Abstract
بدون ومزدهرة السكان الخلية النشطة التي يتم توزيعها بشكل جيد وترتكز على قالب إدراج ثابت، لا يحدث تجديد العظام استثنائية. مع القوالب التقليدية، وغياب الداخلية النتائج القنوات الدقيقة في عدم وجود تسلل خلية، والتوزيع، وسكان في عمق القوالب. وبالتالي، قالب يسهل اختراقها للغاية ومترابط بشكل موحد تربيقية العظام مثل مع قنوات الصغرى (قالب المكروية الاحيائية، BMT) وقد وضعت لمعالجة هذه العقبات. تم إنشاء BMT الرواية التي كتبها مفاهيم مبتكرة (العمل الشعري) وملفقة مع تقنية الطلاء الاسفنج القالب. تتألف BMT من العديد من المكونات الهيكلية: مترابطة المسام الابتدائية (300-400 ميكرون) التي تحاكي المسام في العظام التربيقي، قنوات الدقيقة (25-70 ميكرون) في كل تربيق، وnanopores (100-400 نانومتر) على السطح للسماح للخلايا لارساء. وعلاوة على ذلك، تم توثيق BMT من خلال الدراسة اختبار الميكانيكية لديك سيمILAR خصائص القوة الميكانيكية لتلك العظام التربيقي البشري (~ 3.8 ميجا باسكال) 12.
وBMT عرضت امتصاص عالية، والاحتفاظ، وسكن من الخلايا في جميع أنحاء (Π) قوالب على شكل جسر (الارتفاع 3 سم و 4 سم طول). الخلايا التي كانت في البداية المصنفة في نهاية واحدة من القوالب تعبئة فورا إلى الطرف الآخر (10 سم المسافة) من خلال العمل الشعري من BMT على وسائل الإعلام الخلية. بعد 4 ساعات، والخلايا احتلت متجانس وBMT كامل وعرضت السلوك الخلوي العادي. استحوذ عمل شعري للتسلل خلايا معلقة في وسائل الإعلام وتوزيع (الهجرة النشيطة) في جميع أنحاء BMT. وبعد أن لاحظ هذه القدرات من BMT، نتوقع أن BMTs سوف تمتص خلايا نخاع العظام، وعوامل النمو، والمواد المغذية من المحيط في ظل الظروف الفسيولوجية.
يجوز للBMT حل القيود الحالية عبر تسلل السريع، وتوزيع متجانس وinhabitaالامتحانات التنافسية الوطنية من الخلايا في والقوالب حجمية كبيرة لإصلاح عيوب هيكلية واسعة النطاق.
Protocol
1. مادة البولي يوريثين (PU) إعداد الإسفنج كقالب
- استخدام الإسفنج PU لإنتاج قوالب هيدروكسيباتيت تحتوي على الربط بين المسام. استخدام كل إسفنجة لتوفير الترابيق الرئيسي لتشكيل الدعامات قالب فضلا عن تشكيل قنوات الصغرى داخل الترابيق.
- قص وتقليم 80 نقطة في البوصة (المسام في البوصة) الإسفنج إلى 2 الجسور الأشكال مع أبعاد 3.5 سم في الطول × 5 سم في الطول × 1.5 سم في العرض.
ملاحظة: الأبعاد والأشكال ويمكن اختيار وفقا لحجم المسام الأساسي المطلوب: 100 نقطة في البوصة، و 80 نقطة في البوصة، و 60 نقطة في البوصة. - جعل 100 مل من 4٪ (وزن / حجم) محلول هيدروكسيد الصوديوم باستخدام كوب 150 مل. ثم تزج والضغط حتى يتم استيعابه الإسفنج مستعدة تماما.
- بعد النقع، ضع الكأس مع الإسفنج في ultrasonicator (42 كيلو هرتز).
- بالموجات فوق الصوتية قبل علاج الإسفنج PU لمدة 15-20 دقيقة دون حرارة لتعديل خصائص السطح.
- شطف مع المقطرالماء لمدة 5-10 دقيقة. بينما الشطف، ضغط الإسفنج والسماح لهم لتوسيع 5-7 مرات من أجل إزالة هيدروكسيد الصوديوم المتبقية داخل الإسفنج.
- ضغط الإسفنج مع مناشف ورقية لإزالة الماء الزائد. ثم تجفيفها في الفرن على 60-80 درجة مئوية.
2. هيدروكسيباتيت (HA) إعداد الطين لطلاء
- قبل اتخاذ الطين HA، وقياس وزن الكأس مع شريط مغناطيسي. وسيتم استخدام هذا القياس لحساب نسبة مسحوق / السائل.
- قياس 10 غرام من مسحوق HA-نانو الحجم.
- إضافة 20 مل من الماء المقطر في الكأس 50 مل. الحرارة لمدة 120-140 ° C ويقلب باستخدام صفيحة ساخنة مغناطيسي.
- إضافة 0.3 غرام (3٪ ث / ث) الكحول البولي فينيل (PVA) (89،000-98،000 MW) في مسحوق في الماء المقطر مع التحريك على 300-400 دورة في الدقيقة.
- يحرك حتى يذوب PVA تماما. يجب أن يكون الحل واضحا بعد حل كامل للبولي.
- تحويل سوما يليها الحرارة وإضافة 0.1 غرام (1٪ ث / ث) من كاربوكسيميثيل الصوديوم السليلوز (CMC) (اللزوجة منخفضة للغاية) لمسحوق مع التحريك على 400-500 دورة في الدقيقة. يجب أن يكون الحل واضحا بعد حل كامل للبولي.
- يحرك حتى يذوب تماما CMC وتهدئة لRT.
- إضافة 0.3 غرام (3٪ ث / ث) من polyacrylate الأمونيوم مشتتة في مسحوق مع التحريك على 300-400 دورة في الدقيقة. يحرك حتى يذوب تماما.
- إضافة 0.2 غرام (2٪ ث / ث) من الجلسرين في مسحوق مع التحريك على 300-400 دورة في الدقيقة. يحرك حتى يذوب تماما.
- تفريق ببطء مسحوق HA إلى حل مع التحريك على 600-900 دورة في الدقيقة والحفاظ على التحريك لمدة 5 دقائق.
- يصوتن لمدة 5 دقائق باستخدام ultrasonicator لضمان تشتت في أي تجمع سكاني من مسحوق HA.
- إضافة اضافي 5 مل من الماء المقطر إلى الخليط مع التحريك على 600-900 دورة في الدقيقة والحرارة في 90-100 ° C.
- الحفاظ على اثارة الخليط باستخدام محرك مغناطيسي في 600-800 دورة في الدقيقة في 90-100 ° C في أوردإيه لتتبخر محتوى الماء.
- قياس الوزن كله بما في ذلك الكأس وخليط من وقت لآخر حتى يتم الحصول على نسبة مسحوق / السائل من 1،75 حتي 1،8.
- تنسيق نسبة مسحوق / السائل، تقسيم وزن مسحوق من الوزن الكلي للخليط (2.14)، بما في ذلك مسحوق الكواشف، والمياه، وناقص الوزن من الكأس والنمام (2.1)، وناقص مسحوق HA (2،2).
ملاحظة: على سبيل المثال: إذا كان A (خليط بأكمله بما في ذلك مسحوق الكواشف، والمياه) هو 49.05 غرام، B (كوب مع النمام) هو 33.5 غرام، ومن ثم C (HA مسحوق) هو 10 غرام.
C / (ABC) = 10 / (49.05-33.5-10) = 1،80 - السماح الطين ليبرد لRT قبل استخدام لطلاء.
3. HA الطلاء، والتجفيف، والتكلس
- معطف الإسفنج PU مستعدة مع طلاء الطين HA باستخدام ملعقة غير القابل للصدأ حتى الطين يتم توزيع متجانس في جميع أنحاء الإسفنج PU على طبق من زجاج.
ملاحظة: بعد إزالة افتراء الزائدراي، بعض من المسام قد تكون لا تزال مسدودة مع الطين بسبب الطين اللزوجة العالية. - من أجل ضمان الترابط والتجانس، والمسام مفتوحة، قليلا ضربة القوالب HA المغلفة باستخدام ضاغط الهواء. هذه العملية تضمن أن القوالب والمغلفة بشكل متجانس على حد سواء على الأسطح الداخلية والخارجية من الاسفنج PU.
ملاحظة: إذا لم يتم التوصل إلى طلاء متجانس، والقوالب المغلفة HA ينهار خلال عملية التكلس ويمكن أن الكراك أيضا أثناء التعامل مع نظرا لانخفاض القوة الميكانيكية. بالإضافة إلى ذلك، وطلاء متجانس أمر بالغ الأهمية في خلق الصغرى القنوات داخل الترابيق. - تجفيف قوالب HA المغلفة مدة لا تقل عن 5 ساعة تحت ظروف التبريد (20-25 درجة مئوية) مع دوران الهواء لطيف. ومع ذلك، تمديد وقت التجفيف استنادا إلى حجم القالب.
ملاحظة: بعد التجفيف، والقوالب HA المغلفة يتقلص عادة ما يقرب من 8٪ إلى 10٪ في كل البعد. - بعد عملية التجفيف، ووضع HAقوالب المغلفة على بوتقة الألومينا. ثم، ووضعها في فرن درجة حرارة عالية واستخدم ما يلي تلبد الشخصي 8 الخطوة.
- الحرارة 2 ° C / دقيقة حتى 230 درجة مئوية.
- الحرارة 1 درجة مئوية / دقيقة حتى 280 درجة مئوية.
- الحرارة 0.5 درجة مئوية / دقيقة حتى 400 درجة مئوية.
- الحرارة 3 درجات مئوية / دقيقة حتى 600 درجة مئوية. الحفاظ على 600 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- الحرارة 5 درجات مئوية / دقيقة حتى 1230 درجة مئوية. الحفاظ على 1230 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
- بارد 5 ° C / دقيقة لRT.
ملاحظة: سوف التكلس مزيد من تقليص قوالب الاسفنج HA المغلفة قبل ما يقرب من 22٪ - 25٪ في كل البعد.
4. تنظيم الخروج والسكنى من الخلايا في قالب
- ثقافة الخلايا MC3T3 قبل عظمية في وسائل الإعلام غير عظمي المنشأ تتألف من α-MEM، على أن تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ المضادات الحيوية (الستربتومايسين والبنسلين) عند 37 درجة مئوية في جو مرطب يحتوي على 5٪ CO 2 .
- إضافة 10 ملمن تعليق خلية في 2 × 10 6 كثافة الخلايا في بئر واحد داخل لوحة 6 جيدا.
- وضع قالب على شكل جسر 3 سم × 4 سم × 1 سم عموديا في لوحة 6 جيدا. وضع ساق واحدة من القالب إلى لوحة تحتوي على تعليق خلية، والساق الأخرى في بئر فارغة مجاورة.
- السماح للقالب لامتصاص تعليق خلية لمدة 10 دقيقة.
- إضافة 5 مل من وسائل الإعلام بعد ذلك إلى البئر التي كانت مليئة أصلا مع تعليق الخلية.
- تجديد المتوسطة في كلا البئرين كل 2 أو 3 أيام حتى انقضت مدة 7 أيام.
- تحديد مدى فعالية الحراك الخلية الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ 11.
- إصلاح الخلايا وسقالة من تخبط في 100٪ ETOH لمدة 20-30 دقيقة.
- وصمة عار مع الهيماتوكسيلين لمدة 1-2 دقيقة.
- شطف مع الماء المقطر لمدة 1-2 دقيقة لمرتين.
- يذوى عن طريق الغمر في 70٪، ثم 95٪، ثم ETOH 100٪ لمدة 1-2 دقيقة لكل منهما.
- وصمة عار مع يوزين لمدة 20-30 ثانية.
- شطف مع الماء المقطر لمدة 12 دقيقة لمرتين.
- يذوى عن طريق الغمر في 70٪، 80٪، 90٪، و 100٪ ETOH لمدة 1-2 دقيقة لكل منهما.
- تضمين سقالة في راتنج الأكريليك لباجتزاء والتصوير.
- تحديد بقاء الخلية مع نقاط 3- [4،5-Dimethylthiazol-2-يل] -2،5-ثنائي الفينيل نتروبلو بروميد (MTT) فحص بقاء الخلية ولايف / فحص الميت (الخلية الحية / الميت تلطيخ عدة MPTP) في وقت من يوم 3 و 7 11.
ملاحظة: مخطط بروتوكولات قالب تلفيق مثل العظام تتمثل في "ممثل النتائج" الدورة.
Representative Results
الهيكل العام للBMT المعارض قالب ثلاثي الأبعاد فريدة من نوعها مع هياكل تشبه العظام التربيقية الداخلية. وBMT يحتوي على مسام الكلية، القنوات الدقيقة، والنانو المسام. وتم التحقق من تكوينات واضحة مترابطة بشكل كامل المسام الكلية (متوسط حجم 320 ميكرون)، القنوات الصغيرة (متوسط قطرها 50 ميكرومتر)، والنانو المسام (متوسط حجم 100 نانومتر) مع المجهر الإلكتروني الماسح (EVO-40؛ ZEISS) وكذلك من خلال التصوير المقطعي الصغيرة.
ويبين الشكل 1 بروتوكولات مفصلة التدريجي في خلق BMT. من خلال مراقبة دقيقة من البروتوكولات من إعداد الإسفنج PU لعملية التكلس (P1 - P7؛ الشكل 1)، والميزات التالية يمكن أن يتحقق: سطح كثيفة للغاية وعلى نحو سلس بعد HA الطلاء والتجفيف. الحجم والشكل بالضبط و3-D القالب. شبكة تربيقية مسامية مترابطة تماما مماثلة لتلك التي من العظام التربيقي. والقنوات الصغرى الطرافةهين كل تربيق التي تحاكي قنوات داخل عظمي مثل القنوات هافيرسية والقنوات فولكمان (أرقام 2 و 3). وعلاوة على ذلك، قوة ميكانيكية عالية نسبيا (~ 3.8 ميجا باسكال) مماثلة لتلك التي من العظام تربيقية البشري وقد تم قياس من خلال اختبار قوة الضغط. وأكدت المعلمات القياس النسيجي مماثلة إلى حد كبير مع تلك الفقرات القطنية البشري فقرات العظام التربيقي عن طريق تحليل CT الدقيقة 12. وقد أثبتت مقادير مختلفة من العمل الشعري من خلال أقطار الشعرية المختلفة في الشكل (4) استخدام المحاكاة الحاسوبية. من خلال هذه المحاكاة، ونحن المتوقع أن BMT سوف تظهر متفاوتة معدلات الاستيعاب داخل المسام الابتدائية (300-400 ميكرون)، والقنوات الدقيقة (25-70 ميكرون) استنادا إلى الأقطار. الشعيرات الدموية الصغيرة أظهرت قدرات امتصاص أقوى. تم التحقق من هذه الفرضية في هذه التجربة كما هو مبين في الشكل (5).
وBMT عرضت فعالة للغايةامتصاص السوائل واحتباس خلال العمل الشعري من الهياكل الدقيقة القناة؛ وقد استخدم صمة عار الزرقاء stevenel باعتبارها وسيلة السائل بسهولة تتبع تدفق (الشكل 5). على أساس المحاكاة الحاسوبية، كان ينظر إلى BMT مع هذه التكوينات على استيعاب وتعليق خلية الاحتفاظ يصل إلى 8.5 سم في المسافة الإجمالية في غضون 10 ثانية. نتيجة لعمل شعري قوي الناجمة عن الهياكل الداخلية، بلغ المتوسط الملون الطرف المقابل من 3 سم (الطول) × 4 سم (طول) × 1 سم (العرض) قالب على شكل جسر في حدود 1 دقيقة و 40 ثانية. وعلاوة على ذلك، لوحظ وتعبئة الخلية النشطة وإدماجها في BMT (الشكل 6). وفي وقت لاحق، أسفرت تعبئة خلية متجانسة والتعلق في تعزيز انتشار وتشكيل مصفوفة في تشكيل موزعة بالتساوي. وعلاوة على ذلك، تم التحقق من صحة مسافات طويلة (~ 10 سم) هجرة الخلايا من خلال BMT فور مشبعة BMT مع تعليق الخلية. SE خلايا eded نجا في قطاع القالب الذي تعرض للهواء وليس منغمسين في ثقافة المتوسط. في هذه التجربة، وقدمت مستنبت إلى الخلايا عن طريق حصرا في الآبار لمس فقط الساقين من السقالة. عمل شعري التي أظهرتها و microchannels ثم سمح لمتوسطة جديدة للوصول إلى القمة، جزء من جسر السقالة. بعد 3 أيام من الثقافة، وأصبح القالب المحتلة مع الخلايا المتكاثرة بشكل سريع. بعد 7 أيام من الثقافة، وكانت ملفوفة كل تربيق بواسطة مصفوفات الخلوية اضافية وجزءا لا يتجزأ من بخلايا 13.
الشكل 1. تشبه العظام عموما بروتوكول قالب تلفيق من قبل معاملة بو الإسفنج (P1) إلى المعالجة الحرارية النهائية (P7). حفظ الملف الشخصى تلبد الدقيق بعد P7 أمر بالغ الأهمية في تحقيق القوة الميكانيكية مواتية.و = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig1large.jpg" الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
. الرقم 2 المجهر ستيريو ممثل (AmScope، SM-2TZ-M) وصور (X4) من 80 نقطة في البوصة الحجم بو الإسفنج (يسار)، HA المغلفة وتجفيفها BMT (وسط)، ومتكلس BMT (يمين) (البعد: 3. سم في الطول × 4 سم في الطول × 1 سم في العرض). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. SEM والصغرى CT صور قالب الاحيائية: (A) صورة شاملة للقالب الاحيائية،
. الشكل 4. حساب الحاسوبية من عمل شعري بأقطار قناة مختلفة في غضون نفس الفترة الزمنية (0.4 مللي ثانية)، في حين أن أكبر الشعرية (د = 300 ميكرون: يشير إلى الابتدائية المسام) استوعبت المتوسطة (الأزرق) تصل إلى 0.16 مم ارتفاع، أصغر الشعرية (د = 30 ميكرون: يشير إلى قناة الصغرى) استوعبت المتوسطة تصل إلى 0،415 ملم في الطول. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. وأظهرت صور الاختلاف في قدرات الاستيعاب من عمل شعري يعتمد على أحجام مختلفة من المسام الابتدائية والقنوات الصغيرة (حجم المسام الأساسي يشير إلى متوسط قطرها: 60 نقطة في البوصة ≈ 470 ميكرون، و 80 نقطة في البوصة ≈ 320 ميكرون، 100 نقطة في البوصة ≈ 200 ميكرون)، والخطوط الصفراء تمثل عمل شعري الناجم عن مزيج من المسام الابتدائية والقنوات الصغرى. الخطوط الحمراء تمثل عمل شعري الناجمة عن أساسا القنوات الصغيرة عرضت في كل تربيق. كما هو مبين في (F)، القالب 100 نقطة في البوصة يسببها أقوى العمل الشعري، مما أدى إلى تشبع كامل للقالب ضمن 39 ثانية. تم اختبار القوالب 80 نقطة في البوصة و 60 نقطة في البوصة بعد ذلك. (B) 0 ثانية، (C) 0.5 ثانية، (D) 1.5 ثانية، (E) 17.0 ثانية، (F) 39،0 ثانية، (G) 50.0 ثانية، و(H) 1 دقيقة 18 ثانية بعد الغمر. (البعد قالب: 1سم × 1 سم × 4 سم في الطول مكعبي الشكل). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 6. الدخول والهجرة من الخلايا من الآبار المصنفة (الجزء الأول) إلى الآبار غير المصنف (الجزء الخامس) من خلال القوالب الاحيائية الناجمة عن عمل شعري، وبلغت الخلايا المصنفة في البداية نهاية الساق غير المصنف (الجزء الخامس) على الفور بعد التشبع الكامل. بعد 3 أيام، وكان التقاء الخلايا واضحا في جميع أنحاء القالب بأكمله. بعد 7 أيام، وقع الزمانية المكانية تشكيل الكولاجين مصفوفة داخل السكان الخلية (H & E صمة عار). (البعد قالب: 3 سم في الطول × 4 سم في الطول × 1 سم في العرض). الرجاء CLإك هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
وهناك حاجة إلى قالب مكون متعددة بما في ذلك الخلايا، وعوامل النمو، والمغذيات، وغيرها من أجل نجاح تجديد وترميم العظام وظيفية من عيوب العظام الكبيرة الحرجة الحجم. ضمن هذه العوامل والخصائص البيولوجية المطابقة تشريحيا ضرورية. لإنجاز وظائف بيولوجية، يجب أن القالب يحمل توافق مع الحياة، osteoconductivity، السلامة الميكانيكية، مساحة كافية، نسيج السطح المناسب، ووسائل الأكسجين والمغذيات النقل. على المستوى الخلوي، الميزات التالية هي حاسمة خاصة بالنسبة للترميم وظيفية من عيوب العظام الضخمة: اختراق سهل في القالب (التجنيد النشط)، توزيع موحد في جميع أنحاء قالب (الاحتفاظ)، وتسارع انتشار وقابلية عالية (سكن). وأخيرا، وتشكيل لاحق من مصفوفة الخلوية اضافية كبيرة واثار التعبير الجيني حاسمة في العمليات الحيوية الأساسية مثل السريع الأوعية الدموية لتكون العظم الثانية.
لقد تم اقتراح العديد من أنواع مختلفة من البدائل الاصطناعية ليحل محل لصناعة السيارات في / خيفي؛ مخايف ترقيع العظام. ومع ذلك، فإن منظمة سقالة الحالية لا يبدون المكروية الداخلية تحتوي على القنوات الدقيقة والنانو المسام، وبالتالي لا تسهل بنشاط تسلل خلية، والتوزيع، وسكان في عمق البدائل الاصطناعية التي يزيد حجمها عن 10 مم. أنها لا توفر الاشارات الجسدية لريادتها الخلايا بكفاءة، تهاجر بسرعة، وبشكل موحد عميقا في قالب العظام. بدلا من ذلك، التوظيف السلبي محدود من الخلايا يخلق السكان خلية موزعة بالتساوي بين المناطق الخارجية والداخلية للسقالة. وهذا الأمر يزيد ليس فقط التحدي الأولي من الخلايا الوصول إلى اللب الداخلي للقالب ولكن أيضا يعيق تدفق المغذيات وخلية الاتصال مع الطرف الآخر من بديل الاصطناعية. هذا النوع من التوظيف والاستيطان النتائج خلية غير المتكافئة في الخلية دوقد تم زرع eath والعظام غير مكتملة النمو بعد سقالة في الجسم 14،15.
وهكذا، أدخلنا مفهوم العمل الشعري كما جديلة المادية الأولية لمعالجة هذه العقبات. لقد هندستها بدقة القنوات الدقيقة في BMT للحث على العمل الشعري من شأنها أن تشكل قوة سحب الابتدائية مسؤولة عن تجنيد بنشاط خلايا عميقة في BMT.
تقدم تقنية PU الاسفنج طلاء عدة خصائص فريدة من نوعها. أولا، لأنها تتيح لإعداد السهل هياكل تربيقية مسامية تسيطر عليها بشكل جيد، والتي أنفسهم تعتمد على الهياكل قالب محددة مسبقا (أي 80 المسام في قالب بوصة ل300-400 ميكرون). هذا مهم جدا لتحسين حجم المسام لبناء العظم تسلل 15. ثانيا، هذه التقنية تتيح بناء مترابطة القنوات الدقيقة، والتي تمثل دور كبير في تهيئة الخلية نقل 11. ثالثا، هناك قيود تقريبا أي عند استخدام الإسفنج PU من حيث خلق العرف الاشكال والاحجام من القوالب. يمكن للصانع استخدام مقص لالأشكال البسيطة أو حتى محسوب القطع بالليزر لهندستها معقدة. باستخدام هذه التقنيات تسيطر على وجه التحديد، أنشأنا BMT. وقد تم اختيار HA كمادة تبدأ بسبب توافق مع الحياة وعظمي قدرتها 17.
في هذه الدراسة، هناك العديد من الخطوات الهامة التي تحتاج إلى تسليط الضوء عليها. أثناء إعداد الطين HA، إذا كانت درجة الحرارة مرتفعة جدا وسرعة التحريك منخفضة جدا، فإن الطين HA أصبحت عالقة في حواف الجزء السفلي من كوب وتجف. بعد عملية طلاء عندما تطاير HA الطين الزائد، عالية جدا من ضغط الهواء يمكن أن تحدث تشققات على سطح BMT. فمن المهم للحفاظ على ضغط الهواء المنخفض نسبيا للتعبير بشكل صحيح خارج HA الطين الزائد فقط. وأخيرا، الخطوات الثانية والثالثة من عملية التكلسهي الأكثر أهمية (الحرارة 1 درجة مئوية / دقيقة حتى 280 درجة مئوية، والحرارة 0.5 درجة مئوية / دقيقة حتى 400 ° C). في هذا النطاق درجة الحرارة، والاسفنج PU حرق بالكامل في حين أن HA يصبح كثيفا. إذا لم يتم تتابع عن كثب هذا البروتوكول، وسيتم انهار BMT أو انهارت بعد تلبد.
وBMT الموضحة في هذه الدراسة توفر العديد من المزايا. أولا، مترابطة المسام الماكرو (300-400 ميكرون) تحاكي تلك العظام تربيقية البشري وتسمح لتدفق سلس للنخاع العظام. الثانية، وتتألف القوالب من القنوات الدقيقة (25-50 ميكرون) في كل الحاجز التربيقي لتسريع دخول الأولي من خلايا العظام عن طريق عمل شعري. كما أظهرت المحاكاة الحاسوبية باستخدام 13، إذا كان القالب فقط 300 ميكرون المسام (المسام الأولية) وليس microchannels، فإن عمل شعري لا تكون كافية لتشبع الكامل للقالب مع نخاع العظام. وهذا من شأنه خصوصا عقد صحيح عن عيوب كبيرة الحجم التي تتطلب لقوالب حجم الدو. ، ميكرومتر الحجم القنوات المعرض امتصاص السوائل فعالة للغاية، وبالتالي فإننا نتوقع القنوات الصغيرة ليكون المسؤول الأول عن العمل الشعري في دراستنا. ثالثا، BMTs لدينا بشكل استراتيجي النانو المسام. وتشير البيانات من الأدب أن خلايا حساسة خاصة إلى أنماط نانو 18،19. لذا، كنا نتوقع نانو المسام على جدران القنوات الصغيرة أن تلعب دورا في زيادة مرفق الخلية. المسام نانو الحجم (100-400 نانومتر) على سطح الحاجز تربيقية سمح الخلايا لترسيخ يجمد. عموما، أدت الآثار المجتمعة لهذه الهياكل الداخلية ثلاثة في تعزيز تعبئة الخلية والتصاق في جميع أنحاء القالب. ومع ذلك، هناك بعض القيود المفروضة على البروتوكول والخطوات الحاسمة لافتعال BMT الكمال. على سبيل المثال، غالبا ما يكون هناك كمية كبيرة من HA الطين أعد نظرا لصعوبة الحفاظ على اللزوجة متجانسة في حين الطلاء. أيضا هناك قيود في صنعقوالب أكبر من 5 سم 3 في حجم بسبب وقت العمل في حين الطلاء. سمك الطلاء هو الحاسم الذي يختلف اعتمادا على تقنيات للصانع.
وتشير نتائج دراستنا أن BMT قادرة على استيعاب والاحتفاظ الخلايا سوف نقدم المزايا المحتملة على مدى التلاؤم التغييري التقليدي (أو الاصطناعية) السقالات. ويجري النظر في دراسة استطلاعية للتحقق من فوائد BMT في تكون العظم و / أو الأوعية الدموية إلى جانب عوامل النمو المرتبطة العظام. ولذلك، ندعي أن لدينا فريدة من نوعها مميزة BMT سقالة يمكن معالجة العوائق الرئيسية لعدم كفاية نخاع العظام تسلل إلى بنيات تركيبية وغير مكتملة تجديد العظام في عيوب كبيرة.
والهدف النهائي من هذه الدراسة هو تبسيط النموذج الحالي للالهندسة الحيوية في إعادة بناء العظام وترميم وظيفية في العيوب العظمية حاسمة الحجم من خلال القضاء على الحاجة إلى زمني / كثيفة العمالة نخاع العظم سدىخلايا ل العزلة وتوسيع العمليات. وأخيرا، فإننا نهدف إلى الاستفادة تشريحيا المطابقة يبني 3D مع القنوات الصغيرة ومتناهية الصغر المسام، مما يحفز امتصاص السريع الخلية، توزيع متجانس، وسكان لإعادة بناء العظام.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| polyurethan sponge | Plastifoam | PU-3215 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 167176 | |
| Hydroxyapatite Powder | Ossgen | ||
| Polyvinyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 341584 | |
| Carboxymethyl cellulose sodium salt | Sigma-Aldrich | 360384 | |
| ammonium polyacrylate | Vanderbilt | DARVAN 821A | |
| Glycerin | Sigma-Aldrich | G2289 |
References
- Petrie Aronin, E. C., et al. Comparative effects of scaffold pore size, pore volume, and total void volume on cranial bone healing patterns using microsphere-based scaffolds. J Biomed Mater Res A. 89 (3), 632-641 (2009).
- Guzmán, R., et al. Chitosan scaffolds containing calcium phosphate salts and rhBMP-2: in vitro and in vivo testing for bone tissue regeneration. PLoS One. 9 (2), e87149 (1371).
- Cha, J. K., et al. Sinus augmentation using BMP-2 in a bovine hydroxyapatite/collagen carrier in dogs. J Clin Periodontol. 41 (1), 86-93 (2014).
- Karageorgiou, V., Kaplan, D. Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis. Biomaterials. 26 (27), 5474-5491 (2005).
- Fisher, M. B., Mauck, R. L. Tissue engineering and regenerative medicine: recent innovations and the transition to translation. Tissue Eng Part B Rev. 19 (1), 1-13 (2013).
- Manassero, M., et al. Regeneration in Sheep Using Acropora Coral, a Natural Resorbable Scaffold, and Autologous Mesenchymal Stem Cells. Tissue Eng Part A. 19 (13-14), 1554-1563 (2013).
- Reichert, J. C., et al. A tissue engineering solution for segmental defect regeneration in load-bearing long bones. Sci Transl Med. 4 (141), 141ra93 (2012).
- Sachlos, E., Czernuszka, J. T. Making Tissue Engineering Scaffolds Work. Review on The Application of Solid Freeform Fabrication Technology to The Production of Tissue Engineering Scaffolds. Eur Cell Mater. 5, 29-40 (2003).
- Woodard, J. R., et al. The mechanical properties and osteoconductivity of hydroxyapatite bone scaffolds with multi-scale porosity. Biomaterials. 28 (1), 45-54 (2007).
- Correia, C., et al. Acta Biomater. 8 (7), 2483-2492 (2012).
- Wang, H., Li, Y., Zuo, Y., Li, J., Ma, S., Cheng, L. Biocompatibility and osteogenesis of biomimetic nano-hydroxyapatite/polyamide composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 28 (22), 3338-3348 (2007).
- Oh, D. S., et al. Bone marrow absorption and retention properties of engineered scaffolds with micro-channels and nano-pores for tissue engineering: a proof of concept. Ceram Int. 39 (7), 8401-8410 (2013).
- Hong, M. H., Kim, Y. H., Ganbat, D., Kim, D. G., Bae, C. S., Oh, D. S. Capillary action: enrichment of retention and habitation of cells via micro-channeled scaffolds for massive bone defect regeneration.J. Mater Sci Mater Med. 25 (8), 1991-2001 (2014).
- Volkmer, E., et al. Hypoxia in static and dynamic 3D culture systems for tissue engineering of bone. Tissue Eng. Part A. 14 (8), 1331-1340 (2008).
- Malda, J., Klein, T. J., Upton, Z. The roles of hypoxia in the in vitro engineering of tissues. Tissue Eng. 13 (9), 2153-2162 (2007).
- Macchetta, A., Turner, I. G., Bowen, C. R. Fabrication of HA/TCP scaffolds with a graded and porous structure using a camphene-based freeze-casting method. Acta Biomater. 5 (4), 1319-1327 (2009).
- Cox, S. C., Thornby, J. A., Gibbons, G. J., Williams, M. A., Mallick, K. K. 3D printing of porous hydroxyapatite scaffolds intended for use in bone tissue engineering applications. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 47, 237-247 (2015).
- Wan, Y., et al. Adhesion and proliferation of OCT-1 osteoblast-like cells on micro- and nano-scale topography structured poly(l-lactide). Biomaterials. 26 (21), 4453-4459 (2005).
- Zhao, L., Mei, S., Chu, P. K., Zhang, Y., Wu, Z. The influence of hierarchical hybrid micro/nano-textured titanium surface with titania nanotubes on osteoblast functions. Biomaterials. 31 (19), 5072-5082 (2010).
