Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Oprichting van een Segmentale Femorale Critical-size Defect Model in Muizen gestabiliseerd door plaatosteosynthese

Published: October 12, 2016 doi: 10.3791/52940
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1,2, 1, 1
1Laboratoire de Bioingénierie et Biomécanique Ostéo-Articulaires (B2OA - UMR CNRS 7052), Université Paris Diderot, 2Ecole Nationale Vétérinaire d’Alfort, Université Paris-Est

Introduction

Massive diafysaire botdefecten zijn een grote uitdaging voor de orthopedisch chirurg. Botvervangingsmateriaal met autoloog bottransplantaat momenteel beschouwd als de gouden standaard behandeling is beperkt voorradig en wordt geassocieerd met oogsten morbiditeit. Daarom hebben tissue engineered bot constructen combineren beenmerg mesenchymale stamcellen met osteoconductief steigers onderzocht als alternatief voor autologe in orthopedische chirurgie.

Tot op heden zijn de meeste onderzoeken uitgevoerd bij klinisch relevante diermodellen zoals honden, varkens en schapen 1-3, maar voorlopige evaluatie van deze constructen in orthotope, segmentale, critical-size botdefecten in kleine diermodellen (zoals muizen) kan verschillende voordelen hebben: (i) lage kosten, (ii) grote aantallen dieren kunnen worden bediend; (Iii) in tegenstelling tot grote diermodellen, homogeniteit van de muizenstammen beperkt individuele variaties in een scaffold resorptiend botvorming en; (Iv) het belangrijkst, beschikbaarheid van specifieke antilichamen en van transgene dieren kan de evaluatie van de biologische processen betrokken bij botgenezing. Tot slot, gebruikt immunodeficiënte muizenstammen wordt tevens onderzoek met behulp van transplantaten of cellen van menselijke oorsprong zonder nadelige immuunreacties in muizen.

Ondanks de bovengenoemde voordelen, massieve diafysaire botdefect modellen in muizen zijn schaars. De meeste van dergelijke modellen gebruiken botfixatie met een intramedullaire pen die het beenmerg holte (dus de hoeveelheid materiaal beperkt te testen) vult en belemmert ook reproduceerbaarheid door niet de rotatie en axiale stabiliteit 2,4-7.

De doelstellingen van deze studie zijn (i) het nabootsen van een klinische been non-union situatie een reproduceerbare, kritische grootte segmentale femorale defect model in muizen, die wordt gestabiliseerd door nauwkeurige en reproduceerbare vergrendeling plaat osteosynth beschrijvenESIS dat een zeer stabiele biomechanische milieu 8-10 biedt; (Ii) de huidige model met twee potentiële botvervangers illustreren en te beschrijven botvorming analyses die kunnen worden gebruikt.

Protocol

Ethiek Verklaring: De muizen gebruikt in de huidige studie werden in overeenstemming met een door de Europese Commissie voor "Zorg en gebruik van proefdieren" (Richtlijn 2010/63 / EU en het Europees Verdrag ETS 123) richtlijnen behandeld. Het experimentele protocol werd goedgekeurd door de ethische commissie van de Faculteit der Geneeskunde Lariboisière Saint-Louis (CEEA LV / 2010-01-04).

1. Dieren

  1. Gebruik athymische muizen (10 weken oud). Gebruik een minimaal aantal van 6 muizen met een defect links leeg als negatieve controlegroep.

2. Steigers Voorbereiding

  1. Syngene Graft Voorbereiding
    1. Gebruik bot isotransplantaat om het defect te vullen controlegroep met een minimum aantal van 6 dieren.
    2. Verkrijgen bot isografts door oogsten uitgesneden dijbeen van de muis die tot een "defecten met lege of" gebreken gevuld met koraal scaffold "groepen (this vermijdt het gebruik van extra dierlijk bot isotransplantaat) 11 te verzamelen.
    3. Spoel de weggesneden bot met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en houd het steriel gebruik van vochtige gaas kompres.
  2. Coral Steiger Voorbereiding
    1. Gebruik steiger die zijn gemaakt van natuurlijke koraal: Acropora sp. koraal exoskelet kubussen, 3 x 3 x 3 mm als potentiële botvervanger met een minimum van 6 dieren.
    2. Snijd met de hand elk koraal kubus aan de vorm van de cilinder (3,5 hoogte, 2 mm diameter).
    3. Steriliseren elke steiger autoclaaf (121 ° C gedurende 20 min), wassen met steriele PBS, en ondergedompeld in compleet cultuurmedium (α-MEM) gedurende 24 uur vóór implantatie in muizen.

