Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

मूल्यांकन सेल Mechanosensing और Durotaxis के लिए एक सरल प्रणाली Published: August 27, 2015 doi: 10.3791/52949
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cell & Developmental Biology, SUNY Upstate Medical University

Abstract

बाह्य मैट्रिक्स की संरचना और यांत्रिक गुणों प्रकार के ऊतकों के बीच अत्यधिक चर रहे हैं। यह संयोजी ऊतक बहुत स्ट्रोमा विविधता प्रभावों सेल व्यवहार सेल प्रसार, भेदभाव, आसंजन संकेतन और दिशात्मक प्रवास सहित सामान्य और वैकृत प्रक्रियाओं को विनियमित करने के लिए। इस संबंध में कुछ प्रकार की कोशिकाओं की जन्मजात क्षमता durotaxis के रूप में जाना जाता है एक stiffer, या कम से शिकायत मैट्रिक्स सब्सट्रेट की ओर पलायन करने के लिए। इस घटना भ्रूण विकास, घाव की मरम्मत और कैंसर सेल आक्रमण के दौरान एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यहाँ, हम polydimethylsiloxane (PDMS) substrates का उपयोग, इन विट्रो में, durotaxis अध्ययन करने के लिए एक सीधा परख का वर्णन है। कक्षों durotaxis वर्णित की तैयारी अपेक्षाकृत नरम PDMS जेल और एक कठोर कांच coverslip के बीच एक कठोरता इंटरफेस बनाता है। दिए गए उदाहरण में, हम Cdc42 के लिए एक भूमिका का प्रदर्शन करने के लिए इन durotaxis कक्षों का इस्तेमाल किया है / Rac1 GTPase को सक्रिय protecdGAP में, mechanosensing और मानव U2OS ऑस्टियो सार्कोमा कोशिकाओं में durotaxis नियमन में। इस परख mechanosignaling और durotaxis में उनके संबंधित भूमिकाओं का पता लगाने के लिए अन्य प्रकार की कोशिकाओं और / या हितों के अन्य प्रोटीन की पछाड़ना के लिए आसानी से अनुकूल है।

Introduction

बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) कोलेजन, फ़ाइब्रोनेक्टिन और laminin सहित संरचनात्मक और तिर्यक प्रोटीन की एक जटिल सरणी के शामिल है। यह अच्छी तरह से ईसीएम सेलुलर ऊतकों के लिए महत्वपूर्ण संरचनात्मक सहायता प्रदान करता है कि स्थापित किया जाता है, कोशिकाओं को सक्रिय सेल अस्तित्व, भेदभाव और सेल प्रवास सहित विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं को विनियमित करने के लिए उनके ईसीएम वातावरण में भौतिक परिवर्तनों का जवाब संकेत मिलता है कि बढ़ती हुई सबूत नहीं है। कड़ी (~ 25 किलो पास्कल) substrates osteogenic भेदभाव 1 को बढ़ावा देने, जबकि उदाहरण के लिए, ईसीएम की कठोरता में मतभेद मुलायम substrates (~ 1 किलो पास्कल) तंत्रिकाजन्य प्रजातियों को बढ़ावा देने के साथ, अलग-अलग प्रजातियों के प्रति mesenchymal स्टेम सेल ड्राइव कर सकते हैं। इसी तरह, स्ट्रोमल मैट्रिक्स कठोरता में वृद्धि आसपास के ऊतकों 2,3 में स्तन उपकला कोशिका tumorigenesis और आक्रमण को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है।

इस mechanosign का एक विशेष रूप से दिलचस्प पहलूकोशिकाओं को एक और अधिक कठोर सब्सट्रेट 4,5 की ओर अधिमान्यतया विस्थापित जिसमें durotaxis, के रूप में जाना जाता प्रक्रिया में Aling गतिविधि का परिणाम है। कोशिकाओं को लगातार ईसीएम के लिए बाध्य इंटीग्रिन रिसेप्टर के माध्यम से अपने बाह्य वातावरण की शारीरिक विशेषताओं भावना। यह, बारी में, फोकल adhesions या फोकल संपर्कों 6.7 रूप में जाना जाता चिपकने वाला संरचनाओं के गठन ड्राइव करने के लिए उनकी साइटोप्लास्मिक डोमेन के लिए कई संरचनात्मक और संकेत प्रोटीन का संचय को बढ़ावा देता है। Integrins कोई निहित enzymatic गतिविधि है, संकेतों उनके बदलते पर्यावरण से 8 सेल की प्रतिक्रिया समन्वय स्थापित करने के लिए इन गौण प्रोटीन के माध्यम से ईसीएम से रिले किया जाता है। तदनुसार, mechanosignaling और durotaxis विनियमन में शामिल प्रमुख प्रोटीनों की पहचान और लक्षण वर्णन जांच का एक महत्वपूर्ण क्षेत्र है।

विभिन्न मॉडल प्रणाली durotaxis इन विट्रो अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है, लेकिन सबसे ज्यादा हैउपयोग किया कोलेजन लेपित polyacrylamide substrates के 4। हालांकि, polyacrylamide substrates की तैयारी तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है और इन assays में इस्तेमाल कोलेजन सब्सट्रेट से 9 रासायनिक Crosslinked होना चाहिए। Polydimethylsiloxane (PDMS) substrates polyacrylamide substrates के 10 करने के लिए तुलनीय यांत्रिक गुणों का प्रदर्शन करने के लिए दिखाया गया है। हालांकि, PDMS substrates बस crosslinker के लिए आधार के एक अनुपात मिश्रण से तैयार कर रहे हैं और इन substrates इस प्रकार PDMS सेल व्यवहार पर कठोरता के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक आसान उपकरण बनाने, रासायनिक crosslinking के लिए आवश्यकता के बिना ईसीएम प्रोटीन के साथ लेपित किया जा सकता है। इस के साथ साथ, हम एक नरम PDMS सब्सट्रेट एक कठोर गिलास coverslip के साथ एकीकृत है जिसमें एक साधारण durotaxis कक्ष तैयार करने के लिए कैसे का वर्णन है।

परख, नीचे उल्लिखित के रूप में, durotaxis अध्ययन करने के लिए एक त्वरित और आसान तरीका प्रदान करता है। इस अध्ययन के लिए हम siRNA की मध्यस्थता के साथ संयुक्त मानव U2OS ऑस्टियो सार्कोमा कोशिकाओं का इस्तेमाल कियाcdGAP की पछाड़ना durotaxis 11 में इस फोकल आसंजन प्रोटीन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए। महत्वपूर्ण बात है, इस प्रोटोकॉल तत्काल व्यक्तिगत आवश्यकताओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। अन्य प्रकार की कोशिकाओं U2OS कोशिकाओं के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है और किसी भी प्रोटीन नीचे गिरा या durotaxis के दौरान सेल व्यवहार पर प्रभाव का निर्धारण करने के लिए overexpressed जा सकता है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल उनकी गतिशीलता और व्यवहार का उपयोग FRAP या दृष्टिकोण झल्लाहट का विश्लेषण करने के लिए fluorescently टैग प्रोटीन को शामिल करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Durotaxis चैंबर्स ऑफ 1. तैयारी

