Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

qPCRTag Analysis - En høy gjennomstrømning, Real Time PCR-analyse for Sc2.0 Genotyping

doi: 10.3791/52941 Published: May 25, 2015

Abstract

The Synthetic Gjær Genome Project (Sc2.0) har som mål å bygge 16 designer gjær kromosomer og kombinere dem i en enkelt gjærcelle. Hittil en syntetisk kromosom, synIII 1, og en syntetisk kromosom arm, synIXR 2, er blitt konstruert og deres in vivo-funksjonen validert i fravær av tilsvarende villtype-kromosomer. Et viktig konstruksjonstrekk ved Sc2.0 kromosomer er innføring av PCRTags, som er korte, re-kodede sekvenser innenfor åpne leserammer (ORF) som muliggjør differensiering av syntetiske kromosomer fra sin vill-type-motstykker. PCRTag primere gløding selektivt til enten syntetisk eller vill-type-kromosomer og nærvær / fravær av hver type DNA kan testes ved hjelp av et enkelt PCR-analyse. Standarden avlesning av PCRTag analysen er å vurdere tilstedeværelse / fravær av amplikonene ved agarosegel-elektroforese. Men med en gjennomsnittlig PCRTag amplicon tetthet på én per 1,5 kb og agenome størrelse på ~ 12 Mb, vil den ferdige Sc2.0 genomet koder omtrent 8000 PCRTags. For å bedre gjennomstrømming, har vi utviklet en real time PCR-basert gjenkjenning analysen for PCRTag genotyping som vi kaller qPCRTag analyse. Arbeidsflyten spesifiserer 500 nl reaksjoner i en 1536 multiwell plate, slik at vi kan teste opptil 768 PCRTags med både syntetiske og villtypen primerparene i et enkelt eksperiment.

Introduction

Sc2.0, eller syntetisk Gjær Genome Project ( www.syntheticyeast.org ), har satt seg som mål å designe og bygge en helt syntetisk eukaryote genom. Bruke svært kuratert genomsekvens av Saccharomyces cerevisiae 3 som utgangspunkt, hver av de seksten lineære kromosomer har blitt re-designet for å møte et sett av design prinsipper som angir opprettholde celle fitness, forbedre genom stabilitet, og økende genetisk fleksibilitet. For eksempel er destabiliserende elementer som gjentar slettet fra Sc2.0 kromosomer. Alle tilfeller tag stoppkodoner er re-kodet til TAA å "frigjøre" et kodon i den endelige belastning for innføring av et ikke-genetisk kodet aminosyre. I tillegg en induserbar evolusjon system, Scramble, aktivert av Cre-lox system, tillater enestående evne til å generere avledede genomer med nye strukturer 4.

(figur 1A). PCRTag utforming blir utført ved hjelp av 'de forskjellig' algoritmen i GeneDesign 5,6, hvilket ga omkodet syntetiske sekvenser som er typisk ~ 60% forskjellig fra de native sekvenser (minimum 33%) med smeltetemperaturer mellom 58 ° C og 60 ° C og amplicon lengder mellom 200-500 basepar to. Opptaket er ikke tillatt i de første 100 bp av hvert ORF, da disse regionene er kjenthar spesielle preferanser i forhold til kodonbruk 7. Sammen utgjør disse designregler favorisere høye ytelsen til nesten alle PCRTags under et enkelt sett med PCR-forhold der syntetiske og villtypen PCRTag primerparene utelukkende binder og forsterke syntetisk og naturlig DNA, henholdsvis (figur 1B).

Figur 1
Figur 1:. PCRTag skjematisk (A) PCRTags er re-kodet sekvenser innenfor åpne leserammer (ORF) av gener på Sc2.0 kromosomer. (B) Syntetisk (SYN) og villtype (WT) PCRTag primere utelukkende å binde og forsterke syntetiske og villtype genomisk DNA (gDNA), henholdsvis. Vist her er en analyse av et ~ 30 kb segment av den venstre arm av kromosom seks, testing av tretten PCRTag primerparene enten ved hjelp av WT eller semi-synVIL2 gDNA som templat. I mange tilfeller er en enkelt ORF koder for mer enn en PCRTag. Nærvær / fravær av PCRTag amplikonene bedømmes via agarosegel-elektroforese. PCRTag amplikonene varierer i størrelse fra 200 bp til 500 bp. Jo raskere trekkende arter på bunnen av panelene er primer dimer.

