Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.
Den Syntetisk Jäst Genome Project (Sc2.0) syftar till att bygga 16 designade jästkromosomer och kombinera dem till en enda jästcell. Hittills en syntetisk kromosom, synIII 1, och en syntetisk kromosom arm, synIXR 2, har byggts och deras in vivo-funktionen valideras i frånvaro av motsvarande vildtyp kromosomer. En viktig utformning inslag i Sc2.0 kromosomer är införandet av PCRTags, som är korta, återkodade sekvenser inom öppna läsramar (ORF) som möjliggör differentiering av syntetiska kromosomer från deras vildtyp motsvarigheter. PCRTag primers glödgning selektivt till antingen syntetiska eller vildtyp kromosomer och närvaro / frånvaro av varje typ av DNA kan testas med hjälp av en enkel PCR-analys. Standarden avläsning av PCRTag analysen är att bedöma närvaro / frånvaro av amplikoner med agarosgelelektrofores. Emellertid, med en genomsnittlig PCRTag amplikon täthet av en per 1,5 kb och agenome storlek ~ 12 Mb, kommer den färdiga Sc2.0 genomet kodar cirka 8.000 PCRTags. För att förbättra genomströmningen, har vi utvecklat en realtids-PCR-analys för PCRTag genotypning som vi kallar qPCRTag analys detektion. Arbetsflödet anger 500 nl reaktioner i en 1.536 flerkällsplatta, vilket tillåter oss att testa upp till 768 PCRTags med både syntetiska och vilda typ primerpar i ett enda experiment.
Sc2.0, eller syntetisk Jäst Genome Project ( www.syntheticyeast.org ), har satt som mål att designa och bygga en helt syntetisk eukaryot genomet. Använda mycket curerad genomsekvensen av Saccharomyces cerevisiae 3 som utgångspunkt, var och en av de sexton linjära kromosomer har fått en ny utformning för att möta en uppsättning designprinciper som anger att upprätthålla cell fitness, förbättra genomet stabilitet och ökad genetisk flexibilitet. Exempelvis är destabiliserande element såsom upprepningar raderas från Sc2.0 kromosomer. Alla förekomster av TAG stoppkodon återkodade för att TAA att "frigöra" en kodon i den slutliga stammen för införandet av en icke-genetiskt kodad aminosyra. Dessutom ett inducerbart evolution system Scramble, vilket möjliggörs genom Cre-lox systemet tillåter oöverträffad förmåga att generera derivat genomen med nya strukturer 4.
<p class="Jove_content"> En annan stor designelement i Sc2.0 genomet är införandet av PCRTags, som fungerar som DNA vattenstämplar för att möjliggöra spårning av syntetiska och vildtyps-DNA. PCRTags är korta, återkodade segment i ORF på syntetiska kromosomer; medan PCRTag sekvenserna skiljer på DNA-nivå mellan syntetiska och vildtyp kromosomer, de kodade proteinerna är identiska i aminosyrasekvens och således förmodligen funktion. PCRTag sekvenser är särskilt konstruerade som primer bindningsställen för att underlätta selektiv amplifiering (Figur 1A). PCRTag konstruktion utförs med användning av "mest olika" algoritm i GeneDesign 5,6, vilket gav omkodas syntetiska sekvenser som normalt ~ 60% annorlunda än de nativa sekvenserna (minst 33%) med smälttemperaturer mellan 58 ° C och 60 ° C och amplikon längder mellan 200-500 baspar 2. Omkodning är inte tillåtet inom de första 100 bp av varje ORF, eftersom dessa regioner är kända förhar speciella önskemål när det gäller kodonanvändning 7. Tillsammans utgör dessa konstruktionsregler gynnar höga prestanda nästan alla PCRTags under en enda uppsättning PCR-betingelser, varvid syntetiska och vilda typ PCRTag primerpar enbart binder och förstärker syntetiska och nativa DNA, respektive (Figur 1B).
Figur 1:. PCRTag schema (A) PCRTags återkodade sekvenser inom öppna läsramar (ORF) av gener på Sc2.0 kromosomer. (B) Syntetisk (SYN) och vildtyp (WT) PCRTag primers enbart binder och förstärker syntetiska och vildtyp genomisk DNA (gDNA), respektive. Visat här är en analys av en ~ 30 kb segment av den vänstra armen av kromosom sex, provning tretton PCRTag primerpar med användning av antingen WT eller halv synVIL2 gDNA som mall. I många fall en enda ORF kodar mer än en PCRTag. Närvaro / frånvaro av PCRTag amplikoner bedöms genom agarosgelelektrofores. PCRTag amplicons varierar i storlek från 200 bp till 500 bp. Ju snabbare migrerande arter i botten av panelerna är primerdimerer.
PCRTag analys har visat sig vara ett viktigt verktyg i monteringen av Sc2.0 kromosomer. I ett typiskt experiment 30-50 kb av syntetisk DNA, som kodar för 20-30 PCRTags, transformeras in i jästceller för att ersätta den motsvarande vildtyp DNA-1,2,8. PCRTag analys används sedan för att identifiera transformanter som kodar syntetiska men inte vildtyp PCRTags spänner detta segment av DNA, eller så kallade "vinnare". Det är vanligtvis nödvändigt att testa flera transformanter att identifiera "vinnare", så genomströmning och kostnaden för PCRTag analys är viktiga faktorer. För närvarande två Sc2.0 kromosomer har avslutats (synIII 1 och synIXR 2), vilket motsvarar mindre än 10% av Sc2.0 genomet, altHough mer än hälften av de återstående kromosomerna genomgår för närvarande syntes och montering. Omfattningen av PCRTag analys som krävs för detta projekt snabbt snabbare än förmågan att köra geler och manuellt poäng närvaron av syntetiska DNA och frånvaro av vildtyp-DNA.
För att förbättra genomströmningen i PCRTag analysen har vi utvecklat ett arbetsflöde genom att använda realtids-PCR för att kringgå användningen av agarosgelelektrofores. Arbetsflödet använder sig av en bulk vätskedoserare att distribuera qPCR mastermix i varje brunn i en 1.536 flerkällsplatta, en nanoskala akustisk vätska dispenser för att överföra mall-DNA och primers, och en 1.536 qPCR termocykler, vilket tillåter oss att miniatyrisera reaktioner till 500 nl och maximera genomströmningen. Vidare analys kan automatiseras. Denna typ av hög genomströmning genotypning protokoll bör vara generaliserbara till alla projekt som kräver analys av många kloner på flera ställen.
Införlivandet av realtids-PCR detektion i PCRTag genotypning analysen är en viktig utveckling för Sc2.0 projektet eftersom det gör betydligt högre genomströmning. Den tidigare arbetsflöde angivna 2,5 pl reaktioner i 384 väl PCR-plattor, 1,5 h termisk cykling körtid, agarosgelelektrofores, och manuell anteckning av gelén.
Arbetsflödet presenteras här, som kallas qPCRTag analys, övervinner flera stora flaskhalsar. Först kondenserar en qPCRTag köra 4 x 384 brunnsplattor till ett enda experiment som kan bearbetas, början till slut (platta inrätta plus kör tid), i ungefär en timme. Det är viktigt att notera att reagenskostnaden per brunn för qPCRTag analys är i nivå med den nedre genomströmning agarosgel baserat tillvägagångssätt. Men genom att kringgå gelelektrofores och manuell anteckning, ger qPCRTag arbetsflöde stora besparingar i tid och arbete, som är de stora fördelarna. Viktigt den qPCRTag arbetsflöde är enhade fullt kompatibla med automatisering.
Ett stort problem med användningen av realtidsdetektering som utsignalen från PCRTag analysen är graden av falska positiva och falska negativa. Eftersom PCRTag primers inte var ursprungligen avsedd för användning i realtid PCR, förväntas det att inte alla primerpar kommer att vara lämpliga för användning med denna utgång. För detta ändamål är det viktigt att validera funktionen och specificiteten hos alla PCRTag primerpar att utesluta delmängd som inte fungerar i den verkliga tidsbaserad analys på framsidan. Exempelvis kromosom 3 PCRTag falska positiva och negativ är för-och-stor reproducerbar i realtid PCR data (fig 2 och 3) och dessa kan uteslutas från vidare analyser. Vidare primerpar är kända för att misslyckas (bedömas genom gelelektrofores och visas i figurerna S6 och S7 av Annaluru et al. 1) kan också uteslutas. Detta kan lätt åstadkommas helt enkelt excluding de felaktiga primerparen när du ställer in den akustiska överföringsprotokollet.
Liksom de flesta high throughput analyser har vi för avsikt att använda i realtid PCRTag upptäckt som en primär screening för att identifiera transformanter som förtjänar längre nedströms validering. Därefter kommer den gyllene standarden för sekundär screening förbli PCRTag analys med gelelektrofores som avläsning. Utöver tillämpningen av PCRTag analys för Sc2.0 kombinerar state-of-the-art nanovätska hanteringssystem med hög genomströmning realtids-PCR-teknik möjliggör snabb och automatiserad analys och har potential att påverka många områden. Till exempel kan detta arbetsflöde tillämpas på hög genomströmning biblioteksscreening, infektionssjukdomar diagnos, microbiome analys och banbrytande genomet redigering strategier försöker ändra flera ställen samtidigt.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes delvis av National Science Foundation Grant MCB-0718846 och Defense Advanced Research Projects Agency kontrakt N66001-12-C-4020 (till JDB). LAM har finansierats av ett postdoktorsstipendium från naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada. Publicering av denna artikel är sponsrad av Roche.
Yeast gDNA prep | |||
yeast gDNA | custom | custom | template for real time PCR |
Acid-washed glass beads (0.5mm) | Sigma | G8772 | yeast cell lysis |
Ultrapure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Invitrogen | 15593-031 | yeast cell lysis |
5432 Mixer | Eppendorf | 5432 | yeast cell lysis |
Microcentrifuge 5417R | Eppendorf | 22621807 | yeast cell lysis |
Qubit 3.0 Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | gDNA quantification |
Qubit dsDNA BR Assay Kit | Life Technologies | Q32850 | gDNA quantification |
Labcyte 384PP plate | Labcyte | P-05525 | gDNA source plate |
DNA Green Mastermix prep and dispensing | |||
LightCycler 1536 DNA Green | Roche | 5573092001 | real time PCR mastermix |
1.5mL Microfuge Tube Holder | ARI | EST BD060314-1 | microfuge tube holder for deck of Cobra |
LightCycler 1536 Multiwell Plate | Roche | 5358639001 | |
Cobra liquid handling system | Art Robbins Instruments | 630-1000-10 | dispense qPCR master mix into 1536 plate |
PCR Plate Spinner | VWR | 89184-608 | cenrifugation of 1536 plate |
Template and primer dispensing | |||
PCRTag primers | IDT | custom | premixed forward and reverse, [50uM] each |
TempPlate pierceable sealing foil, sterile | USA Scientific | 2923-0110 | temporary seal for PCRTag primer plates |
Labcyte LDV 384 well plate | Labcyte | LP-0200 | pre-mixed primer source plate |
Echo 550 Liquid Handler | Labcyte | transfer 2.5nL drops of primer and template DNA into 1536 plate | |
Plateloc Thermal Microplate Sealer | Agilent | G5402-90001 | heat seal for 1536 plate prior to LC1536 run |
Clear Permanent Seal | Agilent | 24212-001 | optically clear heat seal for LC1536 multiwell plate |
PlateLoc Roche/LightCycler 1536 Plate Stage | Agilent | G5402-20008 | can substitute ~2mm thick washers |
Sorvall Legend XTR | Thermo Scientfic | 75-004-521 | centrifuge heat sealed 1536 plate |
Industrial Air Compressor | Jun Air | 1795011 | to run the Echo and Heat Sealer |
Real Time PCR | |||
LightCycler 1536 | Roche | requires 220V outlet |