  1. एक 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट तैयार करने के लिए, एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के साथ संतुलन बारदाना। 50 मिलीलीटर ट्यूब में PDMS आधार समाधान के लगभग 10 ग्राम वजन (समाधान काफी चिपचिपा है)।
  2. एक 90 के लिए: 1 सब्सट्रेट (~ 1 किलो पास्कल के अनुपालन) की जरूरत है, crosslinker समाधान की सही मात्रा निर्धारित करने के लिए 90 से ट्यूब में PDMS आधार समाधान के मापा वजन को विभाजित। एक ही ट्यूब के लिए PDMS crosslinker समाधान की गणना की राशि जोड़ें।
    उदाहरण: 10 जी / 90 = 0.11 छ। PDMS आधार समाधान करने के लिए PDMS crosslinker समाधान की 0.11 ग्राम जोड़ें।
    नोट: आधार और crosslinker समाधान दोनों PDMS किट में प्रदान की जाती हैं।
  3. सख्ती एक छोटा सा रंग का उपयोग कर आरटी पर 5 मिनट के लिए PDMS आधार / crosslinker मिश्रण मिश्रण। इस अवस्था में मिश्रण हवा के बुलबुले की एक बड़ी संख्या में शामिल होंगे।
  4. Bub दूर करने के लिए आरटी पर 50 XG पर 5 मिनट के लिए एक benchtop अपकेंद्रित्र में PDMS सब्सट्रेट अपकेंद्रित्रBles। देखते हैं, तो अभी भी फिर 5 मिनट, सेंट्रीफ्यूज के बाद बुलबुले।
  5. 90 की पिपेट 1 मिलीलीटर: टिशू कल्चर के प्रत्येक कुएं में 1 PDMS सब्सट्रेट 6 अच्छी तरह से थाली का इलाज किया। PDMS में उपस्थित किसी भी शेष हवा के बुलबुले एक 21 जी सुई का प्रयोग कर उन्हें popping द्वारा इस स्तर पर समाप्त किया जा सकता है। PDMS अच्छी तरह से में 30 मिनट के लिए प्रसार करने की अनुमति दें।
  6. उबाल लें 12 मिमी कांच # 5 मिनट के लिए आसुत जल में 1 coverslips। दो बार दोहराएँ और आसुत जल में coverslips की दुकान।
  7. फिर धीरे PDMS पर coverslip ड्रॉप PDMS समाधान में coverslip के एक पक्ष को छूने से टिशू कल्चर प्लेट के प्रत्येक कुएं में एक, सूखे coverslip रखें। Coverslip सुलझेगी के रूप में, PDMS coverslip के किनारों पर अतिक्रमण करने के लिए शुरू हो जाएगा, लेकिन यह पूरी तरह से कवर नहीं करेंगे। यह (बी चित्रा 1 ए देखें) इलाज के बाद PDMS और कांच के बीच एक अंतरफलक उत्पन्न होगा।
  8. PDMS इलाज (कठोर) के लिए 16 घंटे के लिए एक ओवन में 70 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं। बेनी की जगहएक सेल संस्कृति हुड और यूवी में ई 10 मिनट के लिए बाँझ।
    नोट: यह उपयोग की एक दो दिन के भीतर प्लेटों बनाने के लिए सबसे अच्छा है। हालांकि, प्लेटें किसी भी बफर बिना Parafilm में लिपटे और गुणवत्ता में किसी भी उल्लेखनीय कमी के बिना 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।

2. सेल चढ़ाना

नोट: siRNA की मध्यस्थता पछाड़ना के प्रभाव का अध्ययन करते हैं, तो निर्माता के निर्देशों या अपनी पसंद के सेल प्रकार के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल का उपयोग पछाड़ना प्रदर्शन करते हैं।

  1. कोट प्रत्येक 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना / एमएल फ़ाइब्रोनेक्टिन पीबीएस में 10 माइक्रोग्राम के 1 मिलीलीटर के साथ चैम्बर durotaxis। वैकल्पिक रूप से, फ़ाइब्रोनेक्टिन 4 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए / एमएल फ़ाइब्रोनेक्टिन पीबीएस में 10 माइक्रोग्राम के साथ PDMS incubating द्वारा विश्लेषण करने से पहले दिन से लागू किया जा सकता है। पूरी सतह पीबीएस समाधान में फ़ाइब्रोनेक्टिन में डूबे हुए है सुनिश्चित करें।
  2. गर्मी विकृत 1% बीएसए तैयार करें। 0.5 ग्राम बीएसए वजन और पीबीएस के 50 मिलीलीटर में भंग।फ़िल्टर 12 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर 0.22 माइक्रोन फिल्टर और गर्मी के माध्यम से समाधान बाँझ।
    नोट: इस समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर चढ़ाना और स्टोर सेल करने के लिए पहले दिन तैयार करें।
  3. फ़ाइब्रोनेक्टिन समाधान Aspirate और पीबीएस के साथ 3 बार धोएं। अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए पीबीएस में गर्मी विकृत बीएसए के 1 मिलीलीटर जोड़ें और आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  4. Durotaxis कक्षों गर्मी विकृत बीएसए के साथ अवरुद्ध कर रहे हैं, जबकि Trypsinize और अपनी पसंद की कोशिकाओं की गिनती।
  5. प्लेट पसंद के विशेष सेल प्रकार के लिए आवश्यक मीडिया का उपयोग durotaxis चैम्बर के प्रत्येक कुएं में 2 मिलीलीटर की मात्रा में 1 x 10 5 कोशिकाओं,। कोशिकाओं पालन और 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified इनक्यूबेटर में 4 घंटे के लिए सब्सट्रेट पर प्रसार करने की अनुमति दें।
    नोट: U2OS कोशिकाओं नियमित तौर पर 2 मिमी एल glutamine, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, और 10 आइयू / एमएल पेनिसिलिन, 10 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक, 10% FBS के साथ DMEM में रखा जाता है।
    नोट: इस उदाहरण में प्रयुक्त सेल नंबर के लिए अनुकूलित हैU2OS कोशिकाओं। अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। यह घनत्व कोशिकाओं अन्य कोशिकाओं के साथ महत्वपूर्ण बातचीत बिना विस्थापित करने के लिए पर्याप्त कमरा देता है।

3. लाइव सेल इमेजिंग

  1. एक 10x उद्देश्य के साथ चरण विपरीत का उपयोग कर, एक औंधा माइक्रोस्कोप पर लाइव सेल इमेजिंग प्रदर्शन। माइक्रोस्कोप लंबी अवधि इमेजिंग के दौरान 37 डिग्री सेल्सियस पर तापमान के नियंत्रण और 5% सीओ 2 के लिए अनुमति देता है, एक संलग्न पर्यावरण, humidified कक्ष के साथ सुसज्जित किया जाना चाहिए।
  2. कोशिकाओं लगभग 3.5 घंटे के लिए फैल गया है के बाद, माइक्रोस्कोप कक्ष में प्लेट इकट्ठा। नमूना (एस) 30 मिनट के लिए चैम्बर में संतुलित करने की अनुमति दें।
  3. यदि उपलब्ध हो माइक्रोस्कोप पर जाकर स्वचालित, बहु बिंदु निर्धारित करें। 90 के बीच इंटरफेस पर ध्यान दें: 1 PDMS और गिलास coverslip और सभी durotaxis चैम्बर प्रति 40 अंक की एक औसत के साथ इंटरफेस के आसपास छवि के लिए अंक चुनें। छवि कोशिकाओं के लिए 16 घंटे के लिए हर 10 मिनट।
    नोट: फिर सेब्याज की इलाके coverslip के किनारे और PDMS और coverslip के बीच वास्तविक इंटरफेस के लिए इसी इनर लाइन करने के लिए इसी बाहरी लाइन के साथ, दो लाइनों के रूप में दिखाई देंगे। चित्रा 1 बी देखें।

4. डेटा विश्लेषण

  1. तालिका 1 में के रूप में एक स्प्रेडशीट उत्पन्न करता है।
  2. उत्पन्न प्रत्येक फिल्म से कांच की सतह और इसके विपरीत करने के लिए PDMS से पार करने की घटनाओं की संख्या की गणना। एक्सेल स्प्रेडशीट में उचित कॉलम में पार करने की घटनाओं की संख्या रिकॉर्ड है।
    नोट: एक पार घटना या तो दिशा में PDMS और कांच के बीच सीमा पर गुजर सेल नाभिक के रूप में परिभाषित किया गया है।
  3. कई क्रॉसिंग यों, सेल इंटरफेस पार बार की संख्या गिनती। यह संख्या सेल फिल्म के अंत में स्थित था, जिस पर सब्सट्रेट करने के लिए इसी एक्सेल कॉलम में दर्ज किया जाना चाहिए। टी में इंटरफ़ेस पार कि हर सेल के लिए विश्लेषण दोहराएँवह फिल्म। इमेजिंग के दौरान देखने के क्षेत्र से बाहर की ओर पलायन कि कोशिकाओं को बाहर।
    नोट: यह कोशिकाओं फ़ाइब्रोनेक्टिन लेपित PDMS और गिलास coverslip सतहों के लिए समान रूप से पालन करने में सक्षम हैं कि, प्रयोग की शुरुआत में गिनती सेल द्वारा सत्यापित करने के लिए भी महत्वपूर्ण है।
  4. कांच की सतह (यानी, durotaxis कराना पड़ा) करने के लिए PDMS से चले कि कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना। मुलायम से कठिन और पार करने की घटनाओं की कुल संख्या से कठिन और विभाजन को समाप्त हो गया है कि कई क्रासिंग घटनाओं के लिए घटनाओं को पार करने का नंबर जोड़ें।
  5. क्रॉसिंग की कुल संख्या से कई क्रॉसिंग की संख्या से विभाजित करके कई क्रॉसिंग के प्रतिशत की गणना।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Durotaxis चैम्बर के एक योजनाबद्ध चित्रा 1 ए में दिखाया गया है। शीतल PDMS सब्सट्रेट (एक 90: समाधान crosslinker को PDMS आधार का एक मिश्रण) एक 6 अच्छी तरह से थाली में फैला हुआ है और एक गिलास coverslip जिससे एक इंटरफेस बनाने, तो आंशिक रूप से coverslip की ऊपरी सतह को शामिल किया गया है, जो PDMS, के शीर्ष पर रखा गया है अलग अनुपालन के दो substrates के बीच। मुलायम PDMS सब्सट्रेट की कठोरता कांच की कठोरता के आसपास GPa 1 1-2 है, जबकि मस्तिष्क के ऊतकों के विशिष्ट अनुपालन के बराबर है जो ~ 1 किलो पास्कल, है। PDMS और कांच के बीच इंटरफेस के एक चरण विपरीत छवि चित्रा 1 बी में सफेद तीर द्वारा दिखाया गया है। तारक कठिन सब्सट्रेट की ओर पलायन कर दो नियंत्रण आरएनएआई कोशिकाओं निरूपित। देखा जा सकता है कि प्रचंड किनारे (काला तीर) coverslip के किनारे से मेल खाती है।

डेटा यों, एक माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल स्प्रेडशीट तालिका 1 में के रूप में उत्पन्न किया जाना चाहिए </> मजबूत। क्रासिंग की घटनाओं की संख्या की गिनती और इसी कॉलम में आयोजित किया जाना चाहिए। उत्पन्न फिल्मों की कुछ मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। एक कोशिकाओं प्रगति के साथ हस्तक्षेप या कि PDMS में एक बुलबुला है कि अगर वहाँ एक फिल्म मात्रा का ठहराव से हटाया जा सकता है कोशिकाओं को भी घनी पैक कर रहे हैं, तो काफी सेल दिशात्मकता प्रभावित कर सकते हैं कि टक्कर में जिसके परिणामस्वरूप। यह भी खुलकर सेल आंदोलन को प्रभावित कर सकते हैं के रूप में कोशिका विभाजन को भी निगरानी की जानी चाहिए।

आमतौर पर, सबसे पक्षपाती सेल प्रकार अधिमान्यतया एक stiffer सब्सट्रेट 2,4,12 की ओर पलायन होगा। कोशिकाओं को उनके वातावरण में यांत्रिक cues का जवाब जिसके द्वारा आणविक तंत्र को समझने के लिए शुरू करने के लिए, विशेष प्रोटीन siRNA का उपयोग कर नीचे गिरा दिया जा सकता है। हमारे उदाहरण में, नियंत्रण siRNA इलाज कोशिकाओं के चारों ओर 70% durotaxis चित्रा 2A प्रदर्शन किया। CdGAP आरएनएआई का उपयोग कर नीचे गिरा दिया गया था, इसके विपरीत हड़ताली में, कोशिकाओं कोई वरीयता थाचाहे के रूप में वे मुश्किल या नरम सब्सट्रेट चित्रा 2A पर चले गए। नियंत्रण siRNA इलाज किया कोशिकाओं आम तौर पर केवल एक बार सीमा, चित्रा 2 बी पार जबकि इसके अलावा, cdGAP पछाड़ना कोशिकाओं, सीमा को कई बार पार कर गया। नियंत्रण siRNA कोशिकाओं के प्रतिनिधि पटरियों कोशिकाओं आम तौर पर या तो कठोरता के लिए एक प्राथमिकता का प्रदर्शन और सीमा को कई बार चित्रा -2 को पार नहीं किया है कि cdGAP siRNA इलाज कोशिकाओं की तुलना में एक बार और अधिमान्यतया अधिक कठोर सतह पर रहे सीमा पार विस्थापित कि दिखा।

चित्र 1
सेट अप Durotaxis चैम्बर के चित्रा 1. योजनाबद्ध। (ए) शीतल PDMS 6 अच्छी तरह से पकवान के प्रत्येक कुएं में फैला हुआ है और एक गिलास coverslip PDMS के शीर्ष पर रखा गया है। PDMS BEF, coverslip के शीर्ष के पक्षों पर अतिक्रमण होगायह, और मज़बूत बनाता दो substrates के बीच एक अंतरफलक के रूप में करने अयस्क। Durotaxis PDMS / ग्लास इंटरफेस को पार कोशिकाओं की दिशात्मकता स्कोरिंग द्वारा निर्धारित किया जाता है। (बी) के नरम PDMS और कठोर ग्लास सब्सट्रेट के बीच इंटरफेस दिखा प्रतिनिधि चरण विपरीत छवि। तारक durotaxis के दौर से गुजर नियंत्रण आरएनएआई इलाज U2OS कोशिकाओं दिखा। सफेद तीर PDMS और गिलास coverslip और तीर के बीच इंटरफेस PDMS तहत कांच coverslip के किनारे इंगित करता है निरूपित करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका एक
तालिका 1. माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल स्प्रेडशीट के योजनाबद्ध की स्थापना की। कॉलम फिल्म संख्या में शामिल करने के लिए स्थापित कर रहे हैं, siRNA, इस्तेमाल नरम PDMS से चले कि कोशिकाओं की संख्याकठोर ग्लास सब्सट्रेट या इसके ठीक विपरीत, साथ ही विश्लेषण किया कोशिकाओं की कुल संख्या के लिए। कॉलम भी इंटरफेस को कई बार पार और नरम PDMS या कांच के अध: या तो पर खत्म होता है कि कोशिकाओं के लिए स्थापित कर रहे हैं। एक सेल सीमा को कई बार पार migrates हैं, तो इन कोशिकाओं के कई पार करने की घटनाओं की संख्या सेल फिल्म के अंत में स्थित था जिस पर सब्सट्रेट के कॉलम में दर्ज की गई है।

चित्र 2
U2OS कोशिकाओं में cdGAP की चित्रा 2 पछाड़ना durotaxis की हानि का कारण बनता है। CdGAP siRNA इलाज किया कोशिकाओं किसी भी वरीयता प्रदर्शन नहीं किया था जबकि (ए) नियंत्रण siRNA इलाज किया कोशिकाओं, कठोर ग्लास सब्सट्रेट पर रियायत के पलायन। (बी) के नियंत्रण siRNA इलाज किया कोशिकाओं एक बार PDMS और कांच के बीच की सीमा को पार कर गया। हालांकि, cdGAP आरएनएआई इलाज कोशिकाओं के आगे और पीछे ख भर चले गएoundary कई बार। प्रतिनिधि कोशिकाओं (सी) पटरियों या तो नियंत्रण के साथ इलाज, या cdGAP siRNA ImageJ में मैनुअल ट्रैकिंग प्लगइन का उपयोग कर उत्पन्न किया गया। पी-मूल्यों को एक छात्र के टी परीक्षण का उपयोग कर निर्धारित किया गया है और त्रुटियों को सलाखों के 95% विश्वास अंतराल प्रतिनिधित्व करते हैं। वार्मर एट अल। 2014 11 से अनुमति के द्वारा Reproduced। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस के साथ साथ हम कोशिकाओं पलायन में durotaxis अध्ययन करने के लिए एक सरल परख का वर्णन है। इस परख की एक प्रमुख ताकत PDMS का उपयोग कर durotaxis कक्षों की तैयारी में आसानी है। substrates की कठोरता आसानी से परख में विभिन्न कठोरताओं के अध्ययन की अनुमति के लिए crosslinker को PDMS आधार समाधान के अनुपात बदलकर चालाकी से किया जा सकता है। हालांकि, इस प्रणाली का एक संभावित सीमा और अधिक परिष्कृत प्रणाली 4 से प्रदान की जाती है कि एक कठोरता ढाल का सामना करने के लिए विरोध के रूप में कोशिकाओं केवल सब्सट्रेट कठोरता में एक भी परिवर्तन करने के लिए सामने आ रहे हैं। महत्वपूर्ण बात है, polyacrylamide substrates के विपरीत, ईसीएम घटकों रासायनिक पार से जुड़े PDMS करने के लिए होने की जरूरत नहीं है। फ़ाइब्रोनेक्टिन 11 के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ धुंधला द्वारा निर्धारित रूप में दरअसल, फ़ाइब्रोनेक्टिन कोटिंग, PDMS और कांच दोनों सतहों पर लगभग बराबर है। पिछले अध्ययनों कोशिकाओं या तो PDMS या पॉलीएक्रिलमाइड substrates, उपयोग ओ पर एक ही व्यवहार करते हैं कि पता चला है के बाद सेsubstrates च PDMS कोशिकाओं 10,12 में mechanotransduction का अध्ययन करने के साथ जो एक बहुत आसान मॉडल उपलब्ध कराता है।

PDMS substrates की तैयारी में सबसे महत्वपूर्ण कदम का आधार है और crosslinker समाधान अच्छी तरह से मिश्रित कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए है। वे काफी अच्छी तरह से मिश्रित नहीं कर रहे हैं, तो substrates के पूरी तरह से गर्मी उपचार पर इलाज नहीं किया जाएगा। इस coverslip PDMS में भी अभी तक डूब या coverslip इमेजिंग के दौरान PDMS में बहती में परिणाम होगा। Centrifugation के बल बहुत अधिक है, आधार और crosslinker समाधान ट्यूब में अलग हो सकती है। इस centrifugation गति को कम करने से या एक निर्वात चैम्बर का उपयोग कर 30 मिनट के लिए मिश्रण degassing द्वारा remedied किया जा सकता है। अंत में, सेल घनत्व भी कई कोशिकाओं को अपनी क्षमता पूरी तरह से प्रसार करने के लिए और पड़ोसी कोशिकाओं के साथ संपर्क से निर्बाध durotax को प्रभावित करती है, के रूप में महत्वपूर्ण है। इस के साथ साथ सूचना घनत्व U2OS कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया गया था। हालांकि, अन्य प्रकार की कोशिकाओं का इस्तेमाल किया जाता है, तो इष्टतम सेलएल संख्या अनुभव से निर्धारित करना होगा।

हमने हाल ही में प्रोटीन cdGAP संकेत फोकल आसंजन mechanosensing नियंत्रित करता है और 11 durotaxis कैसे अध्ययन करने के लिए इस परख का इस्तेमाल किया है। 15 - जाहिर है, इस तरह के भी durotaxis 13 के नियमन के लिए योगदान कर सकते हैं, इस प्रकार यांत्रिक संकेतन में शामिल हैं और कर रहे हैं कि cytoskeletal तत्वों, प्रोटीन की तस्करी घटकों और आयन चैनल के रूप में फोकल adhesions, के अलावा कई सेलुलर घटक हैं। इनमें से प्रत्येक घटक आसानी से समान आरएनएआई दृष्टिकोण का उपयोग कर हमारी प्रणाली में मूल्यांकन किया जा सकता है। साथ ही, इस परख विभिन्न pharmacologic activators या अवरोधकों की शुरूआत करने के लिए बहुत उत्तरदायी है। परख भी प्रोटीन की गतिशीलता और स्थानिक-सामयिक सक्रियण अध्ययन करने के लिए, झल्लाहट या FRAP दृष्टिकोण के साथ संयोजन में इस तरह के fluorescently टैग प्रोटीन के समावेश के रूप में विश्लेषण के और अधिक परिष्कृत रूपों, की अनुमति के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

इस काम एनआईएच R01 GM47607, CA163296 और सीईटी के लिए NSF 1,334,493 द्वारा समर्थित है। हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए टर्नर प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद। इस रिपोर्ट में दिखाए गए सभी डेटा वार्मर एट अल। 2014 11 से अनुमति के द्वारा reproduced किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning 3097358-1004 Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit
#1 Cover glass 12 mm Fisher Scientific 12-545-82
6-well plate Celltreat 229106
DMEM Cellgro 15-017-CM
L-Glutamine Cellgro 25-005-CI
Sodium Pyruvate Fisher Scientific BP356-100
Penicillin/Streptomycin Cellgro 30-002-CI
Fibronectin BD Biosciences 610077
PBS Invitrogen 21600-044
Falcon tubes Celltreat 229456
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150
Bovine Serum Albumin Sigma A7906
U2OS cells ATCC HTB-96

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  2. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
  3. Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139 (5), 891-906 (2009).
  4. Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).
  5. Plotnikov, S. V., Waterman, C. M. Guiding cell migration by tugging. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 619-626 (2013).
  6. Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
  7. Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).
  8. Provenzano, P. P., Keely, P. J. Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling. Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).
  9. Wang, Y. L., Pelham, R. J. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).
  10. Prager-Khoutorsky, M., et al. Fibroblast polarization is a matrix-rigidity-dependent process controlled by focal adhesion mechanosensing. Nature Cell Biology. 13 (12), 1457-1465 (2011).
  11. Wormer, D. B., Davis, K. A., Henderson, J. H., Turner, C. E. The focal adhesion-localized CdGAP regulates matrix rigidity sensing and durotaxis. PloS ONE. 9 (3), e91815 (2014).
  12. Trichet, L., et al. Evidence of a large-scale mechanosensing mechanism for cellular adaptation to substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (18), 6933-6938 (2012).
  13. Eyckmans, J., Boudou, T., Yu, X., Chen, C. S. A hitchhiker’s guide to mechanobiology. Developmental Cell. 21 (1), 35-47 (2011).
  14. Martinac, B. Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction. Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).
  15. Jafar-Nejad, H., et al. Sec15, a component of the exocyst, promotes notch signaling during the asymmetric division of Drosophila sensory organ precursors. Developmental Cell. 9 (3), 351-363 (2005).

Tags

आण्विक जीवविज्ञान अंक 102 सेल प्रवास mechanosensing durotaxis polydimethylsiloxane ट्यूमर आक्रमण बाह्य मैट्रिक्स कठोरता mechanotransduction U2OS
मूल्यांकन सेल Mechanosensing और Durotaxis के लिए एक सरल प्रणाली<em&gt; इन विट्रो</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Goreczny, G. J., Wormer, D. B.,… More

Goreczny, G. J., Wormer, D. B., Turner, C. E. A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro. J. Vis. Exp. (102), e52949, doi:10.3791/52949 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter