평가 셀 Mechanosensing 및 Durotaxis에 대한 단순화 된 시스템<em> 체외</em
Summary
Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.
Abstract
세포 외 매트릭스의 조성과 기계적 성질이 조직 유형 사이에서 매우 가변적이다. 이 크게 결합 조직 기질 다이버 영향 셀 동작은 세포 증식, 분화, 접착 시그널링 및 이동 방향을 포함하여 정상 및 병리학 적 과정을 조절한다. 이와 관련하여, 특정 세포 유형의 타고난 능력 durotaxis라고도 단단, 이하 호환 매트릭스 기판을 향해 이동한다. 이 현상은 배아 발생, 상처 복구 및 암세포 침윤 동안 중요한 역할을한다. 여기, 우리는 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 기판을 사용하여 시험 관내에서, durotaxis을 연구하는 간단한 분석을 설명합니다. 챔버 durotaxis 설명의 준비는 상대적으로 부드러운 PDMS 젤 단단한 유리 커버 슬립 사이에 강성 인터페이스를 만듭니다. 제공된 예에서, 우리는 cdc42의 역할을 입증하는 이들 durotaxis 챔버를 사용하고 / RAC1는 GTPase 활성 보호 자전거cdGAP에서, mechanosensing 인간 U2OS의 골육종 세포에서 durotaxis 규제. 이 분석은 mechanosignaling과 durotaxis에서 각각의 역할을 탐구하는 다른 세포 유형 및 / 또는 관심의 다른 단백질의 최저에 쉽게 적응할 수있다.
Introduction
세포 외 기질 (ECM)의 콜라겐, 피브로넥틴 및 라미닌을 포함하고, 가교 구조 단백질의 복잡한 배열로 구성된다. 이 아니라 ECM 셀룰러 조직 중요한 구조적지지를 제공한다는 확립되어 있지만, 세포가 활발히 세포 생존, 분화 및 세포 이동을 포함한 다양한 세포 과정을 조절하는 그들의 ECM 환경에서 물리적 인 변화에 대응 것을 나타내는 증거가 증가하고있다. 딱딱한 (~ 25 kPa로) 기판 조골 세포 분화를 촉진 한 예를 들어, ECM의 강성 차이는 연질 기판 (~ 1 kPa의) 신경성 계통 촉진과 함께, 서로 다른 계통으로 중간 엽 줄기 세포를 구동 할 수있다. 마찬가지로 기질 매트릭스 강성 증가는 주변 조직에 2,3- 유방 상피 세포 및 종양 침윤을 촉진하는 것으로 나타났다.
이 mechanosign의 특히 흥미로운 양태세포가 더 견고한 기판 4,5- 향해 우선적으로 마이그레이션하는 durotaxis로 알려진 프로세스에서 aling 활동 결과. 세포는 지속적 ECM 결합 인테그린 수용체를 통해 세포 외 환경의 물리적 특성을 감지. 이것은, 차례로, 국소 유착 또는 초점 콘택트 -6,7-라고도 접착제 구조의 형성을 구동 할 그들의 세포질 도메인 수많은 구조 및 시그널링 단백질의 축적을 촉진한다. 인테그린이 더 고유의 효소 활성이 없기 때문에, 신호는 변화하는 환경에 8 셀의 응답을 조정하기 위해 이러한 액세서리 단백질을 통해 ECM에서 릴레이됩니다. 따라서, mechanosignaling durotaxis 및 조절에 관여하는 주요 단백질의 동정 및 특성 규명은 수사의 중요한 영역이다.
다양한 모델 시스템 durotaxis 관내 연구 개발되어 왔지만, 대부분은 할이용 콜라겐 코팅 된 폴리 아크릴 아미드 기판 (4). 그러나, 폴리 아크릴 아미드의 기판의 제조는 기술적으로 어려울 수 있으며, 상기 분석 방법에 사용되는 콜라겐은 기판 (9)와 화학적으로 가교되어야한다. 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 기판은 폴리 아크릴 기판 (10)에 필적하는 기계적 성질을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 그러나, PDMS 기판을 간단히 가교제 염기의 혼합 비율에 의해 제조되며, 이러한 기판은 이에 PDMS 세포 행동에 강성의 영향을 연구하기 쉬운 도구를 만드는 화학적 가교의 필요성없이 ECM 단백질로 코팅 될 수있다. 여기서, 우리는 부드러운 PDMS 기판이 경질 유리 커버 슬립과 통합되는 간단한 durotaxis 실을 준비하는 방법에 대해 설명합니다.
분석은, 아래에 설명 된대로, durotaxis을 연구하는 빠르고 간단한 방법을 제공합니다. 이 연구를 위해 우리는 siRNA를 매개로 결합 된 인간의 U2OS의 골육종 세포를 사용cdGAP의 최저은 durotaxis (11)이 초점 접착 단백질의 역할을 연구합니다. 중요한 것은,이 프로토콜은 개별적인 요구에 쉽게 적응 될 수있다. 다른 유형의 세포는 U2OS 세포를 대체 할 수 있고, 어떤 단백질은 뜨거나 durotaxis 동안 셀의 동작에 미치는 영향을 결정하기 과발현 될 수있다. 더욱이,이 프로토콜은 역학 거동 사용 FRAP 또는 접근법 FRET을 분석 형광 태그로 단백질을 포함하도록 구성 될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서 우리는 세포를 마이그레이션하는 durotaxis을 연구하는 간단한 분석을 설명합니다. 이 분석의 주요 장점은 PDMS를 사용 durotaxis 챔버 제조의 용이성이다. 기판의 강성을 용이하게 분석에서 다양한 강성의 연구를 허용하도록하기 위해 가교제 PDMS 염기 용액의 비율을 변경함으로써 조작 될 수있다. 그러나, 시스템의 하나의 잠재적 인 한계는 더 정교한 시스템 (4)에 의해 제공되는 강도…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH R01 GM47607, CA163296 및 CET에 NSF 1,334,493에 의해 지원됩니다. 우리는 원고의 중요한 읽기 터너 실험실의 구성원을 감사드립니다. 이 보고서에 표시된 모든 데이터는 Wormer 등. 2014 (11)의 허가에 의해 재현되었다.
Materials
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit |
| #1 Cover glass 12mm | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| 6-well plate | Celltreat | 229106 | |
| DMEM | Cellgro | 15-017-CM | |
| L-Glutamine | Cellgro | 25-005-CI | |
| Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | BP356-100 | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 610077 | |
| PBS | Invitrogen | 21600-044 | |
| Falcon tubes | Celltreat | 229456 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | |
| U2OS cells | ATCC | HTB-96 |
References
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