PCRTag analyser har vist seg å være et viktig verktøy i monteringen av Sc2.0 kromosomer. I et typisk forsøk 30-50 kb av syntetisk DNA som koder for 20-30 PCRTags, blir transformert inn i gjærceller for å erstatte det tilsvarende villtype-DNA 1,2,8. PCRTag analyse blir så brukt til å identifisere transformanter som koder syntetiske men ikke villtype PCRTags spenner over det segmentet av DNA, eller såkalt vinnere. Det er vanligvis nødvendig å teste flere trans å identifisere vinnere, så gjennomstrømning og kostnadene ved PCRTag analyse er viktige hensyn. For tiden to Sc2.0 kromosomer har blitt fullført (synIII 1 og synIXR 2), som representerer mindre enn 10% av den Sc2.0 genomet, altHough mer enn halvparten av de resterende kromosomene er for tiden under syntese og montering. Omfanget av PCRTag analyse er nødvendig for dette prosjektet er fort overgår evnen til å kjøre gels og manuelt scorer tilstedeværelsen av syntetisk DNA og fravær av villtype DNA.

For å forbedre gjennomstrømningen av PCRTag analysen har vi utviklet en arbeidsflyt ved hjelp av sanntids-PCR for å omgå ved bruk av agarosegel-elektroforese. Arbeidsflyten gjør bruk av en bulk flytende dispenser for å fordele qPCR Mastermix i hver brønn av en 1536 multiwell plate, en nanoskala akustisk flytende dispenser for å overføre malen DNA og primere, og en 1536 qPCR termosykler, tillater oss å miniatyrisere reaksjonene til 500 nl og maksimere gjennomstrømming. Videre analyse kan automatiseres. Denne type høy gjennomstrømning genotyping protokollen bør kunne generaliseres til ethvert prosjekt som krever analyse av mange kloner på flere loci.

Protocol

1. Forbered Gjær Genomisk DNA (gDNA)

  1. Forbered et lager av gjær Lysis Buffer 9 som inneholder 50 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 1% SDS (w / v), 2% Triton X-100 (v / v), 1 mM EDTA pH 8,0.
  2. Som utgangsmateriale, bruk ~ 2 x 10 6 celler, som vanligvis tilsvarer ~ 100 mL mettet kultur for lab stammer av BY4741 10 bakgrunnen. Dyrkede celler bør samles ved sentrifugering ved 1000 x g i 3 minutter ved romtemperatur i et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Aspirer supernatanten.
  3. Tilsett 200 ul av gjær Lysis Buffer og cellepelleten suspenderes ved pipettering.
  4. Legg ~ 300 ul syrevaskede glassperler, slik at nivået av perlene er ca 1 mm under nivået for celleoppslemming.
  5. I et avtrekksskap Tilsett 200 ul av fenol / kloroform / isoamylalkohol (25: 24: 1). Kork på mikrosentrifugerør og sikre at ingen kuler blir sittende fast mellom hetten og røret, da dette vil føre til lekkasje ved risting(Trinn 1.6). Invertere tre ganger for å mikse og verifisere hetten er forseglet.
  6. Rist røret i 10 minutter ved romtemperatur ved anvendelse av en bord- blander slik som en Eppendorf 5432.
  7. Sentrifuger ved 20800 xg i 10 min ved 4 ° C.
  8. Overfør 75 ul av den vandige fase til et nytt mikrofuge-rør inneholdende 1 ml 100% etanol. Inverter 10 ganger for å blande.
  9. Pelletere DNA ved sentrifugering ved 20 800 xg i 20 min ved 4 ° C.
  10. Aspirer supernatanten uten løsner DNA pelleten. Vask pelleten med 500 mL 70% etanol.
  11. Sentrifuger ved 20800 x g i 5 min ved 4 ° C.
  12. Aspirer supernatanten uten løsner DNA-pelleten og luft-tørke pellet ved mikrofuge hetten åpen inntil overskudd av etanol er fordampet, noe som vanligvis er rundt 10 min.
  13. Resuspender pellet DNA i 75 pl av 10 mM Tris, pH 7,4 og vortex å blande. Oppbevar prøven ved -20 ° C på ubestemt tid. Måle konsentrasjonen av DNA i prøven ved hjelp av enBenchtop fluorimeter slik som qubit, som skiller DNA fra RNA. Sikre at det endelige konsentrasjonen av gDNA er ~ 1-2 ng / mL.
  14. Forbered en 1:10 fortynning av genomisk DNA ved hjelp av vann og virvle å blande.
  15. Alikvoter 30 ul fortynnet gDNA inn i det riktige brønn av en kilde plate som er kompatibel med et nanoskala akustisk væskedispenser (trinn 3). Hvis du bruker en Labcyte Echo 550, bruker en 384 godt polypropylen plate (384PP plate).
    MERK: Når forseglet riktig denne platen kan lagres i minst én måned ved -20 ° C.