3. verdoving Procedures en analgesie

  1. Bieden preventieve analgesie, 15 min voor de anesthesie, door subcutane injectie van buprenorfine (0,1 mg / kg dierlijk lichaamsgewicht).
  2. Toepassen zalf in het dierogen tot droog voorkomen elke 30 min terwijl de dieren onder narcose.
  3. Leg de muizen op een warming pad om onderkoeling te voorkomen.
  4. Anesthesie en analgesie tijdens de chirurgische procedure
    1. Injecteer intraperitoneaal een oplossing met xylazine (8 mg / kg) en ketamine (100 mg / kg).
    2. Lever zuurstof via langsstromende (50 ml / min).
    3. Bevestigen adequate diepte van anesthesie door de aanwezigheid van goede spierontspanning en gebrek aan dierlijke reactie op een schadelijke prikkel (bijv., Firma teen knijpen).
    4. Injecteer subcutaan een dosis enrofloxacine (0,05 mg / kg) microbiële profylaxe.
  5. Postoperatieve analgesie
    1. Verschaffen postoperatieve analgesie door subcutane injectie van buprenorfine (0,1 mg / kg) elke 12 uur gedurende 3 opeenvolgende dagen.
  6. Anesthesie tijdens Diagnostic Imaging Procedures
    1. Plaats de muizen per anesthetizinG-box, en vervolgens induceren en handhaven anesthesie toepassing van ongeveer 4% en 2% isofluraan in zuurstof, resp.
    2. Bevestig voldoende diepte van de anesthesie door een goede dier ontspanning van de spieren en het gebrek aan beweging.
  7. voorwaarden voor herstel
    1. Houd de muizen op de aarde pad tot volledig herstel
    2. Heeft een dier niet onbeheerd achter te laten tot het voldoende bewustzijn heeft herwonnen om borstligging handhaven na de operatie.
    3. Heeft een dier dat een operatie heeft ondergaan om het gezelschap van andere dieren tot volledig hersteld niet meer terug.
  8. Postoperatieve Voorwaarden
    1. Host de muizen afzonderlijk gedurende de eerste 3 dagen gastheer van de muizen door 4 in kooien na dag 3.
    2. Zorg voor water en aangepast voedsel ad libitum. Laat de muizen om gewicht-beer, zonder enige activiteit beperking gedurende de postoperatieve periode.

4. Chirurgische procedure:Femorale segmentaal defect Model 11,12

  1. Na de anesthesie, plaatst elke muis in ventrale decubitus met de linker achterpoot in extensie.
  2. Schrobben de ledematen van aseptische chirurgie met behulp van 10% povidonjood gedurende 5 minuten en plaats een steriele doek onder het ledemaat een steriel oppervlak (een steriele transparante laken wordt gebruikt om te kunnen controleren ademhaling tijdens de procedure) te creëren. Er wordt voor steriliteit van het operatiegebied te houden tijdens de procedure.
  3. Maak een 15-17-mm longitudinale incisie in de huid over de anterolaterale aspect van het dijbeen, dat zich uitstrekt van het heupgewricht naar het kniegewricht.
  4. Insnijden de fascia lata, split de vastus lateralis en de biceps femoris de volledige lengte van de femorale diafyse bloot. Voorzichtigheid moet worden genomen om de heupzenuw caudaal behouden en het gewrichtskapsel distaal (figuur 1).
  5. Om femorale diafyse expo verbeterenzeker, doorsnijden de bilspier en biceps femoris van de 3 e trochanter.
  6. Voer een cirkelvormige ontleding van het femur in het midden van de diafyse.
  7. Breng een 6-holes titanium micro-borgplaat (10 mm lang, 1,5 mm breed, gewicht: 30 mg) op de voorste dijbeen kant.
    OPMERKING: De gaten van de plaat, die kegelvormig verzonken met een cilindrisch gedeelte, geschikt titanium zelftappende borgschroeven (2 mm lang en 0,47 mm buitendiameter, gewicht: 5 mg, met onderoppervlak van de schroef met schroefdraad in- vergrendeling binnen de plaat holes) die zijn aangesloten op een steel, die verdraait uit wanneer vergrendeld.
  8. Boor de meest proximale opening van de plaat met behulp van een 0,3 mm boor en ofwel toegewijde motorvermogen of niet-dedicated motorvermogen bedreven bij 2.500 tpm bij ongeveer 500 mW 12).
  9. Plaats de eerste schroef met behulp van een speciale schroevendraaier en sluit het (figuur 2).
    LET OP: Aangezien de aanpassing van de tHij plaat wordt bepaald door toepassing van dit eerste schroef, is het belangrijk om de plaat parallel te positioneren aan de femur bij het plaatsen van de schroef.
  10. Boor de meest distale opening van de plaat op een soortgelijke manier, plaatst en sluit de schroef (figuur 3).
  11. Invoegen, maar doe geen slot, de andere twee buitenste schroeven.
  12. Daar het draad van 0,22 mm Gigli zag nauw rond het been in een mediolaterale oriëntatie en plaats vervolgens in de sleuven van de mal (figuur 4).
  13. Plaats de speciale mal op de stam van de laatste twee schroeven en toe te passen boven de plaat (figuur 5).
  14. Voer een 3,5-mm lange mid-diafysaire dijbeen ostectomy met behulp van de Gigli zag onder irrigatie (met behulp van steriele isotone zoutoplossing) thermische necrose te voorkomen. Hebben assistent van de chirurg neemt de mal. Hebben de chirurg het toepassen van een constante constante spanning. Wees voorzichtig met de zaag draad niet in de war en de middelste twee-derde van de draad te gebruiken. Vermijd exces beweging om een rechte snede bot te verkrijgen (Figuur 6).
  15. Na de ostectomy, verwijder de Gigli zag. Om schade aan het zachte weefsel te voorkomen, stuurde de zaagkabel nabij het been aan één zijde.
  16. Verwijder de mal en sluit de laatste twee schroeven (Figuur 7).
  17. Ofwel verlaat het segmentaal defect lege of chirurgisch vullen door er materialen worden getest in het defect.
  18. Overvloedig spoelen het operatiegebied met een steriele isotonische zoutoplossing.
  19. Plaats de vastus lateralis spier losjes over de plaat. Sluit de fascia en onderhuids vliegtuigen met behulp van een eenvoudige continue hechting patroon en 5,0 glycomer 631 hechtdraad; sluit de huid met een eenvoudige onderbroken hechtdraad patroon met behulp van 4,0 glycomer 631 hechtdraad. Als alternatief is het ook mogelijk om de huid af met behulp huidlijm.

5. In vivo Assessments van botregeneratie

  1. De muizen onder narcose Voer radiografischebeoordelingen in een longitudinale wijze met zowel conventionele röntgenstraling (26 kV, 10 seconden; 2X vergroting; 20 lijnen / mm ruimtelijke resolutie) en hoge-resolutie-micro computertomografie (μCT).
  2. Voor μCT analyse verkrijgen beelden met een resolutie van 36 urn (50 kV en 478 mA, 40 msec belichtingstijd, met een 0,5 mm aluminium filter, rotatiestap van 0,7 ° en tomografische draaiing van 180 °). Analyseren van de beelden met behulp van de bewoner software.

6. Ex Vivo Assessments van botregeneratie

  1. Tien weken na de operatie, verdoving te induceren middels isofluraan in zuurstof en offer dan de muizen door intraperitoneale injectie van een overdosis barbituraat (1 ml pentobarbital).
  2. Accijnzen de dij botten, verwijder overlappen spierweefsel, en bevestig het bot exemplaren in 4% paraformaldehyde (pH 7,4) voor vier dagen.
  3. Verwijder de plaat en schroeven uit elke weggesneden bot monster na paraformaldehyde fixatie.
  4. Ex Vivo p CT Analyse
    1. Plaats elke uitgesneden en vaste bot in polyethyleen buizen gevuld met 75% alcohol en analyseren met behulp van ex vivo μCT.
    2. Acquire beelden bij 80 kV en 100 uA (belichtingstijd van 1000 msec, aluminium 0,5-filter, en 4 micrometer camera pixelgrootte (2.400 x 4.000 met een voxel grootte van 7 pm), gemiddeld vier frames voor elke rotatie toename van 0,9 º.
    3. Reconstrueren 3-dimensionale beelden (gemiddelde voxel grootte van 13 pm) met een Hamming-gefilterde terugprojectie de aanwezige software.
    4. Voor kwantitatieve analyse van botvorming, residente software om het volume van gemineraliseerd weefsel (onderste grijsdrempelwaarde van 45 grijswaarden indices en bovenste grijsdrempelwaarde van 240 grijstinten indices) in een bepaalde en constante regio van belang correspondeert met het defect te verkrijgen.
    5. Voeren analyses op dezelfde wijze voor elke muis met dezelfde region van belang.
    6. Met de één-factor proef (betrouwbaarheidsinterval - bij 95% en significant niveau p <0,05) ter vergelijking het bot unie snelheid en het volume van gemineraliseerde weefsels in het gebied van belang tussen groepen.
  5. histologische analyse
    1. Embed elk uitgesneden en vaste dijbeen in methyl methacrylaat hars en verwerken voor ontkalkte histologie.
    2. Snijd elke bot specimen in de lengte in dikke gedeelte (200 micrometer) met een cirkelvormige watergekoelde diamantzaag.
    3. Grind elk bot specimen sectie tot een dikte van 100 micrometer, polijsten en vlekken met behulp van Stevenel blauw en van Gieson picrofuchsin vlekken.
      LET OP: Na het kleuren cellen blijken in blauw, bot in roze en koraal in bruin onder lichtmicroscopie.

Representative Results

De bovengenoemde operaties duurde 45-60 minuten. Ostectomy osteosynthese en waren gemakkelijk uit te voeren met behulp van een assistent chirurg, maar zonder gebruik van een systeem vergroot. Geen intraoperative complicaties opgetreden. In een voorstudie op 18 muizen 11, postoperatieve röntgenfoto aangetoond dat het botdefect lengte (3,43 ± 0,12 mm) en de plaat positie (afstand tussen het kniegewricht holte en het distale deel van de plaat = 2,65 ± 0,56 mm) waren reproduceerbaar.

De anesthesie-gerelateerde sterfte was ongeveer 5%.

Functioneel herstel van het geopereerde been was uitstekend in alle dieren en volledige dragende binnen een dag werd waargenomen na de operatie (geanimeerde figuur 1). Het gewicht van de osteosynthese (plaat en schroeven) van de pkwalijk onderzoek was ongeveer 0,1% van het lichaamsgewicht muis. Geen postoperatieve complicaties (bijvoorbeeld, wondinfectie, falen van het implantaat, bottransplantaat migratie, enz.) Heeft plaatsgevonden. Geen zelfverwonding of letsel veroorzaakt door lotgenoten opgetreden.

Wanneer het chirurgisch geïnduceerde botdefecten opengelaten waren, werd geen significante botvorming waargenomen met consistente been non-union. Wanneer daarentegen de gebreken zijn gevuld met een isotransplantaat of koraal scaffold, nieuw gevormde bot uitstrekt vanaf het proximale en distale botranden waargenomen. Bovendien, terwijl botvorming toegestaan herstel van bot continuïteit in de meeste defecten behandeld met isografts (figuur 8), het werd alleen waargenomen in het koraal schavot in defecten gevuld met dit materiaal. In feite werd geen bot waargenomen op een afstand van meer dan 1 mm van de benige rand. Afwezigheid van kraakbeen in alle histologische analyses resultaten aangetoond van destabiliteit van de bereikte osteosynthese (Figuur 9, Figuur 10).

Röntgenfoto's en microCT analyses aangetoond dat bot vakbond deed zich niet voor bij een dier van het defect-left-groep leeg, 10 weken na implantatie. Het volume van gemineraliseerd weefsel bepaald door microCT analyses was 0,8 ± 0,3 mm en 3 is representatief voor de nieuw gevormde bot. In de isotransplantaat en koraal schavot groepen, werd been unie verkregen in 4 en 4 dieren respectievelijk. Het volume van gemineraliseerd weefsel bepaald door microCT analyses was 4,4 ± 0,9 mm en 3 8,9 ± 0,7 mm 3. In deze groepen, echter, omdat zowel de isotransplantaat en het koraal schavot bevat mineralen, vorming van nieuw bot kon niet echt onderscheiden van de overige geïmplanteerde materiaal (isotransplantaat of koraal steiger) zijn. Zowel de snelheid van de bon unie en de omvang van de gemineraliseerde weefsel verkregen uit de isotransplantaat groep envan het koraal schavot groep significant (p <0,001) hoger dan die verkregen uit het defect-linker-groep leeg.

Figuur 1
Figuur 1:. Chirurgische Blootstelling voor de oprichting van de Femorale segmentaal defect A 15-17-mm longitudinale incisie in de huid, die zich uitstrekt van het heupgewricht naar het kniegewricht, werd gemaakt over de anterolaterale aspect van het dijbeen. De fascia lata werd ingesneden; de vastus lateralis spier en de biceps femoris werden gesplitst voor de volledige lengte van de femorale diafyse bloot te leggen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: PlaatPositionering en proximale Screw Plaatsing. De plaat werd aangebracht op de voorste dijbeen kant. De meest proximale gat van de plaat werd geboord; de eerste schroef werd ingebracht en, vervolgens, geblokkeerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3:. Distale Screw Plaatsing De meest distale gat van de plaat werd geboord en de schroef werd geplaatst en zijn vastgeklikt. (Overgenomen met toestemming van Tissue Eng deel C, 2013, 19 (4), 271-280) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4: Gigli Saw Positioning. De andere twee buitenste schroeven werden ingebracht maar niet op slot en de draad van de 0,22 mm Gigli zagen was nauw gebonden rond het bot in een medio-laterale oriëntatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
Figuur 5: Positionering Jig De mal werd geplaatst op de stam van de laatste twee schroeven bovenop de plaat aangebracht en de draad van de zaag werd vervolgens in de sleuven van de mal ingebracht.. (Overgenomen met toestemming van Tissue Eng deel C, 2013, 19 (4), 271-280) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

"Figuur Figuur 6:. Ostectomy Ostectomy werd uitgevoerd en de Gigli zaag werd ingetrokken. (Overgenomen met toestemming van Tissue Eng deel C, 2013, 19 (4), 271-280) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 7
Figuur 7:. Inner schroeven vergrendelen De mal werd verwijderd en de laatste twee schroeven vergrendeld. De segmentale gebreken werden vervolgens naar links leeg of gevuld met de geteste materialen. (Overgenomen met toestemming van Tissue Eng deel C, 2013, 19 (4), 271-280) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

t = "figuur 8" src = "/ files / ftp_upload / 52940 / 52940fig8.jpg" />
Figuur 8: Representatieve Postoperatieve Röntgenfoto's en Sagittal μCT Reconstructie van het dijbeen van Muizen dijbeen met de respectievelijke defect zowel links leeg (AE), of gevuld met enorme syngene bottransplantatie (FJ), of gevuld met enorme Acropora coral steigers (KO. ); direct na de operatie (A, F, K), 4 weken na operatie (B, G, L), 6 weken na de operatie (C, H, M), en 10 weken na operatie (D, E, I, J, N , O) (plaat lengte = 10 mm). (Overgenomen met toestemming van Tissue Eng deel C, 2013, 19 (4), 271-280) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

bestanden / ftp_upload / 52940 / 52940fig9.jpg "/>
. Figuur 9: Vertegenwoordiger Röntgenfoto, μCT Wederopbouw en histologie van een Defect Gevuld met de Coral Steiger Getest in de huidige studie een grote hoeveelheid nieuw gevormde bot werd waargenomen in-tussen de omliggende benige randen en het koraal schavot; daarentegen weinig bot aanwezig in de scaffold. Vlekken: Stevenel Blue en von Gieson picrofuchsin. Onder deze omstandigheden, been, cellen en koraal gekleurd rood, blauw en bruin, respectievelijk. Schaal bar = 500 pm. ACS = Acropora coral schavot; BN = bot. (Overgenomen met toestemming van Tissue Eng deel C, 2013, 19 (4), 271-280) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 10
Figuur 10: vertegen woordiger histologie van een Defect Left Empty (A), Gevuld met Massive syngene Bone Graft (B), en gevuld met Coral Steiger (C). In het gebrek leeg gelaten, afronding van de benige randen met mergholte vulling en een overvloed aan vezelig weefsel diep in het defect waargenomen. In het defect gevuld met massieve syngene bottransplantaat werd bot waargenomen continuïteit tussen het implantaat en het omliggende benige randen; beenmerg was gedurende de oorspronkelijke holte aanwezig. In het defect gevuld met koraal schavot werd nieuw gevormde bot waargenomen tussen de omliggende benige randen en het koraal schavot, maar weinig bot aanwezig in het schavot was. Vlekken: Stevenel Blue en von Gieson picrofuchsin. Onder deze omstandigheden, been, cellen en koraal gekleurd rood, blauw en bruin, respectievelijk. Schaal bar = 500 mm. ACS, koraal schavot; BN, been; BM, beenmerg; FT, vezelig weefsel. (Overgenomen met toestemming van Tissue Eng deel C, 2013, 19 (4), 271-280)oad / 52940 / 52940fig10large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Animated Figuur 11
Animated / video Figuur 1: Vertegenwoordiger video van het looppatroon van een muis op een dag na de operatie. Volle gewicht lager waargenomen. Klik hier om deze video te bekijken.

Discussion

Buitenbaarmoederlijke implantatie van orthopedische-gerelateerde materialen en het apparaat in muizen wordt meestal uitgevoerd om de botvormende capaciteit van de verschillende steigers 13,14 beoordelen. Belangrijke verschillen echter tussen ectopische en orthotope modellen, waaronder native osteogene signalering factoren en paracriene interacties met gastheer-bot-vormende cellen.

De huidige studie stelt een reproduceerbare muizen een groot segmentaal, kritisch-size femorale defect (3,5 mm, ongeveer 20-25% van het dijbeen lengte). Gezien de omvang van een dergelijk gebrek en de stabiliteit die door de resulterende plaatosteosynthese, dit model bootst de klinisch-ondervonden atrofische bone non-union.

De gekozen in de huidige studie post-operatieve periode, is in lijn met de eerder beschreven non-union modellen muizen, met een gebrek aan adequate genezing na 8 tot 12 weken 4,9,15,16.

Belangrijker nog, gekopieerd sccible en stabiele osteosynthese, alsook stabiliteit van de geïmplanteerde botvervangers verkregen zonder aanzienlijke morbiditeit en mortaliteit 1,2 met behulp van zowel borgschijf en een mal om het ostectomy voeren. Dit resultaat contrasteert ook de resultaten gerapporteerd wanneer ofwel een externe fixator of een mergnagel werden gebruikt 4,5,17-24. Voor de externe fixators potentiële nadelen zijn: variatie in stijfheid, infecties van de pennen stukken, los van de pennen, potentialen verwondingen als gevolg van de pennen en het gewicht van de materialen (4 tot 20% van de muis lichaamsgewicht). Voor de intramedullaire pen potentiële nadelen zijn: vullen van het medullaire holte met de nagel en iatrogene schade van de gewrichtsvlakken.

Andere muizen segmentale kritische grootte femorale defecten gestabiliseerd door plaatosteosynthese zijn beschreven botdefect door een braam en tussen 1,5 en 2 mm lengte 16,25. in the huidige model, het gebruik van een mal en een zaagkabel toegestaan ​​precieze 3,5 mm lange ostectomy zonder noemenswaardige spieren trauma.

Echter, om te slagen in het uitvoeren van de procedure een rekening houdend met een aantal belangrijke punten moet nemen: Gebruik geen kleine muizen (Naakt muizen met ofwel een gewicht van minder dan 25 g of leeftijd jonger dan 8 weken) anders moet de plaat te lang. Bij het naderen van het dijbeen, zorg voor zowel de heupzenuw caudaal en het gewrichtskapsel distaal te behouden. Breng de plaat op de voorste zijde van het dijbeen en omdat de aanpassing van de plaat wordt bepaald door toepassing van de eerste schroef, zorg om de plaat parallel te positioneren om het dijbeen bij het plaatsen van de eerste schroef.

Alvorens de ostectomy, zorg om een ​​ronde dissectie van het dijbeen optreden op het midden van de diafyse te gespierde trauma te voorkomen. Bij het uitvoeren van de ostectomy, moet de assistent van de chirurg stevig vast te houden van de gids en de surGeon moet voorzichtig (i) de zaagkabel niet klitten zijn, (ii) de middelste twee derde van de draad gebruiken terwijl het aanbrengen van een constante constante spanning, en (iii) om overtollig beweging voorkomen dat een rechte snede bot te verkrijgen.

Botgenezing kan in het onderhavige model van een bottransplantaat wordt gebruikt. Bovendien is dit model maakt verdere studies van het bij vervanging van bot strategieën mechanismen als humaan-oorsprong transplantaten of cellen worden gebruikt in een goed-gestandaardiseerd, grote segmentaal, botdefect.

Bovendien, overeenkomstig de huidige trends die verfijning en vermindering van het gebruik van dieren in orthopedie gerelateerd onderzoek, kan dit model worden gebruikt in combinatie met in vivo beeldvorming technieken zoals bioluminescentie. Dergelijke niet-invasieve technieken maken het mogelijk het toezicht op beide geïmplanteerd overleving van cellen en weefsel genezing zonder dat het offeren van dieren 26.

Belangrijke beperkingen van het huidige model zijn zowel dedragende geeft de omvang van het botdefect gemaakt omdat zij niet volledig nabootsen klinisch bereikte bij mensen. Andere beperkingen van het model (i) de radio-opaciteit van de plaat, die verwijdering van de plaat nodig voor ex vivo μCT analyse en de vertolking van de longitudinale radiografisch onderzoek resultaten compliceren, (ii) het onvermogen om plaat stijfheid moduleren die kan een belangrijke mechanische parameter in botvorming 27-30 zijn.

Men moet in gedachten houden ook bij gebruik van zowel bot isotransplantaat of andere draagstructuren die een minerale component (in het bijzonder calciumcarbonaat), dat een lichte voorkeur worden in het segmentatieproces van de micro-CT analyse, omdat nieuw gevormde botdichtheid gedeeltelijk overlappen ofwel de isotransplantaat dichtheid of steiger dichtheid. Om deze reden is het bot volume krijgen door de micro-CT analyse vooral de omvang van deze gemineraliseerde weefsel (nieuw gevormde bot plusbotvervanger) 11,26,31.

Disclosures

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

De auteurs willen Rena Bizios bedanken voor haar waardevolle commentaar op het manuscript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-MEM , Minimum Essential Medium Eagle Sigma-Aldrich, France M4526 500 ml 
Acropora sp. coral exoskeleton cubes, Biocoral® Biocoral®, Inoteb, France 3 x 3 x 3 mm cubes, autoclaving (121 °C for 20 min) sterilization
Buprenorphine, Buprecare® Axience, Pantin, France 0.3 mg/ml
Xylazine, Rompun® 2% Bayer HealthCare, Puteaux, France 20 mg/ml
Ketamine, Ketamine 500® Virbac, Carros, France 50 mg/ml
Isoflurane, Forène® Abbott, Arcueil, France
Enrofloxacine, Baytril® 5% Bayer HealthCare, Puteaux, France 50 mg/ml
Pentobarbital, Dolethal® Vétoquinol, Lure, France 182.2 mg/ml
Anesthetizing box Ugo Basile, Gemonio, Italy 7900/10
Plastic transparent sterile drape, BusterOpCover 30 x 45 cm Buster, Coveto, Montagu, France 613867
10% povidone iodine, Vétédine® Solution Vétoquinol, Lure, France 100 mg/ml
Titanium micro- locking plate, MouseFix Plate XL RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ RIS.401.120 6 holes, 10 mm long and 1.5 mm wide, autoclaving (121 °C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide)
0.3 mm drill bit, Drill Bit 0.30 mm RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ RIS.592.200 autoclaving (121 °C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide)
Engine power RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ AccuPen Cold sterilzation (ethylene oxide)
Screw driver, Handrill RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ RIS.390.130 autoclaving (121 °C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide)
Self-tapping locking screws, MouseFix Screw 2 mm RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ RIS.401.100 2 mm long, 0.47 mm outer diameter and 0.34 mm core diameter, autoclaving (121 °C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide)
Jig, MouseFix XL Drill and Saw Guide RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ RIS.301.103 3.5 mm between the slots, autoclaving (121 °C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide)
0.22-mm Gigli saws (0.22 mm Saws) RISystem AG, Davos, Switzerland
5.0 glycomer 631, Biosyn Covidien, Vétoquinol, Lure, France Tapper-cut needle
4.0 glycomer 631, Biosyn Covidien, Vétoquinol, Lure, France Tapper-cut needle
X-ray, MX20 Faxitron X-ray Corp, Edimex, Le Plessis Grammorie
In vivo high-resolution microcomputed tomography, Skyscan 1176 Skyscan, Aartselaar, Belgium
Ex vivo high-resolution microcomputed tomography, Skyscan 1172 Skyscan, Aartselaar, Belgium
Resident software: Nrecon (v1.6.9) / Ctan (v.1.14.4) Skyscan, Aartselaar, Belgium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Auer, J. A., et al. Refining animal models in fracture research: seeking consensus in optimising both animal welfare and scientific validity for appropriate biomedical use. BMC Musculoskelet Disord. 8 (72), (2007).
  2. Histing, T., et al. Small animal bone healing models: standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
  3. Horner, E. A., et al. Long bone defect models for tissue engineering applications: criteria for choice. Tissue Eng. Part B Rev. 16 (2), 263-271 (2010).
  4. Srouji, S., et al. A model for tissue engineering applications: femoral critical size defect in immunodeficient mice. Tissue Eng. Part C Methods. 17 (5), 597-606 (2011).
  5. Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. A model for intramembranous ossification during fracture healing. J Orthop Res. 20 (5), 1091-1098 (2002).
  6. Harris, J. S., Bemenderfer, T. B., Wessel, A. R., Kacena, M. A. A review of mouse critical size defect models in weight bearing bones. Bone. 55 (1), 241-247 (2013).
  7. Garcia, P., et al. The LockingMouseNail--a new implant for standardized stable osteosynthesis in mice. J. Surg. Res. 169 (2), 220-226 (2011).
  8. Garcia, P., Histing, T., Holstein, J. H., Pohlemann, T., Menger, M. D. Femoral non-union models in the mouse. Injury. 41 (10), 1093-1094 (2010).
  9. Garcia, P., et al. Development of a reliable non-union model in mice. J. Surg. Res. 147 (1), 84-91 (2008).
  10. Viateau, V., Logeart-Avramoglou, D., Guillemin, G., Petite, H. Animal Models for bone tisue enginering purposes. Sourcebook of models for biomedical research. Conn, P. M. , Humana Press. 725-738 (2008).
  11. Manassero, M., et al. A novel murine femoral segmental critical-sized defect model stabilized by plate osteosynthesis for bone tissue engineering purposes. Tissue Eng. Part C Methods. 19 (4), 271-280 (2013).
  12. Matthys, R., Perren, S. M. Internal fixator for use in the mouse. Injury. 40 Suppl 4, S103-S109 (2009).
  13. Becquart, P., et al. Ischemia is the prime but not the only cause of human multipotent stromal cell death in tissue-engineered constructs in vivo. Tissue Eng. Part A. 18 (19-20), 2084-2094 (2012).
  14. Deschepper, M., et al. Proangiogenic and prosurvival functions of glucose in human mesenchymal stem cells upon transplantation. Stem Cells. 31 (3), 526-535 (2013).
  15. Oetgen, M. E., Merrell, G. A., Troiano, N. W., Horowitz, M. C., Kacena, M. A. Development of a femoral non-union model in the mouse. Injury. 39 (10), 1119-1126 (2008).
  16. Liu, K., et al. A murine femoral segmental defect model for bone tissue engineering using a novel rigid internal fixation system. J Surg Res. 183 (2), 493-502 (2013).
  17. Zwingenberger, S., et al. Establishment of a femoral critical-size bone defect model in immunodeficient mice. J Surg Res. 181 (1), e7-e14 (2013).
  18. Cheung, K. M., et al. An externally fixed femoral fracture model for mice. J. Orthop Res. 21 (4), 685-690 (2003).
  19. Claes, L., et al. Hyperhomocysteinemia is associated with impaired fracture healing in mice. Calcif. Tissue Int. 85 (1), 17-21 (2009).
  20. Drosse, I., et al. Validation of a femoral critical size defect model for orthotopic evaluation of bone healing: a biomechanical, veterinary and trauma surgical perspective. Tissue Eng. Part C Methods. 14 (1), 79-88 (2008).
  21. Holstein, J. H., et al. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration. J. Orthop. Trauma. 23 (5 Suppl), S31-S38 (2009).
  22. Johnson, K. D., August, A., Sciadini, M. F., Smith, C. Evaluation of ground cortical autograft as a bone graft material in a new canine bilateral segmental long bone defect model. J. Orthop. Trauma. 10 (1), 28-36 (1996).
  23. Meinig, R. P., Buesing, C. M., Helm, J., Gogolewski, S. Regeneration of diaphyseal bone defects using resorbable poly(L/DL-lactide) and poly(D-lactide) membranes in the Yucatan pig model. J. Orthop. Trauma. 11 (8), 551-558 (1997).
  24. Wu, J. J., Shyr, H. S., Chao, E. Y., Kelly, P. J. Comparison of osteotomy healing under external fixation devices with different stiffness characteristics. J. Bone Joint Surg. Am. 66 (8), 1258-1264 (1984).
  25. Xing, J., et al. Establishment of a bilateral femoral large segmental bone defect mouse model potentially applicable to basic research in bone tissue engineering. J. Surg. Res. 192 (2), 454-463 (2014).
  26. Manassero, M., et al. Comparison of Survival and Osteogenic Ability of Human Mesenchymal Stem Cells in Orthotopic and Ectopic Sites in Mice. Tissue Eng. Part A. 22 (5-6), 534-544 (2016).
  27. Bos, R. R., et al. Degradation of and tissue reaction to biodegradable poly(L-lactide) for use as internal fixation of fractures: a study in rats. Biomaterials. 12 (1), 32-36 (1991).
  28. Oest, M. E., Dupont, K. M., Kong, H. J., Mooney, D. J., Guldberg, R. E. Quantitative assessment of scaffold and growth factor-mediated repair of critically sized bone defects. J.Orthop. Res. 25 (7), 941-950 (2007).
  29. Pihlajamaki, H., Bostman, O., Tynninen, O., Laitinen, O. Long-term tissue response to bioabsorbable poly-L-lactide and metallic screws: an experimental study. Bone. 39 (4), 932-937 (2006).
  30. Rai, B., et al. Combination of platelet-rich plasma with polycaprolactone-tricalcium phosphate scaffolds for segmental bone defect repair. J. Biomed. Mater Res. A. 81 (4), 888-899 (2007).
  31. Komlev, V. S., et al. Kinetics of in vivo bone deposition by bone marrow stromal cells into porous calcium phosphate scaffolds: an X-ray computed microtomography study. Tissue Eng. 12 (12), 3449-3458 (2006).

Tags

Geneeskunde been muizen plaatosteosynthese defect been isotransplantaat koraal tissue engineering bot construct diermodellen botvorming botherstel
Oprichting van een Segmentale Femorale Critical-size Defect Model in Muizen gestabiliseerd door plaatosteosynthese
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Manassero, M., Decambron, A., Huu… More

Manassero, M., Decambron, A., Huu Thong, B. T., Viateau, V., Bensidhoum, M., Petite, H. Establishment of a Segmental Femoral Critical-size Defect Model in Mice Stabilized by Plate Osteosynthesis. J. Vis. Exp. (116), e52940, doi:10.3791/52940 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter