Abstract
Uten en aktiv, blomstrende cellepopulasjon som er godt fordelt og stabilt forankret til den innsatte malen, ikke eksepsjonell benregenerering ikke forekomme. Med konvensjonelle maler, fravær av interne mikro-kanaler resulterer i mangel på celleinfiltrasjon, distribusjon og inhabitance dypt inne malene. Derfor en svært porøs og jevnt vevd trabekulær-bone-lignende mal med mikro-kanaler (biogene mikro mal; BMT) har blitt utviklet for å håndtere disse hindringene. Romanen BMT ble skapt av innovative konsepter (kapillær handling) og fabrikkert med en svamp-mal belegg teknikk. Den BMT består av flere strukturelle komponenter: sammenhengende primære porer (300-400 mikrometer) som etterligner porene i trabeklære ben, mikro-kanaler (25-70 mm) innenfor hver trabekler og nanopores (100-400 nm) på overflaten slik at cellene til å forankre. Videre har BMT blitt dokumentert av mekanisk test studie for å ha simILAR mekanisk styrkeegenskaper til de av menneskelig trabekulær bein (~ 3,8 MPa) 12.
Den BMT utstilt høy absorpsjon, oppbevaring og bosetting av celler i hele broen formede (II) maler (3 cm høyde og 4 cm lengde). Cellene som i utgangspunktet var sådd i en ende av malene umiddelbart mobilisert til den andre enden (10 cm avstand) ved kapillærvirkning av BMT på cellemediet. Etter 4 timer ble cellene homogent okkupert hele BMT og oppviste normal cellulær oppførsel. Kapillarkrefter sto for infiltrasjon av cellene suspendert i media og distribusjon (aktiv migrasjon) i hele BMT. Etter å ha observert disse egenskapene til BMT anslår vi at BMTS vil absorbere benmargceller, vekstfaktorer og næringsstoffer fra periferien under fysiologiske betingelser.
Den BMT kan løse dagens begrensninger via rask infiltrasjon, homogen distribusjon og inhabitaNCE av celler i store, volumetriske maler for å reparere massive skjelettskader.
Protocol
1. Polyuretan (PU) Sponge Forberedelse som mal
- Bruk PU svamper å produsere hydroksyapatitt maler inneholder sammenhengende porer. Bruk hver svamp for å tilveiebringe den primære trabeculae for dannelsen av malen stagene samt dannelsen av mikro-kanaler innenfor trabeculae.
- Skjær og trim 80 ppi (porer pr tomme) svamper i 2 bro-former med dimensjoner på 3,5 cm i høyde x 5 cm i lengde x 1,5 cm i bredde.
Merk: De dimensjoner og former kan velges i henhold til det ønskede primære porestørrelse: 100 ppi, 80 ppi, og 60 ppi. - Foreta en 100 ml 4% (w / v) NaOH-løsning ved bruk av et 150 ml begerglass; deretter fordype og klem til de preparerte svampene er helt gjennomvåt.
- Etter soaking, plasserer begeret med svamper i ultrasonicator (42 kHz).
- Ultralyd pre-behandle PU svamper for 15-20 minutter uten varme for å modifisere overflateegenskaper.
- Skyll med destillertvann i 5-10 min. Mens skylling, klem svampene og tillate dem å utvide 5 til 7 ganger for å fjerne rest NaOH inni svampene.
- Klem svamper med papirhåndklær for å fjerne overflødig vann; og deretter tørke dem i en ovn ved 60-80 ° C.
2. hydroksyapatitt (HA) Slurry Forberedelse til Coating
- Før vi gjør HA slurry, å måle vekten av et beger med en magnetisk rørestav. Denne målingen vil bli brukt til å beregne pulver / væske-forhold.
- Mål 10 g av nano-størrelse HA pulver.
- Tilsett 20 ml destillert vann i 50 ml begerglass. Varme til 120-140 ° C og rør ved hjelp av en varm plate magnetrører.
- Legg 0,3 g (3% w / w) av polyvinylalkohol (PVA) (89,000-98,000 MW) per-pulver i destillert vann under omrøring ved 300-400 rpm.
- Rør til PVA er helt oppløst. Oppløsningen skal være klar etter fullstendig oppløsning av PVA.
- Slå off varmen og tilsett 0,1 g (1% vekt / vekt) av natriumkarboksymetylcellulose (CMC) (ultra-lav viskositet) for pulver under omrøring ved 400-500 rpm. Oppløsningen skal være klar etter fullstendig oppløsning av PVA.
- Rør til CMC er helt oppløst og avkjøles til romtemperatur.
- Legg 0,3 g (3% w / w) av ammonium-polyakrylat dispergeringsmiddel per-pulver under omrøring ved 300-400 rpm. Rør til det er helt oppløst.
- Legg 0,2 g (2% w / w) glyserol pr pulver under omrøring ved 300-400 rpm. Rør til det er helt oppløst.
- Sakte dispergere HA pulveret i oppløsningen under omrøring ved 600-900 rpm og holde omrøring i 5 min.
- Sonikere i 5 min ved bruk av en ultrasonicator for å sikre dispersjon av enhver agglomerering av HA-pulver.
- Legg til en ekstra 5 ml destillert vann i blandingen under omrøring ved 600-900 rpm og varme ved 90-100 ° C.
- Hold omrøring av blandingen ved hjelp av en magnetrører ved 600 til 800 rpm ved 90 til 100 ° C i order for å fordampe vanninnholdet.
- Mål den hele vekt inklusive begerglass og blandingen fra tid til annen, inntil en pulver / væske-forhold på 1,75 til 1,8 oppnås.
- Formatering av pulver / væske-forholdet, dele vekten av pulveret med den totale vekten av blandingen (2,14), omfattende pulver, reagenser, og vann, minus vekten av begeret og rører (2,1), og minus HA-pulver (2.2).
Merk: For eksempel: Hvis A (hele blandingen herunder pulver, reagenser, og vann) er 49,05 g, B (beger med røre) er 33,5 g, og deretter C (HA pulver) er 10 g.
C / (ABC) = 10 / (49.05-33.5-10) = 1,80 - Tillat oppslemmingen å avkjøles til romtemperatur før bruk for belegging.
3. HA belegg, tørking og sintring
- Coat de fremstilte PU svamper med HA belegningsoppslemming ved hjelp av en rustfri spatel inntil oppslemmingen er homogent fordelt i hele PU svampen på en glassplate.
Merk: Når du har fjernet overflødig Nedsmeltingry, noen av porene, kan fortsatt bli tilstoppet med slurry på grunn av den høye viskositet slurry. - For å sikre tilkoblinger, ensartethet, og åpne porer, noe blåse HA belagte maler ved hjelp av en luftkompressor. Denne prosessen sikrer at malene er homogent belegges både på de innvendige og utvendige overflater av PU svamp.
Merk: Hvis en homogen belegget ikke er oppnådd, vil HA belagt maler kollapse under sintringsprosessen og kan også sprekke ved håndtering på grunn av lav mekanisk styrke. I tillegg er den homogene belegg kritisk for å skape mikrokanaler i trabeculae. - Tørk de belagte HA malene i minst 5 timer under kjølebetingelser (20-25 ° C) med svak luftsirkulasjon. Imidlertid forlenge tørketiden basert på størrelsen av malen.
Merk: Etter tørking vil de belagte HA malene vanligvis krympe omtrent 8% til 10% i hver dimensjon. - Etter tørkeprosessen, plasserer HAbelagte maler på en aluminadigel. Deretter plasserer dem i en høy temperatur ovn og bruker følgende åtte trinn sintring profil.
- Varme 2 ° C / min til 230 ° C.
- Varme 1 ° C / min til 280 ° C.
- Varme 0,5 ° C / min til 400 ° C.
- Heat 3 ° C / min til 600 ° C. Hold ved 600 ° C i 1 time.
- Varme 5 ° C / min til 1230 ° C. Hold 1230 ° C i 3 timer.
- Avkjøl 5 ° C / min til RT.
Merk: Sintring vil ytterligere krympe HA belagt svamp maler med ca 22% - 25% i hver dimensjon.
4. Ingress og inhabitancy av celler til Mal
- Kultur forhånds osteoblastiske MC3T3-celler i et ikke-osteogene media bestående av α-MEM, supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% antibiotika (streptomycin og penicillin) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO 2 .
- Tilsett 10 mlav en cellesuspensjon på 2 x 10 6 celletetthet i en enkelt brønn i en 6-brønns plate.
- Plasser 3 cm x 4 cm x 1 cm bro formede templat vertikalt ned i 6-brønns plate. Plasser den ene delen av malen inn i platen inneholdende cellesuspensjonen, og det andre ben inn i en tilgrensende tomt godt.
- Tillat malen til å absorbere cellesuspensjonen i 10 min.
- Tilsett 5 ml av mediet deretter til brønnen som opprinnelig ble fylt med cellesuspensjonen.
- Fylle medium i begge brønnene hver 2 eller 3 dager til 7 dager er gått.
- Bestemme effektiviteten av celle mobilitet av hematoxylin og eosin-farging 11.
- Fest celler og stillas ved å dyppe i 100% EtOH for 20-30 min.
- Flekken med Hematoxylin for 1-2 min.
- Skyll med destillert vann i 1-2 min for to ganger.
- Dehydrere ved nedsenking i 70%, deretter 95%, deretter 100% EtOH i 1-2 min hver.
- Flekken med eosin for 20-30 sek.
- Skyll med destillert vann i 12 minutter for to ganger.
- Dehydrere ved nedsenking i 70%, 80%, 90% og 100% EtOH i 1-2 min hver.
- Embed stillaset i en akryl harpiks for seksjonering og bildebehandling.
- Bestemme cellenes levedyktighet med 3- [4,5-dimetyltiazol-2-yl] -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT) celleviabilitet assay og levende / døde assay (Live / død celle farging kit MPTP) ved tidspunktet punkter på dag 3 og 7 11.
Merk: Ordningen med bein-lignende mal fabrikasjon protokoller er representert i "Representative Results" session.
Representative Results
Den overordnede strukturen i BMT viser en unik tredimensjonal mal med trabeklære ben lignende interne strukturer. Den BMT inneholder makroporer, mikro-kanaler, og nanoporer. Klare konfigurasjoner av fullstendig sammenkoplede makroporer (gjennomsnittlig størrelse på 320 um), mikro-kanaler (gjennomsnittlig diameter på 50 mikron), og nano porer (gjennomsnittlig størrelse på 100 nm) ble bekreftet med et scanning elektronmikroskop (EVO-40; ZEISS) samt gjennom mikro-tomografi.
Figur 1 viser trinnvis detaljerte protokoller for å skape en BMT. Gjennom presis kontroll av protokollene fra fremstilling av PU-svamper til sintringsprosessen (P1 - P7; figur 1), kan de følgende egenskaper oppnås: en meget tett og glatt overflate etter HA belegging og tørking; en nøyaktig formet og dimensjonert for 3-D-mal; en fullstendig sammenkoplet porøst trabekulære nettverk lik den i trabekulært ben; og mikro-kanaler viddhin hver trabekler som etterligner intra-ossøs kanaler som Haversian kanalene og Volkmann kanalene (figur 2 og 3). Videre er relativt høy mekanisk styrke (~ 3,8 MPa) lik den til human trabekulært ben ble målt ved hjelp av en trykkfasthet test. Meget lignende histomorphometric parametre med de av menneskelig lumbalvirvel trabeklære ben ble bekreftet av mikro-CT-analyse 12. Ulike størrelser av kapillarvirkning ble demonstrert gjennom ulike kapillære diametre i Figur 4 bruker beregnings simulering. Gjennom disse simuleringene, vi anslått at BMT ville utvise varierende absorpsjon priser innen primær-porer (300-400 mm) og mikrokanaler (25-70 mikrometer) basert på diameter. Mindre blodkar utstilt sterkere absorpsjon kapasiteter. Denne antagelse ble bekreftet i dette forsøk som vist i figur 5.
Den BMT utstilt svært effektivefluid absorpsjon og retensjon gjennom kapillære virkningen av mikro-kanalstrukturer; stevenel blå flekk ble anvendt som det flytende medium for å enkelt spore strømmen (figur 5). Basert på beregningsorientert simulering, ble den BMT med disse konfigurasjonene sett til å absorbere og beholde cellesuspensjoner opp til 8,5 cm i total distanse innen 10 sek. På grunn av en sterk kapillarvirkning indusert av interne strukturer, farget medium nådd den motsatte ende av et 3 cm (høyde) x 4 cm (lengde) x 1 cm (bredde) bro-formet smal inne i 1 min og 40 sek. Videre ble aktivert cellemobilisering og innlemmelse i BMT observert (figur 6). Deretter ble det homogene cellemobilisering og feste resulterte i forbedret spredning og matrisedannelse i en jevnt fordelt formasjon. Dessuten ble langdistanse (~ 10 cm) migrering av celler gjennom BMT validert umiddelbart etter BMT ble mettet med cellesuspensjonen. Se erD cEDED celler overlevde i malen segment som ble eksponert for luft og ikke er nedsenket i dyrkingsmediet. I dette eksperimentet, ble kulturmediet gitt til cellene ved utelukkende i brønnene rørende bare ben av stillaset. Kapillarvirkningen utstilt av microchannels deretter tillatt for friskt medium for å nå toppen, bropartiet av stillaset. Etter 3 dager med kultur, ble malen opptatt med raskt prolifererende celler. Etter 7 dager med kultur, ble hver trabekler innpakket av ekstra cellulære matriser og embedded med celler 13.
Figur 1. Den samlede benlignende mal fabrikasjon protokollen fra forbehandling av PU svamp (P1) til den endelige varmebehandling (P7). Holde nøyaktige sintringsprofilen etter P7 er avgjørende for å oppnå gunstige mekaniske styrke.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
. Figur 2 Representant stereo mikroskop (AmScope; SM-2TZ-M) bilder (x4) av en 80 ppi størrelse PU svamp (til venstre), HA belagt og tørket BMT (midten), og sintret BMT (høyre) (Dimension: 3. cm i høyde x 4 cm i lengde x 1 cm i bredden). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. SEM og mikro-CT-bilder av en biogene mal: (A) en samlet bilde av en biogene mal,
. Figur 4. Beregnings beregning av kapillærvirkning med forskjellige kanal diametre innen samme tidsperiode (0,4 ms), mens den største kapillær (d = 300 um: refererer til primær-pore) absorberes mediet (blå) opp til 0,16 mm i høyde, den minste kapillære (d = 30 mikrometer: refererer til mikro-kanal) absorbert mediet opp til 0,415 mm i høyden. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Bildene viste forskjeller i absorpsjons-egenskapene til kapillær virkning basert på forskjellige størrelser av primærporene og mikro-kanaler (primær-porestørrelse refererer til det midlere diameter: 60 ppi ≈ 470 um, 80 ppi ≈ 320 um, 100 ppi ≈ 200 um). De gule linjene representerer kapillarvirkning indusert ved en kombinasjon av primære porer og mikrokanaler. De røde linjene representerer Kapillarkrefter indusert av hovedsakelig mikro-kanaler utstilt i hvert trabekler. Som vist i (F), 100 ppi malen indusert sterkest kapillarvirkningen, som resulterer i fullstendig metning av malen innen 39 sek. De 80 ppi og 60 ppi maler ble testet etterpå. (B) 0 sek, (C) 0,5 sek, (D) 1,5 sek, (E) 17,0 sek, (F) 39,0 sek, (G) 50,0 sek, og (H) 1 min 18 sek etter neddykking. (Mal dimensjon: 1cm x 1 cm x 4 cm i høyden cuboidal). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. inntrengning og migrasjon av celler fra seeded brønnene (del I) for å uanriket brønner (del V) gjennom biogene malene indusert ved kapillærvirkning. De opprinnelig sådd cellene nådde enden av uanriket benet (del V) umiddelbart etter fulle metning. Etter 3 dager, samløpet av cellene var tydelig gjennom hele malen. Etter 7 dager spatiotemporal kollagen matrisedannelse oppsto i løpet av de cellepopulasjoner (H & E farging). (Dimensjon Mal: 3 cm i høyde x 4 cm i lengde x 1 cm i bredden). Vennligst click her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
En flerkomponent mal inkludert celler, vekstfaktorer, næringsmidler, etc. er nødvendig for vellykket benregenerering og funksjonell restaurering av kritiske størrelse større bendefekter. Innenfor disse faktorene, anatomisk Conforming biologiske egenskaper er avgjørende. For å oppnå biologisk funksjon, må malen oppvise biokompatibilitet, osteoconductivity, mekanisk integritet, tilstrekkelig overflateareal, tilstrekkelig overflatestruktur, og midlene for oksygen og nærings transport. På cellenivå, er følgende funksjoner er spesielt viktig for funksjonelle restaurering av massive bein defekter: tilrettelagt inntrengning i malen (aktiv rekruttering), jevn fordeling over hele malen (oppbevaring), akselerert spredning og høy levedyktighet (bolig). Til slutt, den etterfølgende dannelse av betydelige ekstra cellulær matrix, og utløsning av genekspresjon er avgjørende viktige biologiske prosesser, slik som en hurtig vaskulariseringnd osteogenesis.
Mange forskjellige typer syntetiske substitutter har vært foreslått å erstatte auto- / allo- bein grafts. Men den nåværende stillaset organisasjonen ikke viser en intern mikromiljø som inneholder mikrokanaler og nano-porene, og derfor ikke aktivt lette celleinfiltrasjon, distribusjon og inhabitance dypt inn i syntetiske erstatninger som er større enn 10 mm. De gir ikke fysiske signaler for banebrytende celler til effektivt, raskt og jevnt migrere dypt inn i beinet mal. I stedet, den begrensede passive rekruttering av celler som danner en ujevnt fordelt cellepopulasjoner mellom de ytre og indre deler av stillaset. Dette forverrer ikke bare den innledende utfordringen av cellene nådde den indre kjerne av malen, men også hindrer næringsflyt og celle-kommunikasjon med den andre enden av det syntetiske erstatning. Denne typen uforholdsmessig celle rekruttering og bosetting resultater i celle dEath og ufullstendig benvekst etter at stillaset er implantert i kroppen 14,15.
Derfor har vi innført begrepet Kapillarkrefter som den primære fysiske kø for å løse disse hindringene. Vi har grundig utviklet mikrokanaler i BMT å indusere kapillærvirkningen som vil stå for den primære dregging kraft ansvarlig for aktivt å rekruttere celler dypt inn i BMT.
PU svamp belegningsteknikk presenterer flere unike egenskaper. Først gir det mulighet for en enkel tilberedning av velkontrollerte porøse trabekulære strukturer, som selv er avhengig av de forhåndsdefinerte mal strukturer (dvs. 80 pore per inch mal for 300-400 nm). Dette er svært viktig for å optimalisere porestørrelse for osteoblast infiltrasjon 15. For det andre gjør teknikken bygging av sammenhengende mikro-kanaler, som står for den betydelige rolle initialisering celle flytting 11. For det tredje, det er nesten ingen begrensninger når du bruker PU svamp når det gjelder å lage tilpassede former og størrelser av malene. Maker kan bruke en saks for enkle figurer eller beregnede laserskjæring for komplekse geometrier. Ved hjelp av disse nøyaktig kontrollerte teknologier, skapte vi BMT. HA ble valgt som utgangsmateriale på grunn av dets biokompatibilitet og osteoconductive kapasitet 17.
I denne studien er det flere viktige skritt som må markeres. Under HA slurry preparatet, hvis temperaturen er for høy, og omrøringshastigheten er for lav, vil HA oppslemmingen bli sittende fast på den nedre kanten av begeret og tørke opp. Etter belegningsprosessen ved å blåse ut det overskytende slurry HA, kan for høy for et lufttrykk indusere sprekker på overflaten av BMT. Det er viktig å holde lufttrykket forholdsvis lav til riktig lufte ut overskytende HA oppslemmingen bare. Til slutt, det andre og tredje trinn i sintringsprosessener mest avgjørende (Heat 1 ° C / min til 280 ° C og varme 0,5 ° C / min til 400 ° C). I dette temperaturområdet vil PU svampen fullstendig forbrent, mens HA blir tett. Hvis denne protokollen ikke er tett fulgt, vil BMT bli kollapset eller smuldret etter sintring.
Den BMT er beskrevet i denne studien har flere fordeler. For det første inter-forbundet makroporer (300-400 um) etterligne de av human trabekulært ben og gir jevn benmarg flyt. For det andre er malene består av mikro-kanaler (25-50 um) i hver trabekulært septum til å akselerere den første inntrengning av benceller via kapillarvirkning. Som vist ved hjelp av beregnings simulering 13, hvis malen hadde bare 300 um porer (primære porene) og ingen mikrokanaler, vil kapillarvirkningen være utilstrekkelig for fullstendig metning av malen med benmargen. Dette vil spesielt gjelder for store størrelse defekter som ville kreve large størrelse maler. Mikrometerstore kanaler utstillings svært effektiv væskeopptaket, og dermed vi forventet mikrokanaler for å være hovedansvarlig for kapillærvirkningen i vår studie. For det tredje har våre BMTS strategisk plassert nano-porene. Data fra litteraturen indikerer at celler er spesielt følsomme for nano mønstre 18,19; derfor forventet vi at nano porer på veggene av mikro-kanaler for å spille en rolle i å øke cellefesting. Nano-størrelse porer (100-400 nm) på overflaten av den trabeklære septa tillatt immobiliserte celler til ankeret. Alt i alt, de kombinerte virkninger av disse tre indre strukturer resulterte i forbedret celle-mobilisering og adhesjon gjennom malen. Det er imidlertid noen begrensninger i protokollen og de kritiske trinn å dikte den perfekte BMT. For eksempel, er det ofte en stor mengde HA velling fremstilt på grunn av vanskelighetene med å holde en homogen viskositet mens belegg. Også er det en begrensning i å gjøremaler større enn 5 cm 3 i volum som følge av arbeidstiden, mens belegget. Beleggtykkelsen er kritisk som varierer avhengig av maker teknikker.
Resultatene av vår studie antyder at BMT istand til å absorbere og holde på celler vil gi potensielle fordeler fremfor konvensjonelle alloplastic (eller syntetisk) stillaser. En prospektiv studie blir vurdert å verifisere fordelene ved BMT på osteogenesis og / eller angiogenese sammen med bein relaterte vekstfaktorer. Derfor hevder vi at vår unike kjennetegnet BMT stillaset kan adressere de store barrierene av utilstrekkelig benmarg infiltrasjon i de syntetiske konstruerer og ufullstendig benregenerering i store defekter.
Det endelige målet med denne studien er å forenkle den nåværende paradigme bioteknologi i bein gjenoppbygging og funksjonelle restaurering i kritisk store beinskader ved å eliminere behovet for tids- / arbeidskrevende benmarg stromal celler isolasjon og ekspansjonsprosesser. Til slutt tar vi sikte på å utnytte anatomisk konform 3D-konstruksjoner med mikro-kanaler og nanoporer, som induserer raske celle absorpsjon, homogen distribusjon, og inhabitance for rekonstruksjon av bein.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| polyurethan sponge | Plastifoam | PU-3215 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 167176 | |
| Hydroxyapatite Powder | Ossgen | ||
| Polyvinyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 341584 | |
| Carboxymethyl cellulose sodium salt | Sigma-Aldrich | 360384 | |
| ammonium polyacrylate | Vanderbilt | DARVAN 821A | |
| Glycerin | Sigma-Aldrich | G2289 |
References
- Petrie Aronin, E. C., et al. Comparative effects of scaffold pore size, pore volume, and total void volume on cranial bone healing patterns using microsphere-based scaffolds. J Biomed Mater Res A. 89 (3), 632-641 (2009).
- Guzmán, R., et al. Chitosan scaffolds containing calcium phosphate salts and rhBMP-2: in vitro and in vivo testing for bone tissue regeneration. PLoS One. 9 (2), e87149 (1371).
- Cha, J. K., et al. Sinus augmentation using BMP-2 in a bovine hydroxyapatite/collagen carrier in dogs. J Clin Periodontol. 41 (1), 86-93 (2014).
- Karageorgiou, V., Kaplan, D. Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis. Biomaterials. 26 (27), 5474-5491 (2005).
- Fisher, M. B., Mauck, R. L. Tissue engineering and regenerative medicine: recent innovations and the transition to translation. Tissue Eng Part B Rev. 19 (1), 1-13 (2013).
- Manassero, M., et al. Regeneration in Sheep Using Acropora Coral, a Natural Resorbable Scaffold, and Autologous Mesenchymal Stem Cells. Tissue Eng Part A. 19 (13-14), 1554-1563 (2013).
- Reichert, J. C., et al. A tissue engineering solution for segmental defect regeneration in load-bearing long bones. Sci Transl Med. 4 (141), 141ra93 (2012).
- Sachlos, E., Czernuszka, J. T. Making Tissue Engineering Scaffolds Work. Review on The Application of Solid Freeform Fabrication Technology to The Production of Tissue Engineering Scaffolds. Eur Cell Mater. 5, 29-40 (2003).
- Woodard, J. R., et al. The mechanical properties and osteoconductivity of hydroxyapatite bone scaffolds with multi-scale porosity. Biomaterials. 28 (1), 45-54 (2007).
- Correia, C., et al. Acta Biomater. 8 (7), 2483-2492 (2012).
- Wang, H., Li, Y., Zuo, Y., Li, J., Ma, S., Cheng, L. Biocompatibility and osteogenesis of biomimetic nano-hydroxyapatite/polyamide composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 28 (22), 3338-3348 (2007).
- Oh, D. S., et al. Bone marrow absorption and retention properties of engineered scaffolds with micro-channels and nano-pores for tissue engineering: a proof of concept. Ceram Int. 39 (7), 8401-8410 (2013).
- Hong, M. H., Kim, Y. H., Ganbat, D., Kim, D. G., Bae, C. S., Oh, D. S. Capillary action: enrichment of retention and habitation of cells via micro-channeled scaffolds for massive bone defect regeneration.J. Mater Sci Mater Med. 25 (8), 1991-2001 (2014).
- Volkmer, E., et al. Hypoxia in static and dynamic 3D culture systems for tissue engineering of bone. Tissue Eng. Part A. 14 (8), 1331-1340 (2008).
- Malda, J., Klein, T. J., Upton, Z. The roles of hypoxia in the in vitro engineering of tissues. Tissue Eng. 13 (9), 2153-2162 (2007).
- Macchetta, A., Turner, I. G., Bowen, C. R. Fabrication of HA/TCP scaffolds with a graded and porous structure using a camphene-based freeze-casting method. Acta Biomater. 5 (4), 1319-1327 (2009).
- Cox, S. C., Thornby, J. A., Gibbons, G. J., Williams, M. A., Mallick, K. K. 3D printing of porous hydroxyapatite scaffolds intended for use in bone tissue engineering applications. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 47, 237-247 (2015).
- Wan, Y., et al. Adhesion and proliferation of OCT-1 osteoblast-like cells on micro- and nano-scale topography structured poly(l-lactide). Biomaterials. 26 (21), 4453-4459 (2005).
- Zhao, L., Mei, S., Chu, P. K., Zhang, Y., Wu, Z. The influence of hierarchical hybrid micro/nano-textured titanium surface with titania nanotubes on osteoblast functions. Biomaterials. 31 (19), 5072-5082 (2010).
