Introduction
Una de las contribuciones más importantes a la biotecnología ambiental fue el diseño de biorreactores en los que el lodo utilizado (inóculo) era capaz de realizar en condiciones reductoras de sulfato. La reducción de sulfato (SR) permite el tratamiento de corrientes de aguas residuales que contienen altas concentraciones de sulfato en adición a la eliminación simultánea de DQO, metales pesados y contaminantes orgánicos, un hecho que hace SR una característica deseable de los lodos 1. Algunos ejemplos de los efluentes contaminados con sulfato provienen de industrias de curtiduría, papel, farmacéutica y de fabricación de productos químicos 1. Sin embargo, la mayor parte de la literatura se refiere a sulfidogénicos lodos cuando lodo granular metanogénica se ha adaptado a sulfidogenesis 2. Esta adaptación se logra comúnmente mediante la manipulación de la DQO / SO 4 2- relación en el biorreactor y la adición de productos químicos para inhibir metanógenos en el 2,3 lodos. Además del largo tiempo de que may requerir la formación de los gránulos sulfidogénicos, la competencia entre los metanógenos y reductores de sulfato y la tolerancia de los lodos a altas concentraciones de sulfuro son algunos de los principales problemas que pueden surgir si el lodo sulfidogénicos utilizado en el biorreactor se obtiene de la adaptación de predominantemente lodos metanogénica al sulfato reductoras. En este trabajo, se describe el procedimiento para obtener un lodo predominantemente sulfidogénicos de respiraderos hidrotermales sedimentos (Punta Mita, Nayarit, México) en un reactor de manto de lodo anaerobio de flujo ascendente (UASB), a continuación, evaluamos su sulfato reducción de la actividad en el tiempo y llevamos a cabo un experimento para evaluar su aplicación en la decloración reductiva. Se eligió La ubicación de los sedimentos ya que se ha informado de que en ese sitio hay formación de sulfuros debido a la actividad exhibida por la reducción de sulfato de la comunidad microbiana que habitan en ese particular lugar 4.
Hay severAL ventajas en la obtención de este lodo sulfidogénicos de los sedimentos sobre la adaptación de lodo granular metanogénica a sulfidogenesis. Algunas de estas ventajas son: (1) no es necesario para formar gránulos para el biorreactor de operar, (2) el lodo tolera concentraciones relativamente altas de sulfuro de comparación con otros UASB que operan con lodos metanogénica adaptado, y (3) no se no hay competencia por el sustrato con metanógenos incluso si acetato se utiliza en la mezcla de ácidos grasos volátiles que se incluye en el medio de cultivo para promover la formación de los lodos.
Este procedimiento se siguió para promover sulfidogenesis debido a los sedimentos marinos son una piscina natural de una amplia variedad de microorganismos, tales como sulfato de reducción de las bacterias, fermentación de bacterias y deshalogenar bacterias sólo para mencionar algunos 5,6. El tipo de consorcio desarrollado a partir de sedimentos marinos mediante el uso de este protocolo puede exhibir la eficiencia en la reducción de sulfato y, por lo tanto, altas s ulfate la reducción de actividad con el tiempo y una mayor tolerancia a sulfuro en concentraciones más altas que el reportado como tóxico para los metanógenos y bacterias reductoras de sulfato. Por otra parte, es probable que la capacidad de deshalogenante también se muestra en los sedimentos, siguiendo el protocolo propuesto aquí, pero puede depender de la comunidad microbiana inicial. Esta suposición se hace con base en el hecho de que la decloración reductiva puede ocurrir ya sea por la respiración o cometabolismo, dos condiciones que pueden ser promovidas en la comunidad microbiana marina 7. El cultivo de los sedimentos para obtener el lodo se llevó a cabo mediante el uso de una mezcla de acetato, propionato y butirato como sustrato debido a que estos ácidos grasos volátiles son utilizados por varias cepas de bacterias reductoras de sulfato. Estos ácidos son también el tipo de compuestos de carbono que se encuentran con frecuencia en los sedimentos marinos, según varios reportes en la literatura sobre el material carbonoso en los sedimentos marinos 5,6.
contenido "> Por último, algunos de los compuestos más tóxicos que se encuentran en masas de agua subterránea y otra de agua en todo el mundo estan los disolventes clorados como el tricloroetileno (TCE) o percloroetileno (PCE). Estos compuestos son tóxicos, no sólo para el ser humano, pero también a los microorganismos, particularmente TCE, que todavía se considera un contaminante prioritario por la Agencia de Protección Ambiental de los EE.UU. 8. En este trabajo se propone un experimento en el que el lodo sulfidogénicos se prueba en su capacidad de reducir el TCE en concentraciones que están en el rango reportado para compuestos clorados biodegradación en condiciones metanogénicas 9,10. Vale la pena mencionar que la mayor parte de la investigación sobre la biodegradación de compuestos clorados se ha realizado en condiciones metanogénicas 9,10. Consideramos que el experimento con TCE se propone en este protocolo es un buen ejemplo de las posibles aplicaciones de los lodos. El objetivo de este experimento fue al correovalorar la tolerancia de los lodos a la TCE y el efecto TCE en el sulfato de reducción de la actividad. Teniendo en cuenta que la mayor parte de la investigación sobre la biodegradación de compuestos clorados se lleva a cabo bajo condiciones metanogénicas, este protocolo sugiere la formación de un lodo puede ser usado para simultáneamente: (1) eliminar el sulfato, (2) eliminar la DQO y (3) eliminar compuestos clorados. Un paso más podría ser la de evaluar el lodo en la eliminación simultánea de TCE y los metales pesados (además de sulfato y COD), dos condiciones que no pueden ser evaluados bajo condiciones metanogénicas.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Figura 1. Esquema de los pasos del protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
1. Recoger los sedimentos marinos de la Formación de los lodos
- Identificar un área accesible submarino ya sea cerca de las chimeneas hidrotermales (debido a la presencia de sulfuros, lo que puede indicar una actividad reductora de sulfato superior) o a un área donde los residuos de materia orgánica son detectables.
- A los efectos de este trabajo, tardará aproximadamente 3 o 4 kg de sedimento y drenar el agua de las muestras. Coloque las muestras en bolsas de plástico oscuro. No se necesita refrigeración.
- Una vez en el laboratorio, mantener las bolsas con las muestras en el refrigerador si no se van a utilizar de inmediato. Para el propósito de este trabajo, samples puede estar en la nevera durante semanas o meses antes de usarlos.
- Tome una gran parte de la muestra de sedimento (es decir, 1 o 2 kg) y el uso de una malla apropiada (0,2 cm) para eliminar de los sedimentos de la gran escombros de material carbonoso que se puede encontrar o algunas rocas que pueden estar presentes.
Nota: En este caso se utilizó una malla de 0,20 cm de diámetro (0,0767 in) pero puede ser de un tamaño diferente según el tamaño de las partículas en la muestra.- Después de pasar el sedimento a través de la malla, mezclar la parte seleccionada para promover que la porción es homogénea.
- Tomar muestras más pequeñas separadas (es decir, de 2 a 3 g) para determinar los sólidos volátiles en suspensión (VSS) de contenido siguiendo los métodos estándar 11.
Nota: Consulte la Figura 2 para conocer los pasos 1.2 a 1.4.
Figura 2. Fotografías de las muestras de sedimentos.Muestras (A) justo después de sedimentos están tomando. De la muestra (B) de sedimentos después de pasar a través de la malla. (C) Muestra tomada para el pesaje antes de sólidos en suspensión volátiles (VSS) determinación. La placa de Petri no necesita ser esterilizado. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
2. biorreactor Set Up
- Para el propósito de este trabajo, utilizar un reactor de vidrio UASB con un volumen de trabajo total de 3 L. Alternativamente, utilizar un reactor de vidrio de volumen de 1 o 2 L.
- Basándose en el contenido VSS de los sedimentos calcular la cantidad de sedimento para ser utilizado como inóculo para obtener 5 g de VSS en 1 L.
- Tener en cuenta que si la cantidad de sedimento después del cálculo es demasiado grande, entonces el volumen de aproximadamente 25% a 30% del biorreactor debería ser ocupado por los sedimentos en su lugar.
- Registre el contenido VSS ya queva a cambiar cuando la comunidad microbiana se enriquece en el biorreactor. Se necesita el contenido de VSS para los cálculos de sulfato de reducción de la actividad en el biorreactor.
- Asegúrese de que la concentración final de la solución tampón de medio y basal en el biorreactor es similar a la reportada por Guerrero-Barajas et al. (2014) 12.
- Asegúrese de que los volúmenes finales de los sedimentos, medio basal, solución tampón y ácidos grasos volátiles son iguales al volumen de trabajo final del reactor. La receta medio basal 12 contiene las concentraciones apropiadas para la solución de metales traza y vitaminas.
- Preparar una solución madre de medio basal y la solución tampón en una concentración apropiada para el volumen de trabajo del reactor utilizado (es decir, 2, 3 o 4 veces más concentrado que el reportado en el paso 2.4) para asegurar que cuando se diluye, es a la concentración reportada por Guerrero-Barajas et al. (2014)12).
Nota: La solución de stock para el medio basal siempre es necesario, sin embargo, la solución tampón sólo es necesario en la puesta en marcha. No es necesario añadir solución tampón después de este tiempo. - Preparar una solución madre de ácidos grasos volátiles: acetato, propionato y butirato en un 2,5: COD proporción 1: 1. Tome en cuenta para los cálculos del acetato de sodio incluido en el medio basal. La concentración de DQO final en el reactor debe ser 2,7 g / L.
Precaución: Preparar esta solución en una campana de humos. Use guantes de nitrilo y gafas para la preparación de esta solución. Tener en cuenta la estequiometría de las reacciones de sulfato con los ácidos grasos volátiles que se muestra en la Figura 3. - Preparar una solución madre de sulfato de sodio (Na 2 SO 4) en una concentración apropiada para entregar al reactor una concentración final de 4,000 mg / L de la ion sulfato (SO 4 2-). Alternativamente, incluir THe cantidad de sulfato requerida en el medio basal en lugar de añadir que a partir de una solución madre mientras el sulfato de final (SO 4 2-) concentración es correcta.
- Coloque los sedimentos en el reactor mezclado con una porción del medio basal para asegurarse de que lleguen a la parte inferior del reactor.
- Añadir el resto de la solución del medio y tampón basal se mezcla con la solución de ácidos grasos volátiles y la solución de sulfato. Asegúrese de que la solución de los ácidos grasos volátiles se vierte en el líquido. Nota: Realice este paso en una campana de humos.
- Establecer las conexiones y tuberías del reactor a la bomba de reciclaje. Ajuste el caudal de reciclaje en 60 ml / min. Ajuste el biorreactor en la cámara de temperatura a 34 ° C. Compruebe regularmente que las variaciones de temperatura son pequeñas (es decir, 34 ± 1,7 ° C)
- Establezca las conexiones a la columna de desplazamiento de gas.
Nota: Consulte la Figura 4 para conocer los pasos 2.1 a 2.5. </ ol>
Figura 3. Estequiometría de la reducción de sulfato con VFA (acetato, propionato y butirato). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. UASB reactor. (A) el tiempo inicial. (B) régimen continuo después de 300 días de operación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
3. El funcionamiento del reactor para Promover Sulfidogenesis y crecimiento de los microorganismos
Nota: Permitir el inóculo para consumir la vpoco volátil ácidos grasos y de sulfatos. Para este propósito, esperar durante una semana para llevar a cabo el primer análisis para el sulfato, sulfuro y el consumo de DQO.
- Después de una semana de incubación toma una muestra de 5 a 7 ml de líquido para llevar a cabo el análisis de DQO, sulfato y contenido de sulfuro y el pH siguiendo métodos estándar 11, 13.
- Analizar sulfuro en el espectrofotométricamente líquido (a una longitud de onda (λ) de 670 nm) siguiendo el método del azul de metileno 13.
- Colocar 5 ml de una solución de acetato de zinc (2% w / w) en un matraz aforado de 25 ml, añadir rápidamente 200 l de la muestra a la solución de acetato de zinc.
- Añadir 2,5 ml de una N, N dimetil- p-fenilendiamina solución de oxalato (DMP) (0,2% w / w en 20% H 2 SO 4) y 125 l de hierro (III) solución de sulfato amónico (10% w / w en 2% H 2 SO 4) y completa con agua destilada los 25 ml en el matraz volumétrico. Esperar 30 min para la reacciónque se produzca, momento en el que se estabiliza el color azul. 13.
Nota: Espere al menos 15 minutos, pero no más de 60 minutos para poner a prueba las muestras en el espectrofotómetro. Llevar a cabo la lectura de la solución final azul en el espectrofotómetro.
- Analizar sulfato de acuerdo con métodos estándar 11. Aquí, cuantificar sulfato como sulfato de bario mediante el uso de un método turbidimétrico.
- Colocar 5 ml de una solución acondicionado (ácido clorhídrico HCl 1: 1) en un matraz aforado de 25 ml, añadir 1 ml de la muestra previamente centrifugado (a 11.320 × g), completar la 25 ml del matraz aforado con agua destilada y se añadir 1 g de cloruro de bario.
- Mezclar la solución durante 1 min en un vórtice. Espere a 4 min para el sulfato de bario para formar y leer la muestra en el espectrofotómetro a una longitud de onda (λ) de 420 nm 11.
- Analizar DQO acuerdo con métodos estándar 11. Alternativamente, utilice una DQO Determinakit ción.
- Antes de la determinación de la DQO, centrifugar la muestra completamente (en 11.320 xg) para eliminar el sulfuro restante que puedan interferir en la determinación. Si es necesario, centrifugar dos veces: la primera vez inmediatamente después de tomar la muestra y la segunda vez, espere 6 u 8 horas y luego realizar el análisis de COD.
- Añadir 2 ml de la muestra a un vial de reacción del kit de determinación de la DQO, sellar el vial y homogeneizar la mezcla mediante agitación suave. Preparar un blanco mediante la adición de 2 ml de agua destilada a otro vial de reacción y homogeneizar la mezcla.
- Colocar los viales en el reactor de digestión a 150 ° C durante 2 hr. Retire los viales y dejar enfriar en la oscuridad. Tome las lecturas de los viales en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 620 nm.
- Obtener el volumen de gas de la columna de desplazamiento de gas.
- Analizar sulfuro en el espectrofotométricamente líquido (a una longitud de onda (λ) de 670 nm) siguiendo el método del azul de metileno 13.
- Espere hasta por otros 5 a 7 días hasta que se consume el sulfato. Sulfato y DQO deben ser consumidos en unproximadamente 85% a 90% antes de que se inicie un nuevo lote alimentado.
- Una vez que el sulfato (y COD) son consumidos, completamente repita el paso 2.4. Suministro medio fresco y nuevos nutrientes para cada lote.
- Repita los pasos 3.1 y 3.2. En este punto cada lote debe durar entre 7 y 10 días.
- Cuando 3 a 4 lotes se han completado, repetir el paso 2.4, pero aumentar la concentración de COD a 4 g / L.
- Repita el paso 3.1 y paso 3.2.
- Repita el paso 3.3, pero aumentar la concentración de DQO a 6 g / L.
- Repita 3.6 y 3.6.1 aumentando gradualmente la concentración de COD hasta que es 10 g / L.
Nota: asegúrese de la gráfica que presenta la concentración de sulfato (mg / L) frente al tiempo (d).
- Cuando el consumo de sulfato es más del 80% en menos de 24 hr y esto ocurre durante más de una semana, conmutar el funcionamiento del reactor de modo continuo. Para el modo continuo establecer el tiempo de retención hidráulica (TRH) a las 24 horas y mantener la concentración de sulfato en 4 g / L y la DQOa 10 g / L.
Nota: Con el tiempo el consumo de sulfato debe ser más rápido.
4. La reducción de sulfato de prueba Actividad
- Antes de esta prueba asegúrese de que el biorreactor bajo el régimen continuo presenta la variación de menos de 10% en la concentración de sulfato restante.
- En un día cualquiera, detener el reactor después de ciclo y conducta paso uno HRT 2.4. Para el paso 2.4.3 utilizar una concentración de COD de 10 g / L.
- Una vez que el biorreactor se alimenta, tomar de 5 a 7 muestras ml de líquido y realizar análisis de DQO, sulfato, sulfuro (paso 3.1) y pH cada hora. Registre el volumen de gas producido.
- Calcular el sulfato de reducción de la actividad de acuerdo con la literatura 14.
SRA = sulfato de reducción de la actividad (mg de COD-H 2 S) / gVSS * d
m H 2 2 S
VSS = concentración de sólidos en suspensión volátiles
t = tiempo (d or h)
- Realice los gráficos correspondientes que muestran el porcentaje de consumo de sulfato frente a la concentración de sulfuro en el tiempo en mg / L. Realice los gráficos que muestran el porcentaje de consumo de DQO en el tiempo. Realice los gráficos que muestran la variación del pH en el tiempo.
5. El tricloroetileno (TCE) Prueba de Reducción
- Antes de esta prueba asegúrese de que el biorreactor está trabajando en régimen continuo y presenta la variación de menos de 10% en la concentración de sulfato restante. No empiece este examen si la reducción de sulfato en el biorreactor es inferior al 90%.
- Preparar una solución madre de tricloroetileno (TCE) teniendo en cuenta que la concentración final de este compuesto en la fase líquida del biorreactor debe ser de 300 mM. Considere la partitioning del compuesto para el espacio de cabeza mediante el uso de la constante adimensional Ley Henry's (H') para TCE en 34 ° C. H'at 34 ° C para el TCE es 0.4722.
Precaución: Preparar esta solución en una campana de humos y usar guantes y gafas.- Por ejemplo, para una solución madre 5,000 M, calcular como sigue:
Concentración de TCE fase gaseosa = (0.4722) * (5.000) = 2.139 M. Incluir esta concentración en la preparación de la solución madre ya que esta cantidad de TCE estará en el espacio de cabeza.
Luego, en el líquido (agua) de la solución madre, la concentración de TCE real será: 5.000 + 2.139 = 7.139 M. Densidad TCE = 1,43 g / ml. Convertir el 7,139 M a mg y luego mediante el uso de la densidad de TCE calcular el volumen de TCE para la solución madre.
Nota: La concentración de la solución madre TCE may ser inferior a 5,000 M, es decir, 3.000 o 1.000 M, esto depende de la cantidad de volumen de esta solución puede ser entregado al biorreactor de acuerdo con su volumen de fase líquida.
- Por ejemplo, para una solución madre 5,000 M, calcular como sigue:
- Preparar las curvas de calibración en el cromatógrafo de gases de TCE, cis -1,2-dicloroetileno, trans 1,2 dicloroetileno, cloruro de vinilo y etileno. Preparar el cis 1,2 dicloroetileno y curvas estándar trans 1,2 dicloroetileno de una solución madre de estos compuestos siguiendo el mismo procedimiento descrito en 5.2 para la solución de TCE de valores. Preparar las curvas estándar para cloruro de vinilo y eteno mediante la dilución de la concentración de cada gas a partir de los estándares (cilindros de gas).
- Preparar las curvas estándar de estos compuestos en una gama de 20 a 300 mM. Utilice el método reportado por Guerrero-Barajas et al. (2011) 15 para el análisis de estos compuestos en el cromatógrafo de gases.
Precaución: Prepare éstos destacansoluciones ard en una campana de humos y usar guantes y gafas.
- Preparar las curvas estándar de estos compuestos en una gama de 20 a 300 mM. Utilice el método reportado por Guerrero-Barajas et al. (2011) 15 para el análisis de estos compuestos en el cromatógrafo de gases.
- En un día cualquiera, detener el reactor después de ciclo y conducta paso uno HRT 2.4. Para el paso 2.4.3 utilizar una concentración de COD de 10 g / L.
- Una vez que el biorreactor se alimenta, agregue el TCE directamente en el líquido en el biorreactor de la solución madre preparada en 5,2, la concentración de TCE final en la fase líquida del biorreactor debe ser de 300 mM. Establezca la TRH a 12 h.
- Al final de un ciclo HRT tomar muestras de líquido (500 a 1.000 l) y el análisis de conducta para la DQO, sulfato y sulfuro (pasos 3.1.1, 3.1.2 y 3.1.3). Tomar muestras del espacio de cabeza (100 a 250 l) y llevar a cabo el análisis de las expresiones culturales tradicionales, cis -1,2-dicloroetileno, trans 1,2 dicloroetileno, cloruro de vinilo y etileno en el cromatógrafo de gases.
- Repita el paso 2.4. Para el paso 2.4.3 utilizar una concentración de COD de 10 g / L.
- No repita ninguna prueba de reducción TCE hasta que el biorreactor presenta más de 9Reducción de 0% de sulfato y la variación de menos de 10% tanto, la reducción de sulfato y sulfato restante en el biorreactor.
- Repita 5.4, 5.5 y 5.6 dos o tres veces más.
- Tomar muestras de sedimentos (0,5 g) para llevar a cabo la identificación de los microorganismos justo después de una prueba de reducción de la TCE ha terminado. Haga esto después de 2 o 3 pruebas de reducción de TCE.
6. Reducción de sulfato de prueba Actividad después Experimento TCE Reducción
- Repita el paso 4 por completo.
7. Identificación de los microorganismos
- Tomar muestras de lodos de aproximadamente 0,5 g cada uno y llevar a cabo la extracción de ARN total según el método estándar de 12.
- Amplificar el gen 16S rRNA con transcripción inversa y realizar la reacción en cadena de polimerasa (RT-PCR) de amplificación de un paso 12.
- Diseñar los cebadores para amplificar o utilizar como una primera aproximación los sugeridos en la literatura 11. Siga el amplifprocedimiento icación sugerido en la literatura 12.
- Construir las bibliotecas de 16S rRNA. Amplicones de PCR se pueden clonar mediante el uso de un kit de clonación-11. Típicamente, 10 colonias de cada placa (cada colonia representa un producto PCR) pueden ser clonados. Preparar el ADN de plásmido para la secuenciación de acuerdo con el procedimiento sugerido en la literatura 12.
- Llevar a cabo la secuenciación de fragmentos. Re-amplificar aproximadamente 1400 pb de los productos externos de PCR con el protocolo de PCR para la amplificación se ha descrito previamente (paso 7.4) y el clon de acuerdo con el procedimiento sugerido en la literatura 12. Aislar el plásmido recombinante de E. colonias de E. coli como se sugiere en la literatura 12. No llevar a cabo el procedimiento parcial para la secuenciación con cebadores universales M13 12.
- Llevar a cabo el análisis de secuencias. Alinear las secuencias de nucleótidos utilizando el Clustal X y ajustar manualmente en el editor de texto. Realizar búsquedas BLAST de las databas NCBIe. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi) 12.
- Obtener los números de acceso de secuencia de nucleótidos. Depositar las secuencias de nucleótidos de los clones identificados en la base de datos EMBL secuencia de nucleótidos (Gen-Bank / EMBL / DDBJ) bajo los números de acceso correspondientes (es decir, JQ713915eJQ713925 para las secuencias de amplicones) 12.
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Representative Results
Un comportamiento típico de la reducción de sulfato en el biorreactor se muestra en la Figura 5. Es importante notar que durante las primeras semanas de la reducción de sulfato de operación será lento. Sin embargo lento, el consumo de más del 90% de sulfato de con el tiempo indica que el inóculo está desarrollando una comunidad microbiana capaz de reducir el sulfato y por lo tanto, enriquecido en bacterias reductoras de sulfato. Los diferentes períodos en la figura indican que la reducción de sulfato fue aumentando su tasa en el tiempo. Al principio, el lote tomó 20 días para el sulfato se reduzcan (Período I), entonces su tasa de reducción fue en aumento, y se tomó aproximadamente 10 días para reducir el sulfato de Fed (Período II). Período III presenta menos variación en la reducción de sulfato y esto se logró en un promedio de 10 días como se ve en la Figura 5. Después de este período, la reducción de sulfato tomó una media de 4 días (Período IV) y en el periodo V de la 4000 mg / L de sulfato dese consumieron en menos de 24 horas. El rendimiento en el biorreactor se estableció en el modo continuo después de 200 días en el TRH de 24 h.
Figura 5. sulfato (SO 4 2-) concentración en el tiempo durante la formación de lodos sulfidogénicos en el biorreactor. La línea continua se refiere al influente concentración de sulfato. Los cuadrados se refieren a la concentración de sulfato en el efluente. Esta cifra se ha tomado de Guerrero-Barajas et al. (2014) 12 con el permiso correspondiente de derechos de autor. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Buenos resultados representativos sobre la reducción de sulfato, concentración de sulfuro, el consumo de DQO y variaciones de pH en el tiempo son shpropia en la Figura 6A. Estos resultados se obtuvieron en experimentos llevados a cabo una vez que el biorreactor estaba bajo régimen continuo casi durante un año. En este punto la comunidad microbiana fue desarrollado en el biorreactor y un lodo negro se formó como puede verse en la Figura 4B. En la figura 6A se puede ver que el sulfato se reduce en 4 hr y sulfuro alcanza una concentración máxima de 1200 ± 30 mg / L y 188 ± 50 mg DQO-H 2 S / g VSS * d fue el sulfato de actividad reductora. Vale la pena mencionar que la concentración de sulfuro obtenido en el biorreactor se considera alta y tóxico para los microorganismos, y en este caso el biorreactor no cesó el sulfato de reducción de la actividad.
Figura 6. Rendimiento del biorreactor antes (A) y después (B) la adición TCE. Sulfato (SO 4 2-) (◇), sulfuro(H 2 S) (•). Los datos presentados son el promedio y desviación estándar de n = 3. Esta cifra se ha tomado de Guerrero-Barajas et al. (2014) 12 con el permiso correspondiente de derechos de autor. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Para el experimento en el que el lodo se probó en la capacidad de reducir TCE, los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 1. El sulfato de reducción de la actividad obtenida fue ligeramente inferior a la obtenida antes de la adición TCE y aproximadamente el 80% de la TCE se redujo a eteno (ver Tabla 1). Estos resultados deben ser la espera de acuerdo al tiempo en el que el reactor había estado operando en condiciones reductoras de sulfato. Es poco probable que la reducción de TCE se produce si se toma el lodo cuando el reactor está funcionando en el Período I o II (véase la Figura 5
| Parámetro | Valor durante la prueba de reducción de TCE | ||
| Porcentaje de SO 4 2- eliminación (%) | 98 (± 0,06) | ||
| Sulfuro (H 2 S) concentración (mg / L) | 971 (± 72) | ||
| Porcentaje de conversión de SO 4 2- a H 2 S (%) | 68 (± 2) | ||
| Porcentaje de remoción de DQO (%) | 93 (± 0,1) | ||
| intervalo de pH | 7.1 a 7.7 | ||
| La producción de gas (ml / d) | 200 (± 55) | ||
| Actividad reductora de sulfato (mg de COD-H 2 S / g VSS * d) | 161 (± 7) | ||
| * Concentración final TCE (M) | 77 (± 8) | Concentración de cloruro de vinilo (M) | 16 (± 0,3) |
| El eteno concentración (M) | 202 (± 81) | ||
| Porcentaje de remoción de TCE (%) | 74,3 (± 14) |
. Tabla 1. Resultados sobre el desempeño de los lodos sulfidogénicos durante el experimento biodegradación TCE Esta tabla ha sido modificado desde Guerrero-Barajas et al (2014) * concentración inicial TCE:.. 300 M. Los datos presentados son la media y la desviación estándar de n = 3.
Después de la prueba de reducción de TCE, los resultados para la reducción del sulfato, concentración de sulfuro, el consumo de DQO y variaciones de pH en el tiempo se muestran en la Figura 6B. Estos resultados muestran que el sulfato se reduce en 5 hr y la concentración de sulfuro alcanzó 1.400 ± 35 mg / L, junto con un sulfato de reducción de la actividad de248 ± 22 mg DQO-H 2 S / g VSS * d. El ligeramente mayor reducción de la actividad de sulfato - en comparación con 188 ± 50 mg DQO-H 2 S / g VSS * d - indica que la comunidad microbiana no fue inhibida por el TCE.
Resultados sobre los microorganismos identificados en los lodos utilizados en este protocolo se presentan en la Tabla 2. Sulfato de reducción de las bacterias, fermentación de bacterias y bacterias deshalogenante fueron identificados en el lodo desarrollado mediante el uso de este protocolo. Los resultados no son sorprendentes porque el biorreactor estaba operando durante un año bajo condiciones reductoras de sulfato y varios días con TCE. Géneros de bacterias como Desulfovibrio, Desulfomicrobium, Desulfitobacterium, Clostridium, Dehalobacte ry Sulfurospirillum haber estado relacionado con la reducción del sulfato y la biodegradación de compuestos clorados. Además, la identificación de estos microorganismos en el lodoconfirma que el protocolo fue exitosa en el desarrollo de un lodo sulfidogénicos que puede ser utilizado para la eliminación simultánea de sulfato y el tricloroetileno, que es uno de los compuestos más tóxicos clorados.
| Las bacterias reportado | Alta similitud | max ident |
| gi | 386685641 Uncultured Desulfovibrio sp. | Desulfovibrio desulfuricans | 96% |
| gi | 386685640 Uncultured Desulfomicrobium sp. | Norvegicum Desulfomicrobium | 99% |
| gi | 386685639 Uncultured Desulfomicrobium sp. | Baculatum Desulfomicrobium | 99% |
| gi | 386685638 Uncultured Desulfomicrobium sp. | Desulfomicrobium hipogeium | 99% |
| gi | 386685637 Uncultured Desulfotomaculum sp. | Acetoxidans Desulfotomaculum | 99% |
| gi | 386685636 Uncultured Clostridium sp. | Celerecrescens Clostridium | 99% |
| gi | 386685635 Uncultured Desulfovibrio sp. | Desulfovibrio halophilus | 98% |
| gi | 386685634 Uncultured Dehalobacter sp. | Restrictus Dehalobacter | 99% |
| gi | 386685633 Uncultured Desulfitobacterium sp. | Desulfitobacterium hafniense | 99% |
| gi | 386685632 Uncultured Sulfurospirillum sp. | Sulfurospirillum multivorans | 97% |
| gi | 386685631 Uncultured Sulfurospirillum sp. | Halorespirans Sulfurospirillum | 97% |
Tabla 2. Consorcio identificó en el lodo del biorreactor y su similitud con otras bacterias ident Max:. Identidad máxima.
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Discussion
Hay varias aplicaciones de sulfidogenesis en biotecnología ambiental, una de las aplicaciones más utilizadas del metabolismo de las bacterias reductoras de sulfato en consorcios con la fermentación de bacterias es en el tratamiento de aguas residuales. Reactores UASB son algunos de los principales enfoques de ingeniería para el tratamiento de aguas residuales industriales con altas concentraciones de sulfato. En este trabajo, se presenta un protocolo para obtener lodos sulfidogénicos de sedimentos marinos en un reactor UASB. Los pasos críticos en el protocolo para obtener un lodo sulfidogénicos de sedimentos marinos son: (1) la promoción de la homogeneidad de la muestra de sedimento para ser colocado en el reactor, (2) alimentar la concentración correcta de los ácidos de sulfato y de ácidos grasos volátiles (COD / SO 4 2-) ratio, (3) analizar el sulfato, sulfuro, DQO y pH periódicamente, (4) refrescante el medio basal, que contiene metales traza y vitaminas cada vez que se inicia un proceso por lotes. Es importante tener en cuenta que el desarrollo de la sludge depende en gran medida de la comunidad microbiana de la muestra original y sobre los balances de masa correctas (sulfato y COD). Aunque se necesita tiempo para el sulfato de reducción de la actividad a desarrollar, el biorreactor requiere una vigilancia continua para evitar fugas, accidentes o falta temporal de energía que pueden detener la bomba de recirculación o apagar el control de la temperatura. Especial atención debe ser pagado en el ejercicio del análisis de sulfuro, sulfato y DQO.
Los sedimentos marinos en general son una fuente natural de una amplia variedad de microorganismos; es probable que el lodo se puede formar con sedimentos marinos tomadas de diferentes profundidades. En este protocolo se optó por utilizar los sedimentos marinos hidrotermales por dos razones principales: (1) estos respiraderos poco profundas se encuentran cerca de los costos y (2) este tipo de sitios son más abundantes en sulfuros, que es una indicación de la reducción de sulfato y por lo tanto, de la presencia de bacterias reductoras de sulfato. En todo caso, tomar los sediments de cualquier otro lugar en el suelo submarino sólo se requerirán más tiempo para que el lodo para desarrollar, aunque creemos que esto es muy poco probable.
Además, es necesario llevar a cabo varias pruebas de reducción de TCE para promover la presencia de microorganismos en el lodo deshalogenante ser identificado aún más siguiendo el procedimiento sugerido en este protocolo o cualquier otra técnica de biología molecular. Es importante tener en cuenta que el desarrollo de microorganismos deshalogenante también depende de la fuente de los lodos, aunque la literatura se refiere a la presencia de este tipo de microorganismos en varios sedimentos marinos en todo el mundo 7. Se recomienda una reducción de sulfato de ensayo de actividad después de la exposición de los lodos al compuesto tóxico con el fin de evaluar la viabilidad de los lodos sulfidogénicos después de una condición de estrés, por ejemplo, la presencia de TCE. Si la reducción de la actividad de sulfato de los lodos disminuye será necesario para mantener la que several semanas en un modo por lotes alimentados con sulfato y DQO para promover de nuevo el aumento de la actividad reductora de sulfato. Esto se puede hacer siguiendo los pasos sugeridos en el protocolo para promover sulfidogenesis y el crecimiento de los microorganismos. Es importante mencionar que se intentó obtener un lodo-sulfidogénicos deshalogenar mediante la adición de sulfato de TCE y desde el inicio del cultivo de los sedimentos, pero sin actividad (ya sea sulfato de reducir o deshalogenar) se observó nunca. Se asumió que el bajo contenido de microorganismos presentes en las primeras etapas de la cultura no tolerar el TCE (incluso a 20 concentración mu M), sin embargo, la adición de TCE desde el comienzo del enriquecimiento siempre se puede intentarse con otros sedimentos.
Un buen resultado en este caso fue la reducción de TCE a eteno, sin embargo, dependiendo de los microorganismos que podrían haberse desarrollado en el lodo la reducción de TCE puede producir principalmente dichloroethenes y Vincloruro de il (VC). En este caso los datos obtenidos para la reducción TCE se registraron después de cada ciclo de HRT en el biorreactor en vez de muestreo para TCE y sus productos intermedios constantemente durante la prueba. Fue hecho de esa manera con el fin de evitar la evaporación de los compuestos clorados debido al muestreo frecuente. Por lo tanto, no hay gráficos de concentración de TCE más de tiempo para mostrar pero las concentraciones al final de cada experimento. Es importante evitar la evaporación de los compuestos volátiles clorados reportar concentraciones exactas de ellos y para distinguir si los cambios pueden atribuirse a la reducción biológica en lugar de pérdidas. La presencia de eteno y la ausencia de productos intermedios comunes de TCE como cis -1,2-dicloroetileno en los productos finales después de la reducción TCE es particularmente interesante. Siempre se ha informado de que la reducción TCE completa a eteno se puede llevar a cabo únicamente por Dehalococcoides sp. y en este caso estos microorganismos no se detectaron entre los géneros identificados en el lodo. Atribuimos la reducción TCE a la cometabolismo que puedan haber surgido en el lodo entre los dehalorespiring, la fermentación y el sulfato de reducción de las bacterias. Un defecto en este consorcio es que promueve la formación transitoria de VC, un compuesto más tóxico que el TCE, sin embargo, está presente en concentraciones relativamente bajas. Puede ser posible decir en este punto que una actividad cometabolismo muy inusual fue desarrollado por el consorcio y que una nueva vía de reducción de TCE bajo sulfato reductoras puede investigarse más en presencia de los microorganismos halorespiring identificados en este trabajo. Por otra parte, se ha informado anteriormente de que genes deshalogenante se detectan con frecuencia en los sedimentos marinos del subsuelo, pero no hay informes sobre la biodegradación de TCE con sedimentos submarinos combinadas con condiciones reductoras de sulfato, esto es, usando sulfato como aceptor de electrones alternativo.
Una de las limitaciones de este método es que la estructura de los lodos depende de las características físicas de los sedimentos utilizado y aunque en este método, el lodo formado permitió una buena fluidización del reactor y la formación de biofilm en el cristal, no puede predecir cómo que funcionaría en realidad utilizando sedimentos de diferentes lugares. Puede ser posible utilizar reactores más pequeños para llevar a cabo pruebas preliminares yobservar si es factible. Si la intención es operar con el lodo en un biorreactor, no se recomienda a partir de microcosmos. La sugerencia es establecer el reactor desde el principio, aunque con un volumen más pequeño para el primer intento.
El método presentado aquí es significativa en que el lodo formado tolera concentraciones de sulfuro más altos que otros lodos sulfidogénicos que se obtienen a través de la adaptación de lodo granular metanogénica a sulfidogenesis. El método promueve la formación de un lodo con un consorcio que incluye bacterias reductoras de sulfato y las bacterias de fermentación y se adapta fácilmente para biodegradar compuestos tóxicos. En este protocolo se utilizó TCE como un ejemplo de un compuesto tóxico que sólo se ha biodegradado en condiciones metanogénicas en reactores UASB. Por ejemplo, si el propósito del reactor es biotransformar disolventes clorados que podría ser útil para aumentar gradualmente la concentración de disolvente, es decir, TC mayorLa concentración de E en las pruebas, mientras que la disminución de la concentración de sulfato para estimular la deshalogenación sobre la reducción del sulfato. Aunque, de acuerdo con los resultados obtenidos en este trabajo, seguimos pensando que el sulfato no se puede eliminar por completo de la cultura si las condiciones reductoras de sulfato son deseables. Por otra parte, las condiciones reductoras de sulfatos deben mantenerse, ya que algunos dehalorespirers también son reductores de sulfato. Los lodos generados en las condiciones descritas en este protocolo podría utilizarse finalmente para eliminar simultáneamente DQO, sulfato, compuestos tóxicos clorados y metales pesados. Los metales pesados pueden precipitar con el sulfuro producido por el lodo.
Finalmente, el lodo sulfidogénicos formado puede ser probado para: (1) la tolerancia de las concentraciones de sulfuro superiores (por ejemplo, para precipitar los metales pesados), (2) la biodegradación de otros contaminantes orgánicos, o (3) el consumo de hidrocarburos como donadores de electrones en lugar de ácidos grasos volátiles a further explorar sus aplicaciones en la biotecnología ambiental. Es importante tener en cuenta que una vez que se forma el lodo que puede ser utilizado como lodos de semilla para inocular otros reactores. En cuyo caso, el proceso de reducción del sulfato ocurrirá inmediatamente y por lo tanto, no será necesario esperar un año para operar completamente el biorreactor.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| trichloroethylene | sigma Aldrich | 251402 | |
| cis-1,2-dichlorotehylene | sigma Aldrich | ||
| trans-1,2-dichloroethylene | sigma Aldrich | D-62209 | |
| vinyl chloride scotty standard | supelco | 1,000 ppm v/v in nitrogen | |
| ethene scotty standard | supelco | 99% purity | |
| pump | Masterflex | Model 7553-75 | |
| spectrophotometer | any | ||
| microcentrifuge | any | ||
| gas tight syringes | any | 100 and 200 microliters | |
| UASB glass reactor | any | under design | |
| gas chromatograph | any | FID detector | |
| capillary column SPB-624 | supelco | ||
| pH meter | any | ||
| viton tubing | Masterflex | ||
| basal medium reagents | any | ||
| trace metals reagents | any | ||
| vitamins solution reagents | any | ||
| sodium sulfate | any | ||
| volatile fatty acids | any | ||
| COD determination kit | HACH | range 0-15,000 mg/L | |
| TOPO-TA cloning kit pCR®4.0 | Invitrogen, US | ||
| S.N.A.P. TM Miniprep Kit | Invitrogen, UK | ||
| Pure link TM Quick Plasmid Miniprep kit | Invitrogen |
References
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