2. Forbered og fordelings qPCR Master Mix inn i en 1536 flere brønner Plate

  1. Forbered 850 mL av qPCR Master Mix, som LightCycler 1536 DNA Grønn Master, i en 1,5 ml mikrosentrifugerør og virvle å blande. Sentrifuger qPCR Master Mix i 2 min ved 20 800 xg ved romtemperatur for å fjerne eventuelle bobler. Komponentene i qPCR masterblanding som kreves for en enkelt plate for flere brønner 1536 er som følgers:
    1. Kombiner 170 mL av enzymet mester mix (grønn Master Tube 1, 5x konsentrert), 42,5 mL av SYBR (Grønn Master Tube 4, 20x konsentrert) og 637,5 mL av vann.
  2. Tilsett 500 nl / godt inn i en 1536 multiwell plate ved hjelp av en bulk flytende dispenser som Art Robbins Cobra. (Merk at noen 2.2.1-2.2.4 refererer spesielt til Cobra.)
    1. Lag en utleverings program med følgende innstillinger: væske klasse, vann; aspirer volum, 800 ul; dispensere volum, 500 nl; Vasketiden, 20 sek. I fordelingsinnstillingene, må du kontrollere fordelingshastigheten er satt til 49,6 mm / sek, fordelings forskyvningen er 0,25 mm, og overflødig aspirert væske vil bli utlevert tilbake til kilden godt.
    2. Plasser mikrofugerør inneholder qPCR mester mix i brønn A1 av mikrofugerør holderen, som ligger i dekk stilling 1. Skjær av toppen på den mikrofugerør eller bare la den være åpen. Sett "Sug godt" til A1 ved å redigere Aspirate innstillinger.
    3. Utfør en vasketrinn før utlevering qPCR mester mix av første de-velge aspirer og dispensere trinnene i programmet satt opp i trinn 2.2.2 og deretter trykke "Kjør". Når prosessen er ferdig, må du velge den aspirer og dispensere skritt før du kjører fullt program for å dispensere qPCR mester mix. Dersom Cobra har sittet inaktiv i mindre enn 10 min innledende vasketrinn, som tjener til å klargjøre systemet, er unødvendig.
    4. Hit "løpe" til å dispensere qPCR Master Mix til hver brønn.
  3. Samle qPCR konsentrat-blanding ved bunnen av hver brønn ved kort sentrifugering av flere brønner 1536 platen (30 sekunder ved bruk av en lav-hastighet PCR plate spinner).

3. Tilsett Mal DNA og Primere inn i 1536 for flere brønner Plate

  1. Dispensere 5 nl fortynnet gDNA (trinn 1.3) i de ønskede brønner på flere brønner 1536 platen ved hjelp av et akustisk væskeoverføringssystem, slik som Echo 550.
    1. For Echo 550, bruker Plate Formatere programvare eller alternativt gi en tilpasset Excel regneark til å programmere overføringen. Sikre den valgte kilden godt for gDNA i programmet samsvarer med kilde godt inn der du har fysisk utlevert den gDNA (trinn 1.3). Velge kildeplaten type '384PP_AQ_BP2', som indikerer væsken i 384PP plate er en buffer uten overflateaktive midler.
  2. Dispenser 10 nl av primere, ferdigblandet forover og bakover til en sluttkonsentrasjon på 50 pM hver, i de ønskede brønner på flere brønner 1536 platen ved hjelp av et akustisk væskeoverføringssystem, slik som Echo 550.
    1. For væskeoverføringssystem, bruk Plate Formatere programvare eller alternativt gi en tilpasset Excel regneark til å programmere overføringen.
      MERK: Her er det mulig å dispensere primere slik at oppsettet på 1536 multiwell plate matcher kromosom rekkefølgen av primere så det er lett å visuelt inspisere sanntid PCR resultatersenere (trinn 6).
    2. Premiks primerne i en plate som er kompatibel med den akustiske væskedispenser. For Echo 550, bruk en Labcyte 384LDV (lav dødvolumet) plate og velge kilde plate type '384LDV_AQ_B "når du programmerer Echo å indikere væsken er en enkel buffer uten proteiner.

4. Seal og Sentrifuger 1536 multiwell Plate

  1. Ved hjelp av en mikroplateforsegler system som Plateloc Thermal Microplate Sealer, umiddelbart forsegle flere brønner 1536 platen ved hjelp av optisk klar tetning som er kompatibel med varmeforsegleren instrumentet. Ikke berør overflaten på pakningen for å unngå flekk merkene.
    1. Hvis du bruker Plateloc Thermal Micro Sealer, bruke følgende innstillinger: forsegle tid 2.0 sek, sel temperatur 162 ° C, lufttrykk 82 psi. Dette instrumentet tar ~ 5 min til å varme opp og så skal være slått på på forhånd.
    2. Hvis du bruker Plateloc Thermal Micro Sealer, en ADAPTEr må brukes for å øke høyden på platen 1536 for flere brønner på scenen av instrumentet for å sikre god tetning.
      MERK: Selv om det er best å kjøpe en Stage Plate for Plateloc Thermal Micro Sealer er en alternativ løsning for å sette inn fire ~ 2 mm tykke standard skiver tilgjengelig til enhver jernvarehandel i hjørnene for å øke høyden på 1536 multiwell plate.
  2. Umiddelbart Sentrifuger forseglet 1536 for flere brønner plate ved 2000 x g i 3 minutter ved romtemperatur for å samle alle reagenser ved bunnen av hver brønn.

5. Real Time PCR

  1. Program en 1536 qPCR instrument, slik som LightCycler 1536, med en to-trinns amplifikasjonsprotokoll etterfulgt av en smeltekurve analyse. Bruke LightCycler 1536 programvare satt opp et program som følger:
    1. Preinkubasjon: 95 ° C, 1 min venting, rampehastighet 4,8 ° C / sek, ingen oppkjøpet.
    2. Two Step Amplification: 30 sykluser på [95 ° C, nei vent,rampe rente 4,8 ° C / sek, ingen oppkjøp; 64 ° C, 30 sek hold, rampehastighet 2,5 ° C / sek, single oppkjøpet].
    3. Smelt kurve: 95 ° C, 10 sek, rampehastighet 4,8 ° C / sek, ingen oppkjøp; 60 ° C, 1 min, rampe hastighet 2,5 ° C / sek, ingen anskaffelse; 97 ° C, rampe rente 0,1 ° C / sek, 5 oppkjøp / ° C (kontinuerlig).
    4. Cool: 40 ° C, 30 sek, rampehastighet 2,5 ° C / sek, ingen oppkjøpet.
  2. Sett Detection Format til 'Green interkalerende Dye "i kategorien Run Definition.
  3. Sett pipettering kontrollen til "Master Control" i kategorien Run Definition. Denne egenskapen tjener som en intern kontroll, og detekterer tilstedeværelsen av qPCR masterblanding i hver brønn av flere brønner 1536 plate, som er nyttig for å identifisere mulige falske negativer.
  4. Sett 1 536 multiwell plate forberedt på trinn 2-4 inn i 1536 qPCR instrument og kjøre programmet.

6. Data Analysis

  1. Perform visuell inspeksjon av dataene i qPCR-programvaren.
    MERK: 1536 programvaren muliggjør visualisering av både forsterkning og smeltekurvene, så vel som et varme kart som viser anropet (positiv, negativ, ugyldig, N / A, figur 2), krysningspunktet verdi (skyve fargeskala for positiv eller grå for negativ; figur 3), eller et endepunkt fluorescens (EPF) verdi (skyve fargeskala).
  2. Eksportere data fra 1536-programvare i form en .txt-fil (resultater tabell) eller xml fil med enten rådata eller beregnede data for behandling offline fra instrumentet.
    MERK: Den proprietære automatisert krysningspunkt (Cp) kaller algoritme bygget inn i 1536-programvaren tar hensyn til form og skråningen av amplifikasjonskurve mens bestemme positive / negative og Cp verdisamtaler med høy selvtillit, ved lav undermikroliter reaksjonsvolumer med relativt lav fluorescens verdier.
  3. Hvis LightCycler DNA Grønn Master var brukd for qPCR, kontrollere at alle brønner bestått 'master kontroll ". En ikke bestått indikerer vel ikke mottok qPCR mester mix og den manglende datapunkt skal betraktes som en potensiell falsk negativ. Kontroller at alle brønner bestått 'master kontroll ". En ikke bestått indikerer vel ikke mottok DNA Mastermix og vurdere den manglende datapunkt en potensiell falsk negativ.

Representative Results

Vi testet syntetisk og vill type kromosom 3 PCRTag primerparene en med gjær genomisk DNA (gDNA) hentet fra fire forskjellige stammer. Kromosom 3 har 186 PCRTag primerpar som spenner over lengden av kromosomet (synIII er ~ 270 kb og villtype-kromosom 3 er ~ 315 kb). For å teste hver av de fire stammer med begge sett med primere, vi delt flere brønner plate inn i fire kvadranter, en for hver type gDNA, tildele syntetiske PCRTag primere til den øverste halvdelen av hver kvadrant og villtype til den nederste halvdelen. Genomisk DNA ble ekstrahert fra gjærstammer, hvorav to som koder for villtype-kromosom 3 (villtype, synIXR 2), mens de resterende to encode syntetisk kromosom 3 (synIII 1, synIII synIXR). qPCR masterblanding ble dispensert i hver brønn på en 1536 flere brønner plate ved hjelp av en væskemasse dispenser, etterfulgt av gDNA og PCRTag primere ved hjelp av ekko 550. Primere ble kledd likt ihver kvadrant av flere brønner plate for enkel visuell sammenligning. Flere brønner Platen ble deretter varmeforseglet med optisk klar tetning og utsatt for sanntids-PCR-analyse.

I dette forsøket ble det observert qPCRTag, for det meste, forsterkning som forventet, hvorved syntetiske primere utelukkende forsterket syntetisk DNA og vice versa (figur 2 og 3). Men vi er også observert flere avvik fra den forventede mønster, noe som tyder på falske negative og falske positive i datasettet. I dette eksperimentet, ble hovedkontroll påvist i 100% av brønnene, noe som indikerer væskemassen dispenseren hell dispenseres Mastermix inn i hver brønn på platen (data ikke vist). Dette utelukker en potensiell kilde til falske negative. I tillegg er noen kromosom 3 PCRTags kjent for å svikte (vist i fig S6 og S7 fra Annaluru et al. 1), innbefattende minst to syn- og en WTprimerparene; at disse brønner kan ignoreres i hver kvadrant. Sanne falske negative kan oppstå fra en mangel på overføring av malen gDNA eller primere, men i vår erfaring, gitt riktig kalibrering av Echo 550 samt utarbeidelse av gDNA og primere som er beskrevet, har ikke dette vært en stor feilkilde. Samlet i dette eksperimentet den feilaktig negative klassifiseringen var ekstremt lavt for WT primere med wt-sjablon (~ 2%), selv om noe høyere for SYN SYN primere med DNA (~ 8%).

Falske positiver, deteksjon av signal i brønner hvor SYN primere er blandet med WT gDNA (og vice versa), kan oppstå fra kryss forsterkning eller primer dimer. Faktisk, primer-dimerer er ofte synlige ved gelelektroforese (figur 1B), og representerer et rimelig feilkilde. For anvendelse av qPCR, kan undersøkelsen av smeltekurvene være nyttig for å bestemme hvorvidt forskjellige arter, for eksempel primer-dimerer, kan være medvirkende til et signal. Videre perfforme et kontrollforsøk hvorved primere blir dispensert i fravær av templat-DNA, kan bidra til å identifisere primere med en tilbøyelighet til å dimerisere. Cross forsterkning kan observeres ved hjelp av gelelektroforese, spesielt hvis det er for mange PCR-sykluser blir utført, eller dersom glødetemperaturen er for lav. Vi har forsøkt å minimalisere antallet av falske positiver på grunn av kryss amplifikasjon ved å optimalisere begge disse parameterne for den qPCRTag protokollen. Endelig undersøke krysningspunkt (CP) verdier for hver brønn kan bidra til å identifisere primere som ikke er egnet til sanntid-basert gjenkjenning (figur 3, for eksempel, BB22, Fb22, Bb46, Fb46). Samlet i dette eksperimentet den falske positive var lav for SYN primere med WT malen (~ 5%), og høyere for WT primere med SYN malen (~ 10%).

Figur 2
Figur 2: Plate varmekartet viser tilstedeværelse / absence samtale for en qPCRTag eksperiment. Fire forskjellige typer genomisk DNA (kvadranter atskilt med faste, hvite linjer) ble utsatt for PCRTag analyse ved hjelp av syntetisk (SYN) og villtype (WT) kromosom 3 PCRTag primere (stiplede hvite linjer for å skille SYN (toppen ) og WT (nederst) i hver kvadrant). WT og synIXR gDNA kode vill type kromosom 3, noe som gir forsterkning med WT PCRTag primere. SynIII og synIII synIXR gDNA kode syntetisk kromosom 3, noe som gir forsterkning med SYN PCRTag primere. Grunning er kledd i henhold til deres venstre mot høyre kromosom posisjonering og plassert likt i de fire kvadrantene for sammenligning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Plate varmeKart som viser passeringspunkt (Cp) verdi for en qPCRTag eksperiment Dette er. det samme datasettet som i figur 2 og platen layout er derfor identiske. N / A refererer til 'no forsterkning ". Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Inkorporering av real time PCR deteksjon inn i PCRTag genotyping analysen er en viktig utvikling for Sc2.0 prosjektet som det muliggjør betydelig høyere gjennomstrømning. Den tidligere angitte arbeids 2,5 pl reaksjonsblandinger i 384 også PCR-plater, 1,5 hr termisk sykling kjøring, agarose gelelektroforese, og manuell annotering av gelen.

Arbeidsflyten presenteres her, kalt qPCRTag analyse, overvinner flere store flaskehalser. Først kondenserer en qPCRTag løp 4 x 384 brønners plater i ett enkelt eksperiment som kan behandles, start til slutt (plate satt opp pluss kjøretid), i omtrent en time. Det er viktig å merke seg at reagensen kostnaden per brønn for qPCRTag analyse er på nivå med lavere gjennomstrømming agarosegel basert tilnærming. Men ved å omgå gelelektroforese og manuell annotering, gir den qPCRTag arbeidsflyten betydelige besparelser i tid og arbeidskraft, som er de store fordelene. Viktigst qPCRTag arbeidsflyten er entirely kompatibel med automatisering.

Et stort problem med bruk av sanntidsdeteksjon som utgangen fra PCRTag analysen er frekvensen av falske positive og falske negative. Siden PCRTag primere ikke ble opprinnelig utviklet for bruk i sanntids-PCR, er det forventet at ikke alle primerpar vil være passende for bruk med denne utgang. For dette formål er det viktig å validere funksjon og spesifisitet av alle PCRTag primerpar for å utelukke den delen som ikke arbeider i sann tid-baserte analysen foran. For eksempel kromosom 3 PCRTag falske positive og negative er by-og-stor reproduserbar i sanntid PCR data (figur 2 og 3), og disse kan bli ekskludert fra videre analyser. Videre primerpar som er kjent for å svikte (bestemt ved gel-elektroforese og er vist i figurene S6 og S7 fra Annaluru et al. 1) kan også utelukkes. Dette gjør du enkelt rett og slett excluding de defekte primerparene når du setter opp den akustiske overføringsprotokoll.

Som de fleste høy gjennomstrømning analyser, vi har tenkt å bruke sanntid PCRTag deteksjon som en primær skjerm for å identifisere transformanter som fortjener videre nedstrøms validering. Deretter vil gullstandarden for sekundærscreening forbli PCRTag analyse med gel elektroforese som avlesning. Utover bruk av PCRTag analyse for Sc2.0 kombinerer state-of-the-art nanoskala væskehåndteringssystemer med høy gjennomstrømning real time PCR-teknologi gir rask og automatisert analyse og har potensial til å påvirke mange felt. For eksempel kan dette arbeidsflyten påføres high throughput screening av bibliotek, infeksjonssykdom diagnose, mikrobiomer analyse, og banebrytende genomet redigering tilnærminger forsøker å modifisere multiple loci samtidig.

