Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.
El Proyecto Genoma levadura sintética (Sc2.0) tiene como objetivo construir 16 cromosomas de la levadura de diseño y combinarlos en una sola célula de levadura. Hasta la fecha, un cromosoma sintético, synIII 1, y un brazo cromosoma sintético, synIXR 2, se han construido y su función in vivo validado en ausencia de los correspondientes cromosomas de tipo salvaje. Una característica importante del diseño de los cromosomas Sc2.0 es la introducción de PCRTags, que son secuencias cortas, re-codificado dentro de los marcos de lectura abierta (ORFs) que permiten la diferenciación de los cromosomas sintéticos a partir de sus homólogos de tipo salvaje. PCRTag cebadores hibridan selectivamente a cualquiera de cromosomas sintéticos de tipo o salvajes y la presencia / ausencia de cada tipo de ADN se puede probar con un simple ensayo de PCR. La lectura estándar del ensayo PCRTag es evaluar la presencia / ausencia de amplicones por electroforesis en gel de agarosa. Sin embargo, con una densidad media amplicón PCRTag de uno por 1,5 kb y agenome tamaño de ~ 12 Mb, el genoma Sc2.0 completado codificará aproximadamente 8.000 PCRTags. Para mejorar el rendimiento, hemos desarrollado un ensayo de detección basado en la PCR en tiempo real para PCRTag genotipado que llamamos análisis qPCRTag. El flujo de trabajo especifica 500 reacciones nl en una placa de múltiples pocillos 1536, lo que nos permite probar hasta 768 PCRTags con ambos pares de cebadores de tipo sintético y salvajes en un solo experimento.
Sc2.0, o el Proyecto Genoma levadura sintética ( www.syntheticyeast.org ), ha fijado el objetivo de diseñar y construir un genoma eucariota totalmente sintético. El uso de la secuencia del genoma altamente comisariada de Saccharomyces cerevisiae 3 como punto de partida, cada uno de los cromosomas lineales dieciséis ha sido rediseñado para satisfacer un conjunto de principios de diseño que especifican mantener la condición física de células, mejorando la estabilidad del genoma, y el aumento de la flexibilidad genética. Por ejemplo, elementos desestabilizadores tales como repeticiones se eliminan de cromosomas Sc2.0. Todas las instancias de los codones de parada TAG son re-codificados para TAA para 'liberar' un codón en la cepa final para la introducción de un aminoácido codificado no genéticamente. Además un sistema de evolución inducible, Scramble, habilitado por el sistema Cre-lox, permite la capacidad sin precedentes para generar genomas derivados con nuevas estructuras 4.
<p class="Jove_content"> Otro elemento importante del diseño en el genoma Sc2.0 es la introducción de PCRTags, que sirven como marcas de agua de ADN para permitir el seguimiento del ADN de tipo sintético y salvaje. PCRTags son segmentos cortos, re-codificado en ORFs en los cromosomas sintéticos; mientras que las secuencias PCRTag difieren en el nivel de ADN entre los cromosomas tipo sintético y salvajes, las proteínas codificadas son idénticos en secuencia de aminoácidos y, por tanto, presumiblemente, la función. Secuencias PCRTag están diseñados específicamente como sitios de unión del cebador para facilitar la amplificación selectiva (Figura 1A). Diseño PCRTag se lleva a cabo utilizando el algoritmo 'más diferente' en GeneDesign 5,6, obteniéndose recodificada secuencias sintéticas que son típicamente ~ 60% diferente de las secuencias nativas (mínimo 33%) con temperaturas de fusión entre 58 ° C y 60 ° C y amplicón longitudes de entre 200-500 pares de bases 2. Recodificación no está permitido dentro de la primera 100 pb de cada ORF, ya que estas regiones son conocidos portienen preferencias especiales en términos de uso de codones 7. En conjunto, estas reglas de diseño a favor de un alto rendimiento de casi todos PCRTags bajo un único conjunto de condiciones de la PCR mediante el cual pares sintéticos y salvajes imprimación tipo PCRTag unen exclusiva y amplifican el ADN sintético y nativo, respectivamente (Figura 1B).
Figura 1:. PCRTag esquemática PCRTags (A) son secuencias dentro de los marcos de lectura abierta (ORF) de los genes en los cromosomas Sc2.0 re-codificadas. (B) sintético (SYN) y de tipo salvaje (WT) primers PCRTag unen exclusivamente y amplifican el ADN genómico de tipo sintético y salvaje (gDNA), respectivamente. Aquí se muestra un análisis de un segmento kb ~ 30 del brazo izquierdo del cromosoma seis, probando trece pares de cebadores PCRTag utilizando ya sea WT o semi-synVIL2 gDNA como plantilla. En muchos casos un solo ORF codifica más de un PCRTag. Presencia / ausencia de amplicones PCRTag se evaluó a través de electroforesis en gel de agarosa. Amplicones PCRTag varían en tamaño desde 200 pb a 500 pb. Las especies que migran más rápidamente en la parte inferior de los paneles son dímeros de cebadores.
Análisis PCRTag ha demostrado ser una herramienta importante en el conjunto de cromosomas Sc2.0. En un experimento típico de 30-50 kb de ADN sintético, que codifica 20-30 PCRTags, se transforma en células de levadura para reemplazar el correspondiente ADN de tipo salvaje 1,2,8. Análisis PCRTag se utiliza para identificar los transformantes que codifican PCRTags tipo sintéticos pero no salvaje que abarcan ese segmento de ADN, o los llamados "ganadores". Por lo general es necesario probar varios transformantes para identificar "ganadores", por lo que el rendimiento y costo del análisis PCRTag son consideraciones importantes. Actualmente dos cromosomas Sc2.0 se han completado (synIII 1 y synIXR 2), que representa menos del 10% del genoma Sc2.0, although más de la mitad de los cromosomas restantes están actualmente en proceso de síntesis y ensamblaje. La escala de análisis PCRTag requerida para este proyecto está superando rápidamente la capacidad de ejecutar geles y manualmente anotar la presencia de ADN sintético y ausencia de ADN de tipo salvaje.
Para mejorar el rendimiento del ensayo PCRTag hemos desarrollado un flujo de trabajo utilizando PCR en tiempo real para eludir el uso de electroforesis en gel de agarosa. El flujo de trabajo hace uso de un dispensador de líquido a granel para distribuir qPCR mezcla maestra en cada pocillo de una placa de múltiples pocillos 1536, un dispensador de líquido acústica nanoescala para transferir ADN molde y los cebadores, y un termociclador 1536 qPCR, lo que nos permite miniaturizar reacciones a 500 nl y maximizar el rendimiento. Además análisis puede automatizarse. Este tipo de protocolo de genotipado de alto rendimiento debe ser generalizables a cualquier proyecto que requiera análisis de muchos clones en múltiples loci.
La incorporación de la detección por PCR en tiempo real en el ensayo de genotipado PCRTag es un avance importante para el proyecto Sc2.0 ya que permite un mayor rendimiento significativamente. El flujo de trabajo anterior especifica 2,5 reacciones mu l en placas de 384 pocillos de PCR, 1,5 horas de tiempo térmica de ciclo de ejecución, electroforesis en gel de agarosa, y anotación manual de la gel.
El flujo de trabajo que aquí se presenta, llamado análisis qPCRTag, supera varios cuellos de botella importantes. En primer lugar, una carrera qPCRTag condensa 4 x 384 y placas en un único experimento que puede ser procesada, de principio a fin (placa de configurar más el tiempo de ejecución), en aproximadamente una hora. Es importante señalar que el costo de reactivo por pocillo para el análisis qPCRTag está a la par con el enfoque basado en gel de agarosa rendimiento inferior. Sin embargo, eludiendo electroforesis en gel y anotación manual, el flujo de trabajo qPCRTag proporciona ahorros sustanciales en el tiempo y mano de obra, que son las principales ventajas. Es importante destacar que el flujo de trabajo es en qPCRTagenteramente compatible con la automatización.
Una preocupación importante con el uso de la detección en tiempo real como la salida del ensayo PCRTag es la tasa de falsos positivos y falsos negativos. Dado que los cebadores PCRTag no fueron diseñados originalmente para su uso en PCR en tiempo real, se espera que no todos los pares de cebadores serán apropiados para su uso con esta salida. Para ello es importante para validar la función y la especificidad de todos los pares de cebadores PCRTag excluir el subconjunto que no funcionan en el ensayo basado en tiempo real en la delantera. Por ejemplo, el cromosoma 3 PCRTag falsos positivos y negativos están haciendo ya gran reproducible en el tiempo real de datos de PCR (Figuras 2 y 3) y estos pueden ser excluidos de los nuevos análisis. Además, los pares de cebadores conocidos a fallar (evaluados por electroforesis en gel y se muestran en las figuras S6 y S7 de Annaluru et al. 1) También se puede excluir. Esto se logra fácilmente, simplemente excluding los pares de cebadores defectuosas al configurar el protocolo de transferencia acústica.
Al igual que la mayoría de los ensayos de alto rendimiento, tenemos la intención de utilizar la detección PCRTag tiempo real como pantalla principal para identificar transformantes que merecen una mayor validación aguas abajo. Posteriormente, el estándar de oro para la investigación secundaria permanecerá análisis PCRTag con electroforesis en gel como la lectura. Más allá de la aplicación del análisis PCRTag para Sc2.0, combinando los sistemas de manejo de líquidos a nanoescala con tecnología de última generación con un alto rendimiento en tiempo real la tecnología PCR permite un análisis rápido y automatizado y tiene potencial de impactar muchos campos. Por ejemplo, este flujo de trabajo se podría aplicar a cribado de alto rendimiento de la biblioteca, el diagnóstico de enfermedades infecciosas, el análisis microbioma, y edición genoma de vanguardia enfoques intentar modificar múltiples loci simultáneamente.
The authors have nothing to disclose.
Esta obra fue financiada en parte por la Fundación Nacional de Ciencias de subvención MCB-0718846 y Defensa Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada Contrato N66001-12-C-4020 (a JDB). LAM fue financiado por una beca postdoctoral de Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá. La publicación de este artículo es patrocinado por Roche.
Yeast gDNA prep | |||
yeast gDNA | custom | custom | template for real time PCR |
Acid-washed glass beads (0.5mm) | Sigma | G8772 | yeast cell lysis |
Ultrapure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Invitrogen | 15593-031 | yeast cell lysis |
5432 Mixer | Eppendorf | 5432 | yeast cell lysis |
Microcentrifuge 5417R | Eppendorf | 22621807 | yeast cell lysis |
Qubit 3.0 Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | gDNA quantification |
Qubit dsDNA BR Assay Kit | Life Technologies | Q32850 | gDNA quantification |
Labcyte 384PP plate | Labcyte | P-05525 | gDNA source plate |
DNA Green Mastermix prep and dispensing | |||
LightCycler 1536 DNA Green | Roche | 5573092001 | real time PCR mastermix |
1.5mL Microfuge Tube Holder | ARI | EST BD060314-1 | microfuge tube holder for deck of Cobra |
LightCycler 1536 Multiwell Plate | Roche | 5358639001 | |
Cobra liquid handling system | Art Robbins Instruments | 630-1000-10 | dispense qPCR master mix into 1536 plate |
PCR Plate Spinner | VWR | 89184-608 | cenrifugation of 1536 plate |
Template and primer dispensing | |||
PCRTag primers | IDT | custom | premixed forward and reverse, [50uM] each |
TempPlate pierceable sealing foil, sterile | USA Scientific | 2923-0110 | temporary seal for PCRTag primer plates |
Labcyte LDV 384 well plate | Labcyte | LP-0200 | pre-mixed primer source plate |
Echo 550 Liquid Handler | Labcyte | transfer 2.5nL drops of primer and template DNA into 1536 plate | |
Plateloc Thermal Microplate Sealer | Agilent | G5402-90001 | heat seal for 1536 plate prior to LC1536 run |
Clear Permanent Seal | Agilent | 24212-001 | optically clear heat seal for LC1536 multiwell plate |
PlateLoc Roche/LightCycler 1536 Plate Stage | Agilent | G5402-20008 | can substitute ~2mm thick washers |
Sorvall Legend XTR | Thermo Scientfic | 75-004-521 | centrifuge heat sealed 1536 plate |
Industrial Air Compressor | Jun Air | 1795011 | to run the Echo and Heat Sealer |
Real Time PCR | |||
LightCycler 1536 | Roche | requires 220V outlet |