Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.
合成酵母基因组计划(Sc2.0)旨在打造16设计师酵母染色体和它们合并成一个单一的酵母细胞。迄今一种合成染色体,synIII 1,和一种合成染色体臂,synIXR 2,已构建和其在体内的功能验证在没有相应的野生型染色体。 Sc2.0染色体的一个重要的设计特点是引入PCRTags,这是短,重新编码的开放阅读框(ORFs),使合成的染色体分化从它们的野生型对应于序列。 PCRTag引物退火选择性地合成的或野生型染色体和存在/不存在每种类型的DNA可以使用一个简单的PCR测定法进行测试。所述PCRTag测定的标准的读出是通过琼脂糖凝胶电泳来评估存在/不存在的扩增子。然而,有一个平均PCRTag扩增子密度为每1.5 kb和股份公司的〜12 MB enome大小,完成基因组Sc2.0将编码大约8000 PCRTags。以提高吞吐量,我们开发了用于PCRTag基因分型,我们称之为qPCRTag分析实时PCR为基础的检测分析。工作流指定一个1536多孔板500 NL反应,使我们可以测试多达768 PCRTags用在一个实验中合成的和野生型引物对。
Sc2.0,或合成的酵母基因组计划( www.syntheticyeast.org ),设置了设计和建造的完全合成的真核基因组中的目标。使用酿酒酵母 3为起点的高度策划的基因组序列,每个十六线性染色体已经被重新设计,以满足一组指定维持细胞的健身,提高基因组稳定性,以及增加的遗传灵活性设计原则。例如,去稳定化元素,如重复从Sc2.0染色体中删除。的TAG终止密码子的所有实例都重新编码到TAA到“释放”的密码子在用于引入一个非遗传编码氨基酸的最终劳损。另外一种可诱导系统演变,争夺,由酶Cre-lox系统启用,允许前所未有的能力,以产生衍生的基因组结构新颖4。
<p class=“jove_content”>在Sc2.0基因组的另一个主要设计元素是引入PCRTags,可以作为DNA水印,使合成的和野生型DNA跟踪。 PCRTags是合成染色体的ORF短,重新编码段;而PCRTag序列在合成的和野生型染色体之间的DNA含量差异,所编码的蛋白质在氨基酸序列上,因此,据推测,功能相同。 PCRTag序列被专门设计为引物的结合位点,以促进选择性扩增( 图1A)。 PCRTag设计是使用了“最不同的”算法GeneDesign 5,6-,屈服重新编码是通常〜60%,比之间58℃和60℃,并在天然序列(最小33%)与熔化温度不同合成序列200-500个碱基对2之间扩增长度。重新编码是不是第100bp的各ORF的在允许范围内,因为这些区域是已知的,以具有密码子使用的7方面特殊偏好。总之,这些设计规则偏向几乎所有PCRTags的在一组的PCR条件,由此合成的和野生型PCRTag引物对完全结合并扩增合成的和天然的DNA,分别为( 图1B)的高性能。
图1:PCRTag示意图 (A) 的 PCRTags被重新编码的基因上Sc2.0染色体的开放阅读框(ORF)中的序列。 (B)合成器(SYN)和野生型(WT)PCRTag引物完全结合并扩增合成的和野生型基因组DNA(gDNA的),分别。这里展示的是染色体6的左侧臂的〜30 kb的片段的分析,检测使用任一WT或半synVIL2的gDNA为模板13 PCRTag引物对。在许多情况下,一个单一的ORF编码多于一个PCRTag。 PCRTag扩增子的存在/不存在通过琼脂糖凝胶电泳评估。 PCRTag扩增子的尺寸范围从200基点,至500基点。越快迁移物种在面板的底部是引物二聚体。
PCRTag分析已被证明是在Sc2.0染色体的组装的重要工具。在典型的实验30-50 kb的合成DNA的编码20-30 PCRTags,转化到酵母细胞,以取代相应的野生型DNA 1,2,8。 PCRTag分析然后被用于鉴定编码合成但不与野生型PCRTags跨越DNA的片段的转化体,或所谓的“赢家”。它通常需要测试多个转化体,以确定“获胜者”,所以吞吐量和PCRTag分析的成本是重要的考虑因素。目前2 Sc2.0染色体已经完成(synIII 1和synIXR 2),代表Sc2.0基因组的10%以内,中高音霍夫多于其余染色体的一半目前正在进行合成和装配。 PCRTag分析的规模需要对此项目的快速超越运行凝胶和手动得分合成DNA和不存在下的野生型DNA的存在的能力。
为了提高我们已开发了使用实时PCR来规避利用琼脂糖凝胶电泳的工作流的PCRTag测定的吞吐量。工作流利用一个散装液体分配器的分配的qPCR mastermix成1536多孔板,纳米级的声学液体分配器传送模板DNA和引物的各孔中,一个1536的qPCR热循环仪,使我们能够小型化的反应,以500 NL和最大限度地提高吞吐量。此外分析可以实现自动化。这种类型的高通量基因分型的协议应该推广到任何需要的许多克隆的分析,在多个位点的项目。
结合实时定量PCR检测到PCRTag基因分型检测对于Sc2.0项目的一个重要的发展,因为它使显著更高的吞吐量。先前的工作流中指定2.5μl的反应在384孔PCR板,1.5小时的热循环的运行时间,琼脂糖凝胶电泳和凝胶的人工注释。
这里介绍的工作流程,叫qPCRTag分析,克服几大瓶颈。首先,一个qPCRTag运行凝结4×384孔板成可以处理的,从开始到结束(板设置加上运行时间),在大约一小时一次实验。它是显著地注意到,每孔的试剂成本qPCRTag分析看齐与较低吞吐量琼脂糖凝胶为基础的方法。然而,通过绕过凝胶电泳和人工注释,所述qPCRTag工作流得到大幅节省时间和劳力,这是主要的优点。重要的是qPCRTag工作流程连接自动化tirely兼容。
一个主要关注与使用实时检测作为PCRTag测定的输出是假阳性和假阴性率。由于PCRTag引物原本不是设计用于在实时PCR使用,预期是,并非所有的引物对将适合于与该输出的使用。为此,它验证所有PCRTag引物对的功能和特异性排除不在前面的实时为基础的检测工作的子集是重要的。例如,3号染色体PCRTag误报和漏报是由和-大可再现的实时PCR数据( 图2和3),并且这些可排除进一步的分析。此外,已知的失败的引物对(通过凝胶电泳评估,并在图S6和的Annaluru 等人 1 的S7示出)也可以被排除。这是很容易实现的简单exclu鼎设置故障引物对时了声传输协议。
最喜欢的高通量分析,我们打算使用实时PCRTag检测作为主屏幕,以确定值得进一步验证下游转化。随后,将金标准二次筛选将保持与凝胶电泳作为读PCRTag分析。除了PCRTag分析的应用Sc2.0,结合国家的最先进的纳米液体处理系统具有高吞吐量的实时PCR技术能快速和自动分析和有可能影响到很多领域。例如,该工作流程可以适用于高通量库筛选,感染性疾病的诊断,微生物分析,和尖端的基因组编辑办法试图同时修改多个基因座。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是支持部分美国国家科学基金会资助MCB-0718846和美国国防部高级研究计划局合同N66001-12-C-4020(加多宝)。 LAM资金由来自加拿大自然科学和工程研究理事会博士后奖学金。发布这篇文章是由罗氏公司赞助。
Yeast gDNA prep | |||
yeast gDNA | custom | custom | template for real time PCR |
Acid-washed glass beads (0.5mm) | Sigma | G8772 | yeast cell lysis |
Ultrapure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Invitrogen | 15593-031 | yeast cell lysis |
5432 Mixer | Eppendorf | 5432 | yeast cell lysis |
Microcentrifuge 5417R | Eppendorf | 22621807 | yeast cell lysis |
Qubit 3.0 Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | gDNA quantification |
Qubit dsDNA BR Assay Kit | Life Technologies | Q32850 | gDNA quantification |
Labcyte 384PP plate | Labcyte | P-05525 | gDNA source plate |
DNA Green Mastermix prep and dispensing | |||
LightCycler 1536 DNA Green | Roche | 5573092001 | real time PCR mastermix |
1.5mL Microfuge Tube Holder | ARI | EST BD060314-1 | microfuge tube holder for deck of Cobra |
LightCycler 1536 Multiwell Plate | Roche | 5358639001 | |
Cobra liquid handling system | Art Robbins Instruments | 630-1000-10 | dispense qPCR master mix into 1536 plate |
PCR Plate Spinner | VWR | 89184-608 | cenrifugation of 1536 plate |
Template and primer dispensing | |||
PCRTag primers | IDT | custom | premixed forward and reverse, [50uM] each |
TempPlate pierceable sealing foil, sterile | USA Scientific | 2923-0110 | temporary seal for PCRTag primer plates |
Labcyte LDV 384 well plate | Labcyte | LP-0200 | pre-mixed primer source plate |
Echo 550 Liquid Handler | Labcyte | transfer 2.5nL drops of primer and template DNA into 1536 plate | |
Plateloc Thermal Microplate Sealer | Agilent | G5402-90001 | heat seal for 1536 plate prior to LC1536 run |
Clear Permanent Seal | Agilent | 24212-001 | optically clear heat seal for LC1536 multiwell plate |
PlateLoc Roche/LightCycler 1536 Plate Stage | Agilent | G5402-20008 | can substitute ~2mm thick washers |
Sorvall Legend XTR | Thermo Scientfic | 75-004-521 | centrifuge heat sealed 1536 plate |
Industrial Air Compressor | Jun Air | 1795011 | to run the Echo and Heat Sealer |
Real Time PCR | |||
LightCycler 1536 | Roche | requires 220V outlet |