Disclosures

LAM, NAP, JAM og JDB har ingenting å avsløre. RC og AL er ansatt av Roche Life Science, USA og jobbet med å utvikle programmet med LAM som en del av et bevis på prinsippet eksperiment.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet delvis av National Science Foundation Grant MCB-0718846 og Defense Advanced Research Projects Agency Contract N66001-12-C-4020 (til JDB). LAM ble finansiert av et postdoktorstipend fra naturvitenskap og Engineering Research Council of Canada. Publisering av denne artikkelen er sponset av Roche.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast gDNA prep
yeast gDNA custom custom template for real time PCR
Acid-washed glass beads (0.5 mm) Sigma G8772 yeast cell lysis
Ultrapure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) Invitrogen 15593-031 yeast cell lysis
5432 Mixer Eppendorf 5432 yeast cell lysis
Microcentrifuge 5417R Eppendorf 22621807 yeast cell lysis
Qubit 3.0 Fluorometer Life Technologies Q33216 gDNA quantification
Qubit dsDNA BR Assay Kit Life Technologies Q32850 gDNA quantification
Labcyte 384PP plate Labcyte P-05525 gDNA source plate
DNA Green Mastermix prep and dispensing
LightCycler 1536 DNA Green Roche 5573092001 real time PCR mastermix
1.5 ml Microfuge Tube Holder ARI EST BD060314-1 microfuge tube holder for deck of Cobra
LightCycler 1536 Multiwell Plate Roche 5358639001
Cobra liquid handling system Art Robbins Instruments 630-1000-10 dispense qPCR master mix into 1536 plate
PCR Plate Spinner VWR 89184-608 cenrifugation of 1536 plate
Template and primer dispensing
PCRTag primers IDT custom premixed forward and reverse, 50 μM each
TempPlate pierceable sealing foil, sterile USA Scientific 2923-0110 temporary seal for PCRTag primer plates
Labcyte LDV 384 well plate Labcyte LP-0200 pre-mixed primer source plate
Echo 550 Liquid Handler Labcyte transfer 2.5 nl drops of primer and template DNA into 1536 plate
Plateloc Thermal Microplate Sealer Agilent G5402-90001 heat seal for 1536 plate prior to LC1536 run
Clear Permanent Seal Agilent 24212-001 optically clear heat seal for LC1536 multiwell plate
PlateLoc Roche/LightCycler 1536 Plate Stage Agilent G5402-20008 can substitute ~2 mm thick washers
Sorvall Legend XTR Thermo Scientfic 75-004-521 centrifuge heat sealed 1536 plate
Industrial Air Compressor Jun Air 1795011 to run the Echo and Heat Sealer
Real Time PCR
LightCycler 1536 Roche requires 220 V outlet

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Annaluru, N., et al. Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome. Science. 344, (6179), 55-58 (2014).
  2. Dymond, J. S., et al. Synthetic chromosome arms function in yeast and generate phenotypic diversity by design. Nature. 477, (7365), 471-476 (2011).
  3. Goffeau, A., et al. Life with 6000 genes. Science. 274, (5287), 546-547 (1996).
  4. Dymond, J., Boeke, J. The Saccharomyces cerevisiae SCRaMbLE system and genome minimization. Bioeng Bugs. 3, (3), 168-171 (2012).
  5. Richardson, S. M., Nunley, P. W., Yarrington, R. M., Boeke, J. D., Bader, J. S. GeneDesign 3.0 is an updated synthetic biology toolkit. Nucleic Acids Res. 38, (8), 2603-2606 (2010).
  6. Richardson, S. M., Liu, S., Boeke, J. D., Bader, J. S. Design-A-Gene with GeneDesign. Methods Mol Biol. 852, 235-247 (2012).
  7. Lajoie, M. J., et al. Probing the limits of genetic recoding in essential genes. Science. 342, (6156), 361-363 (2013).
  8. Jovicevic, D., Blount, B. A., Ellis, T. Total synthesis of a eukaryotic chromosome: Redesigning and SCRaMbLE-ing yeast. Bioessays. 36, (9), 855-860 (2014).
  9. Dymond, J. S. Preparation of genomic DNA from Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 529, 153-160 (2013).
  10. Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14, (2), 115-132 (1998).
qPCRTag Analysis - En høy gjennomstrømning, Real Time PCR-analyse for Sc2.0 Genotyping
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mitchell, L. A., Phillips, N. A., Lafont, A., Martin, J. A., Cutting, R., Boeke, J. D. qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping. J. Vis. Exp. (99), e52941, doi:10.3791/52941 (2015).More

Mitchell, L. A., Phillips, N. A., Lafont, A., Martin, J. A., Cutting, R., Boeke, J. D. qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping. J. Vis. Exp. (99), e52941, doi:10.3791/52941 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter