untere grau Schwelle von 45 Graustufen-Indizes und oberen Grauschwelle von 240 Graustufen Indizes) in einer bestimmten und konsistente Region von Interesse entspricht, den Mangel zu erhalten.
- Durchführung von Analysen in der gleichen Weise für jede Maus mit dem gleichen regIon von Interesse.
- Verwenden Sie die Einweganalyse-Test (Konfidenzintervall - bei 95% und die signifikanten Niveau bei p <0,05), um die Knochen Union Rate und das Volumen von mineralisiertem Gewebe in der Region von Interesse zwischen den Gruppen zu vergleichen.
- Die histologische Analyse
- Integrieren jeder herausgeschnitten und Oberschenkelknochen in Methylmethacrylat Harz fixiert und es für unentkalkte Histologie verarbeiten.
- Schneiden Sie die einzelnen Knochenprobe der Länge nach in dicken Abschnitt (200 & mgr; m) mit einem kreisförmigen wassergekühlten Diamantsäge.
- Grind jeden Knochenprobe Abschnitt bis zu einer Dicke von 100 & mgr; m, polieren und färben es Stevenel blau und van Gieson Pikrofuchsin Flecken verwenden.
HINWEIS: Nach der Färbung erscheinen Zellen in blau, Knochen in rosa und Korallen in braun unter Lichtmikroskopie.
Representative Results
Die vorgenannten chirurgischen Verfahren dauerte 45-60 min. Ostektomie und Osteosynthese waren leicht mit Hilfe eines Chirurgen Assistent ausführen, aber ohne jede Vergrößerungssystem. Keine intraoperative Komplikationen aufgetreten. In einer Vorstudie an 18 Mäusen 11 versehen , der postoperativen Röntgenaufnahmen Hinweise darauf , dass die Knochendefektlänge (3,43 ± 0,12 mm) und die Positionierung der Platte (Abstand zwischen dem Gelenkhöhle zu ersticken und den distalen Teil der Platte = 2,65 ± 0,56 mm) waren reproduzierbar.
Die Anästhesie-bedingte Sterblichkeit lag bei etwa 5%.
Funktionelle Erholung des operierten Gliedmaßen war ausgezeichnet in allen Tieren und Vollbelastung innerhalb eines Tages nach der Operation (Animierte Abbildung 1) beobachtet wurde. Das Gewicht der Osteosynthese (Platte und Schrauben) in der p verwendetresent Studie betrug etwa 0,1% des Mauskörpergewicht. Keine postoperativen Komplikationen (zB Wundinfektion, Implantatversagen, Knochen Migration, etc.) aufgetreten ist . Keine Selbstverletzung oder durch cagemates verursachte Verletzungen aufgetreten.
Wenn die chirurgisch-induzierten Knochendefekte wurden leer gelassen wurde keine signifikante Knochenbildung mit konsistenten Knochen nicht gewerkschaftlich beobachtet. Wenn im Gegensatz dazu wurden die Defekte mit entweder einem Isotransplantat oder einer Koralle Gerüst gefüllt, neu gebildete Knochen von der proximalen Verlängerung und distalen Knochenränder beobachtet wurde. Darüber hinaus erlaubt der Erwägung , dass die Knochenbildung Wiederherstellung der Knochenkontinuität in den meisten Defekte mit Isotransplantate (Abbildung 8) behandelt, wurde es nur innerhalb der Korallengerüst Defekte mit diesem Material gefüllt beobachtet. In der Tat wurde kein Knochen in einem Abstand größer als 1 mm von der knöchernen Kanten beobachtet. Das Fehlen von Knorpel in allen histologischen Analysen Ergebnisse lieferten Hinweise auf dieStabilität der Osteosynthese erreicht (Bild 9, Bild 10).
Röntgenbilder und microCT Beweise Analyse, dass die Knochen Union nicht in jedem Tier des Defekts linken leeren Gruppe traten 10 Wochen nach der Implantation. Das Volumen der mineralisierten durch microCT Analysen beurteilt Gewebe betrug 0,8 ± 0,3 mm 3 und war Vertreter des neu gebildeten Knochen. In den Isotransplantat und Korallen Gerüstgruppen, Knochen Vereinigung wurde jeweils in 4 und 4 Tieren gewonnen. Das Volumen der mineralisierten durch microCT Analysen beurteilt Gewebe betrug 4,4 ± 0,9 mm 3 und 8,9 ± 0,7 mm 3. In diesen Gruppen jedoch, weil sowohl die Isotransplantat und die Korallen Gerüst Mineralien enthalten sind, könnten neue Knochenbildung nicht wirklich unterschieden werden von dem verbleibenden implantierte Material (Isotransplantat oder Korallen Gerüst). Sowohl die Rate der bon union und das Volumen des mineralisierten Gewebe aus der Isotransplantat Gruppe erhalten undaus der Koralle waren Gerüstgruppe (p <0,001) höher als die deutlich von der Defekt-links-leer-Gruppe erhalten.
Abb . 1: Die chirurgische Belichtung für die Erstellung des Femoral segmentalen Defekt A 15 - 17-mm - Längshautschnitt, aus dem Hüftgelenk Kniegelenk erstreckt, wurde über die anterolaterale Seite des Oberschenkels gemacht. Die Fascia lata wurde eingeschnitten; der M. vastus lateralis und der Bizeps femoris über die volle Länge des Femurdiaphyse aussetzen geteilt wurden. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: PlattePositionierung und Proximal Schraubenplatzierung. Die Platte wurde an der vorderen Oberschenkelseite angelegt. Die proximale Loch der Platte wurde gebohrt; die erste Schraube wurde eingeführt und dann gesperrt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3:. Distal - Schraube Platzierung Die distalste Loch der Platte wurde gebohrt und die Schraube wurde eingeführt und verriegelt. (Abdruck mit freundlicher Genehmigung von Tissue Eng Teil C, 2013, 19 (4), 271-280) Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Gigli Saw Positionierung. Die beiden anderen äußeren Schrauben eingesetzt wurden , aber nicht gesperrt und der Draht der 0,22 mm Gigli Sägen wurde eng um den Knochen in einer mediolateraler Orientierung gebunden. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Jig Positioning Die Einspannvorrichtung auf dem Schaft der beiden letzten Schrauben und aufgetragen über der Platte und der Draht der Säge wurde dann in den Schlitzen der Spannvorrichtung eingeschoben eingefügt wurde.. (Abdruck mit freundlicher Genehmigung von Tissue Eng Teil C, 2013, 19 (4), 271-280) Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6:. Ostektomie Ostektomie wurde durchgeführt und die Gigli Säge zurückgezogen. (Abdruck mit freundlicher Genehmigung von Tissue Eng Teil C, 2013, 19 (4), 271-280) Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 7:. Innenverriegelungsschrauben wurde die Spannvorrichtung entfernt und die beiden letzten Schrauben verriegelt. Die segmentale Defekte wurden dann entweder links leer oder mit den getesteten Materialien gefüllt. (Abdruck mit freundlicher Genehmigung von Tissue Eng Teil C, 2013, 19 (4), 271-280) Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
t = "8" src = "/ files / ftp_upload / 52940 / 52940fig8.jpg" />
Abbildung 8: Repräsentative postoperativen Röntgenaufnahmen und Sagittal μCT Rekonstruktion der Oberschenkelknochen von Mäusen Oberschenkelknochen mit dem jeweiligen Defekt entweder links leer (AE), oder mit massiven syngenen Knochentransplantat (FJ) gefüllt oder gefüllt mit massiven Acropora Korallengerüsten (KO. ); unmittelbar nach der Operation (A, F, K), 4 Wochen nach der Operation (B, G, L), 6 Wochen nach der Operation (C, H, M) und 10 Wochen nach der Operation (D, E, I, J, N , O) (Plattenlänge = 10 mm). (Abdruck mit freundlicher Genehmigung von Tissue Eng Teil C, 2013, 19 (4), 271-280) Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
files / ftp_upload / 52940 / 52940fig9.jpg "/>
. Abbildung 9: Repräsentative Röntgenbild, μCT Wiederaufbau und Histologie eines Defekts mit dem Coral Scaffold in der vorliegenden Studie getestet gefüllt , um eine große Menge an neu gebildeten Knochen wurde in-zwischen den umgebenden Knochenkanten und der Korallengerüst beobachtet; Im Gegensatz dazu war wenig Knochen im Inneren des Gerüsts vorhanden. Stains: Stevenel Blau und von Gieson Pikrofuchsin. Unter diesen Bedingungen Knochen, Zellen und Koralle rot gefärbt, blau und braun sind. Maßstabsbalken = 500 & mgr; m. ACS = Acropora Korallen Gerüst; BN = Knochen. (Abdruck mit freundlicher Genehmigung von Tissue Eng Teil C, 2013, 19 (4), 271-280) Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 10: REPRE sentativen Histologie einer Defect leer gelassen (A), gefüllt mit massiven syngenen Knochentransplantat (B), und gefüllt mit Coral Scaffold (C). In den Defekt leer gelassen, Kanten Abrundung des knöchernen mit tiefen Markkanalfüllung und reichlich Fasergewebe in den Defekt beobachtet. In den Defekt mit massiven syngenen Knochentransplantat gefüllt wurde Knochen Kontinuität zwischen dem Transplantat und den umliegenden Knochenränder beobachtet; Knochenmark vorhanden war während des gesamten ursprünglichen Höhle. In der Defekt mit Korallen Gerüst gefüllt, neu gebildete Knochen wurde zwischen den umgebenden Knochenkanten und der Korallengerüst beobachtet, aber wenig Knochen war im Inneren des Gerüsts vorhanden. Stains: Stevenel Blau und von Gieson Pikrofuchsin. Unter diesen Bedingungen Knochen, Zellen und Koralle rot gefärbt, blau und braun sind. Maßstabsbalken = 500 mm. ACS, Korallen Gerüst; BN, Knochen; BM, Knochenmark; FT, Fasergewebe. (Abdruck mit freundlicher Genehmigung von Tissue Eng Teil C, 2013, 19 (4), 271-280)OAD / 52940 / 52940fig10large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Animierte / Video Abbildung 1: Repräsentative Video von der Gangart eines Maus 1 Tag postoperativ. Vollbelastung beobachtet. Bitte hier klicken , um dieses Video anzusehen.
Discussion
Ectopic Implantation von orthopädischen bezogenen Materialien und Geräte in Mäusen wird üblicherweise durchgeführt , die Knochen bilden Kapazitäten verschiedener Gerüste 13,14 zu beurteilen. Wichtige Unterschiede bestehen jedoch zwischen Extrauteringravidität und orthotoper Modelle, einschließlich nativer osteogene Signalfaktoren und parakrine Interaktionen mit Hostknochenbildenden Zellen.
Die vorliegende Studie stellt eine reproduzierbare murine große segmentale, kritische Größe Oberschenkel Defekt (3,5 mm, ca. 20-25% des Oberschenkels Länge). atrophischen Knochen nicht gewerkschaftlich In Anbetracht der Größe eines solchen Mangels und die durch die resultierende Platte Osteosynthese vorgesehen Stabilität ahmt dieses Modell die klinisch festgestellt.
Die postoperativen Zeitraum in der vorliegenden Studie ausgewählt, steht im Einklang mit den zuvor beschriebenen nicht gewerkschaftlich Modelle Mäuse, einen Mangel an ausreichenden Heilung nach 8 bis 12 Wochen 4,9,15,16 zeigt.
Am wichtigsten ist, reproducible und stabile Osteosynthese sowie Stabilität der implantierten Knochenersatzmaterialien wurden ohne eine signifikante Morbidität und Mortalität erhaltenen 1,2 mit der Verwendung von sowohl Verriegelungsplatte und eine Spannvorrichtung , die Ostektomie auszuführen. Dieses Ergebnis steht auch im Gegensatz die Ergebnisse berichtet , wenn entweder ein Fixateur externe oder ein Marknagel 4,5,17-24 verwendet wurden. Für die externen Fixatoren möglichen Nachteile sind: die Variabilität in der Steifigkeit, Infektionen der Stifte flächen, der Stifte Lösen Potentialen Verletzungen durch die Stifte und das Gewicht der Materialien (4 bis 20% des Mauskörpergewicht). Für den Marknagel potentielle Nachteile umfassen: Befüllen der Markhöhle mit dem Nagel und iatrogene Schädigung der Gelenkflächen.
Andere Maus - Segment-kritische Größe femoralis durch Plattenosteosynthese stabilisiert Defekte wurden mit Knochendefekt durch einen Grat erstellt beschrieben und im Bereich von 1,5 bis 2 mm Länge 16,25. in thvorliegende Modell e, die Verwendung einer Schablone und einem Sägedraht erlaubt eine präzise 3,5 mm langen Ostektomie ohne wesentliche Muskeln Trauma.
Doch um erfolgreich zu sein, das Verfahren bei der Durchführung einer auf die Prüfung mehrere wichtige Punkte nehmen sollte: nicht kleine Mäuse (Nude Mäuse entweder mit einem Gewicht unter 25 g oder Alter unter 8 Wochen) sonst die Platte sollte zu lang sein anwenden. kaudal und die Gelenkkapsel nach distal Wenn die Oberschenkelknochen nähert, kümmern uns sowohl den Ischiasnerv zu bewahren. Tragen Sie die Platte auf der Vorderseite des Oberschenkelknochens und da die Ausrichtung der Platte durch Anwendung dieser ersten Schraube bestimmt wird, achten Sie darauf, die Platte parallel zum Femur zu positionieren, wenn diese erste Schraube einsetzen.
Bevor die Ostektomie machen, kümmern sich eine kreisförmige Präparation des Oberschenkels in der Mitte der Diaphyse durchführen Muskeltrauma zu vermeiden. Wenn die Ostektomie durchführen, müssen den Assistenten des Chirurgen halten fest, die Führung und die surgeon muss vorsichtig (i) die Säge nicht Draht zu verwirren, (ii) die mittleren zwei Drittel des Drahtes zu verwenden, während eine konstante stetige Spannung aufbringt und (iii) überschüssige Bewegung zu vermeiden, einen geraden Knochenschnitt zu erhalten.
Die Knochenheilung ist möglich, in das vorliegende Modell ein Knochentransplantat verwendet wird, zur Verfügung gestellt. Darüber hinaus ermöglicht dieses Modell weitere Studien der Mechanismen in Knochenersatzstrategien, wenn entweder menschlichen Ursprungs-Transplantate oder Zellen in einem gut standardisiert, groß, segmental, Knochendefekt eingesetzt werden.
Darüber hinaus Verfeinerung und Reduzierung der Verwendung von Tieren in der Orthopädie bezogenen Forschung in Einklang zu aktuellen Trends erfordern, kann dieses Modell mit in vivo Bildgebungstechniken wie Biolumineszenz in Verbindung verwendet werden. Eine solche nicht-invasive Techniken ermöglichen die Überwachung sowohl implantiert das Überleben von Zellen und Gewebeheilung ohne 26 Tieropfer erfordern.
Wesentliche Einschränkungen des vorliegenden Modells sind sowohl dieTragbedingungen und das Volumen des Knochendefekt erzeugt, da sie mit denen begegnet klinisch beim Menschen nicht vollständig nachahmen. Weitere Einschränkungen des Modells sind (i) die Strahlenundurchlässigkeit der Platte , die Entfernung der Platte erfordern, bevor ex vivo μCT Analyse und kann die Interpretation der Längsröntgenuntersuchung Ergebnisse erschweren und, (ii) die Unfähigkeit , Tellersteifigkeit zu modulieren , die kann sein 27-30 ein wichtiger mechanischer Parameter bei der Knochenbildung.
Man muss auch bedenken, wenn entweder Knochen Isotransplantat oder andere Gerüste mit einer mineralischen Komponente (insbesondere Calciumcarbonat) enthält, dass einige Verzerrungen bei der Segmentierung der Mikro-CT-Analyse eingeführt werden, da neu gebildeten Knochendichte teilweise überlappt mit entweder die Isotransplantat Dichte oder Gerüstdichte. Aus diesem Grund ist der Mikro-CT-Analyse der Knochenvolumen hauptsächlich das Volumen von mineralisiertem Gewebe (neugebildeten Knochen reflektieren erhalten sowieKnochenersatz) 11,26,31.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Die Autoren möchten Rena Bizios für ihre wertvollen Kommentare über das Manuskript zu danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-MEM , Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich, France | M4526 | 500 ml |
| Acropora sp. coral exoskeleton cubes, Biocoral® | Biocoral®, Inoteb, France | 3 x 3 x 3 mm cubes, autoclaving (121 °C for 20 min) sterilization | |
| Buprenorphine, Buprecare® | Axience, Pantin, France | 0.3 mg/ml | |
| Xylazine, Rompun® 2% | Bayer HealthCare, Puteaux, France | 20 mg/ml | |
| Ketamine, Ketamine 500® | Virbac, Carros, France | 50 mg/ml | |
| Isoflurane, Forène® | Abbott, Arcueil, France | ||
| Enrofloxacine, Baytril® 5% | Bayer HealthCare, Puteaux, France | 50 mg/ml | |
| Pentobarbital, Dolethal® | Vétoquinol, Lure, France | 182.2 mg/ml | |
| Anesthetizing box | Ugo Basile, Gemonio, Italy | 7900/10 | |
| Plastic transparent sterile drape, BusterOpCover 30 x 45 cm | Buster, Coveto, Montagu, France | 613867 | |
| 10% povidone iodine, Vétédine® Solution | Vétoquinol, Lure, France | 100 mg/ml | |
| Titanium micro- locking plate, MouseFix Plate XL | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.401.120 | 6 holes, 10 mm long and 1.5 mm wide, autoclaving (121 °C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
| 0.3 mm drill bit, Drill Bit 0.30 mm | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.592.200 | autoclaving (121 °C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
| Engine power | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | AccuPen | Cold sterilzation (ethylene oxide) |
| Screw driver, Handrill | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.390.130 | autoclaving (121 °C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
| Self-tapping locking screws, MouseFix Screw 2 mm | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.401.100 | 2 mm long, 0.47 mm outer diameter and 0.34 mm core diameter, autoclaving (121 °C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
| Jig, MouseFix XL Drill and Saw Guide | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.301.103 | 3.5 mm between the slots, autoclaving (121 °C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
| 0.22-mm Gigli saws (0.22 mm Saws) | RISystem AG, Davos, Switzerland | ||
| 5.0 glycomer 631, Biosyn | Covidien, Vétoquinol, Lure, France | Tapper-cut needle | |
| 4.0 glycomer 631, Biosyn | Covidien, Vétoquinol, Lure, France | Tapper-cut needle | |
| X-ray, MX20 | Faxitron X-ray Corp, Edimex, Le Plessis Grammorie | ||
| In vivo high-resolution microcomputed tomography, Skyscan 1176 | Skyscan, Aartselaar, Belgium | ||
| Ex vivo high-resolution microcomputed tomography, Skyscan 1172 | Skyscan, Aartselaar, Belgium | ||
| Resident software: Nrecon (v1.6.9) / Ctan (v.1.14.4) | Skyscan, Aartselaar, Belgium |
References
- Auer, J. A., et al. Refining animal models in fracture research: seeking consensus in optimising both animal welfare and scientific validity for appropriate biomedical use. BMC Musculoskelet Disord. 8 (72), (2007).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Horner, E. A., et al. Long bone defect models for tissue engineering applications: criteria for choice. Tissue Eng. Part B Rev. 16 (2), 263-271 (2010).
- Srouji, S., et al. A model for tissue engineering applications: femoral critical size defect in immunodeficient mice. Tissue Eng. Part C Methods. 17 (5), 597-606 (2011).
- Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. A model for intramembranous ossification during fracture healing. J Orthop Res. 20 (5), 1091-1098 (2002).
- Harris, J. S., Bemenderfer, T. B., Wessel, A. R., Kacena, M. A. A review of mouse critical size defect models in weight bearing bones. Bone. 55 (1), 241-247 (2013).
- Garcia, P., et al. The LockingMouseNail--a new implant for standardized stable osteosynthesis in mice. J. Surg. Res. 169 (2), 220-226 (2011).
- Garcia, P., Histing, T., Holstein, J. H., Pohlemann, T., Menger, M. D. Femoral non-union models in the mouse. Injury. 41 (10), 1093-1094 (2010).
- Garcia, P., et al. Development of a reliable non-union model in mice. J. Surg. Res. 147 (1), 84-91 (2008).
- Viateau, V., Logeart-Avramoglou, D., Guillemin, G., Petite, H. Animal Models for bone tisue enginering purposes. Sourcebook of models for biomedical research. Conn, P. M. , Humana Press. 725-738 (2008).
- Manassero, M., et al. A novel murine femoral segmental critical-sized defect model stabilized by plate osteosynthesis for bone tissue engineering purposes. Tissue Eng. Part C Methods. 19 (4), 271-280 (2013).
- Matthys, R., Perren, S. M. Internal fixator for use in the mouse. Injury. 40 Suppl 4, S103-S109 (2009).
- Becquart, P., et al. Ischemia is the prime but not the only cause of human multipotent stromal cell death in tissue-engineered constructs in vivo. Tissue Eng. Part A. 18 (19-20), 2084-2094 (2012).
- Deschepper, M., et al. Proangiogenic and prosurvival functions of glucose in human mesenchymal stem cells upon transplantation. Stem Cells. 31 (3), 526-535 (2013).
- Oetgen, M. E., Merrell, G. A., Troiano, N. W., Horowitz, M. C., Kacena, M. A. Development of a femoral non-union model in the mouse. Injury. 39 (10), 1119-1126 (2008).
- Liu, K., et al. A murine femoral segmental defect model for bone tissue engineering using a novel rigid internal fixation system. J Surg Res. 183 (2), 493-502 (2013).
- Zwingenberger, S., et al. Establishment of a femoral critical-size bone defect model in immunodeficient mice. J Surg Res. 181 (1), e7-e14 (2013).
- Cheung, K. M., et al. An externally fixed femoral fracture model for mice. J. Orthop Res. 21 (4), 685-690 (2003).
- Claes, L., et al. Hyperhomocysteinemia is associated with impaired fracture healing in mice. Calcif. Tissue Int. 85 (1), 17-21 (2009).
- Drosse, I., et al. Validation of a femoral critical size defect model for orthotopic evaluation of bone healing: a biomechanical, veterinary and trauma surgical perspective. Tissue Eng. Part C Methods. 14 (1), 79-88 (2008).
- Holstein, J. H., et al. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration. J. Orthop. Trauma. 23 (5 Suppl), S31-S38 (2009).
- Johnson, K. D., August, A., Sciadini, M. F., Smith, C. Evaluation of ground cortical autograft as a bone graft material in a new canine bilateral segmental long bone defect model. J. Orthop. Trauma. 10 (1), 28-36 (1996).
- Meinig, R. P., Buesing, C. M., Helm, J., Gogolewski, S. Regeneration of diaphyseal bone defects using resorbable poly(L/DL-lactide) and poly(D-lactide) membranes in the Yucatan pig model. J. Orthop. Trauma. 11 (8), 551-558 (1997).
- Wu, J. J., Shyr, H. S., Chao, E. Y., Kelly, P. J. Comparison of osteotomy healing under external fixation devices with different stiffness characteristics. J. Bone Joint Surg. Am. 66 (8), 1258-1264 (1984).
- Xing, J., et al. Establishment of a bilateral femoral large segmental bone defect mouse model potentially applicable to basic research in bone tissue engineering. J. Surg. Res. 192 (2), 454-463 (2014).
- Manassero, M., et al. Comparison of Survival and Osteogenic Ability of Human Mesenchymal Stem Cells in Orthotopic and Ectopic Sites in Mice. Tissue Eng. Part A. 22 (5-6), 534-544 (2016).
- Bos, R. R., et al. Degradation of and tissue reaction to biodegradable poly(L-lactide) for use as internal fixation of fractures: a study in rats. Biomaterials. 12 (1), 32-36 (1991).
- Oest, M. E., Dupont, K. M., Kong, H. J., Mooney, D. J., Guldberg, R. E. Quantitative assessment of scaffold and growth factor-mediated repair of critically sized bone defects. J.Orthop. Res. 25 (7), 941-950 (2007).
- Pihlajamaki, H., Bostman, O., Tynninen, O., Laitinen, O. Long-term tissue response to bioabsorbable poly-L-lactide and metallic screws: an experimental study. Bone. 39 (4), 932-937 (2006).
- Rai, B., et al. Combination of platelet-rich plasma with polycaprolactone-tricalcium phosphate scaffolds for segmental bone defect repair. J. Biomed. Mater Res. A. 81 (4), 888-899 (2007).
- Komlev, V. S., et al. Kinetics of in vivo bone deposition by bone marrow stromal cells into porous calcium phosphate scaffolds: an X-ray computed microtomography study. Tissue Eng. 12 (12), 3449-3458 (2006).
