Udvikling af Sulfidogenic Slam fra marine sedimenter og Trichlorethylen Reduktion i en opadgående strømning Anaerob Slam Blanket Reactor

Introduction

Et af de vigtigste bidrag til miljømæssig bioteknologi var design af bioreaktorer, hvor slammet anvendes (inokulum) var i stand til at udføre under sulfat reducerende forhold. Sulfatreduktion (SR) tillader behandling af spildevandsstrømme, der indeholder høje koncentrationer af sulfat i tillæg til den samtidige fjernelse af COD, tungmetaller og organiske forurenende stoffer, et faktum, der gør SR en ønskelig egenskab af slammet ^1. Nogle eksempler på spildevand forurenet med sulfat kommer fra garveri, papir, farmaceutiske og kemiske fremstillingsindustri ^1. Meste af litteraturen refererer dog til sulfidogenic slam når metanfase granuleret slam er tilpasset sulfidogenesis ^2. Denne tilpasning er almindeligt opnås ved at manipulere COD / SO _{⁴ 2-} forhold i bioreaktoren og tilsætte kemikalier til at hæmme methanogener i slammet ^2,3. Ud over den lange tid, may kræver dannelsen af ​​de sulfidogenic granulat, konkurrencen mellem methanogener og sulfat reduktionsgear og tolerancen af ​​slammet til høje koncentrationer af sulfid er nogle af de vigtigste problemer, der kan opstå, hvis sulfidogenic slam anvendt i bioreaktoren er fremstillet af tilpasningen af overvejende metanfase slam til sulfat reducerende betingelser. I dette arbejde, vi beskrive proceduren for at opnå en overvejende sulfidogenic slam fra hydrotermiske væld sedimenter (Punta Mita, Nayarit, Mexico) i en opstrøms anaerob slam tæppe reaktor (UASB), så vi vurdere dens sulfat reducerende aktivitet over tid og gennemføre et eksperiment at evaluere dens anvendelse på reduktiv dechlorering. Placeringen af sedimenter blev valgt, fordi det er blevet rapporteret, at på det pågældende sted er dannelsen af sulfider på grund af sulfat reducerende aktivitet udvist af det mikrobielle samfund lever det pågældende sted ^4.

Der er several fordele ved at opnå denne sulfidogenic slam fra sedimenter i løbet tilpasse metanfase granuleret slam til sulfidogenesis. Nogle af disse fordele er: (1) det er ikke nødvendigt at danne granulat til bioreaktoren for at drive, (2) slammet tolererer relativt høje koncentrationer af sulfid i forhold til andre UASB der opererer med tilpasset metanfase slam og (3) er der ingen konkurrence om substrat med methanogener selvom acetat anvendes i blandingen af ​​flygtige fedtsyrer, der er inkluderet i dyrkningsmediet for at fremme dannelsen af ​​slammet.

Denne procedure blev fulgt for at fremme sulfidogenesis fordi marine sedimenter er en naturlig pulje af en bred vifte af mikroorganismer, såsom sulfat reducerende bakterier, gærende bakterier og bakterier dehalogenering blot at nævne nogle få ^5,6. Den type konsortium udviklet sig fra marine sedimenter ved hjælp af denne protokol kan udvise effektivitet i sulfat reduktion og dermed, høje s ulfate reducerende aktivitet over tid og højere tolerance over for sulfid ved koncentrationer højere end den rapporteret som giftigt for methanogener og sulfat reducerende bakterier. På den anden side er det sandsynligt, at dehalogenering kapacitet også er vist i sedimenterne ved at følge protokollen foreslået her, men det kan afhænge af den oprindelige mikrobielle samfund. Denne antagelse er gjort baseret på det faktum, at reduktiv dechlorering kan ske enten ved respiration eller cometabolisme begge forhold, der kan fremmes i det marine mikrobielle samfund ^7. Dyrkningen af ​​sedimenter for at opnå slammet blev udført ved anvendelse af en blanding af acetat, propionat og butyrat som substrat, fordi disse flygtige fedtsyrer anvendes af flere stammer af sulfat reducerende bakterier. Disse syrer er også den type kulstofforbindelser ofte findes i marine sedimenter, ifølge flere rapporter i litteraturen om kulstofholdige materiale i havet sedimenter ^5,6.

indhold "> Endelig er nogle af de mest giftige forbindelser, der findes i grundvand og andre vandområder rundt om i verden er de chlorerede opløsningsmidler, såsom trichlorethylen (TCE) eller perchlorethylen (PCE). Disse forbindelser er giftige, ikke blot til mennesket, men også for mikroorganismer, især TCE, som stadig betragtes som en prioritet forurenende af Environmental Protection Agency i USA ^8.. I dette arbejde foreslog vi et eksperiment, hvor sulfidogenic slam testet på sin evne til at reducere TCE ved koncentrationer, der er i interval rapporteret for chlorerede forbindelser bionedbrydning under methanogene forhold ^9,10. Det er værd at nævne, at det meste af den forskning om biologisk nedbrydning af klorerede forbindelser er blevet udført under methanogene forhold ^9,10. Vi mener, at forsøget med TCE foreslås i denne protokol er en godt eksempel på de mulige anvendelser af slammet. Formålet med dette forsøg var at evaluate tolerancen af ​​slammet til TCE og TCE virkning på sulfat reducerende virkning. Under hensyntagen til, at det meste af den forskning om biologisk nedbrydning af klorerede forbindelser udføres under metanogene betingelser, denne protokol foreslår dannelsen af ​​et slam kan bruges til samtidig: (1) fjerne sulfat, (2) at fjerne COD og (3) fjern chlorerede forbindelser. Et yderligere skridt kunne være at vurdere slam på samtidig fjernelse af TCE og tungmetaller (foruden sulfat og COD), to betingelser, der ikke kan evalueres under methanogene forhold.

Protocol

Figur 1. Ordning for trinene i protokollen. Klik her for at se en større version af dette tal.

1. Saml marine sedimenter for dannelsen af ​​slam

1. Identificere en tilgængelig undersøisk område enten tæt på hydrotermiske væld (på grund af tilstedeværelsen af ​​sulfider, hvilket kan indikere en højere sulfat reducerende virkning) eller til et område, hvor rester af organisk stof er påviselige.
2. I forbindelse med dette arbejde, tage cirka 3 eller 4 kg sediment og dræne vandet væk prøverne. Placer prøverne i mørke plastikposer. Der kræves ingen køling.
3. Når i laboratoriet, holde poserne med prøverne i køleskabet, hvis de ikke skal anvendes straks. I forbindelse med dette arbejde, SAMPles kan være i køleskabet i uger eller måneder, før du bruger dem.
4. Tag en stor del af prøven sediment (dvs. 1 eller 2 kg) og bruge en passende mesh (0,2 cm) for at udelukke fra sedimenter den store resterne af carbonholdigt materiale, der kan findes eller visse sten, der kan være til stede.
   Bemærk: I dette tilfælde en maske 0,20 cm diameter (0,0767 in) blev anvendt, men det kan være af en anden størrelse i forhold til størrelsen af ​​partiklerne i prøven.
   1. Efter at have passeret sedimentet gennem masken, bland den del udvalgt til at fremme, at delen er homogen.
   2. Tag adskilt mindre prøver (dvs. 2 til 3 g), for at bestemme de flygtige suspenderede stoffer indhold (VSS) ved at følge standardmetoder ^11.
      Bemærk: Se figur 2 for trin 1.2 til 1.4.

Figur 2. Fotografier af sedimentprøverne.(A) Sedimentprøver lige når de er taget. (B) Sediment prøve efter at have passeret gennem masken. (C) Prøve taget til vejning forud for flygtige suspenderede stoffer (VSS) beslutsomhed. Petriskålen behøver ikke at blive steriliseret. Klik her for at se en større version af dette tal.

2. bioreaktor Set Up

1. I forbindelse med dette arbejde, at bruge en UASB glasreaktionsbeholder med et samlet arbejdsvolumen på 3 L. Alternativt kan du bruge en 1 eller 2 L volumen glas reaktor.
2. Baseret på VSS indholdet af sedimenter beregne mængden af ​​sediment, der skal anvendes som inokulum til opnåelse af 5 g VSS i 1 L.
3. Tage hensyn til, at hvis mængden af ​​sediment efter beregning er for stor, bør derefter ca. 25% til 30% volumen bioreaktoren være besat af sedimenter i stedet.
   1. Optag VSS indholdet, da detændres, når mikrobielle samfund er beriget i bioreaktoren. Der er behov for VSS indhold til beregningerne af sulfat reducerende aktivitet i bioreaktoren.
4. Sikre, at den endelige koncentration af det basale medium og pufferopløsning i bioreaktoren svarer til den rapporteret af Guerrero-Barajas et al. (2014) ^12.
   1. Sikre, at de endelige mængder af de sedimenter, basalt medium, bufferopløsning og flygtige fedtsyrer er lig med den endelige arbejdsvolumen på reaktoren. Det basale medium opskrift ^{12 indeholder} de nødvendige koncentrationer for spormetaller og vitaminer opløsning.
   2. Der fremstilles en stamopløsning af basalt medium og pufferopløsning i en passende koncentration til arbejdsvolumen af reaktoren anvendes (dvs., 2, 3 eller 4 gange mere koncentreret end den rapporterede i trin 2.4) for at sikre, at når det fortyndes, er det ved koncentrationen rapporteret af Guerrero-Barajas et al. (2014)^12).
      Bemærk: Stamopløsningen til det basale medium er altid nødvendigt, er imidlertid kun nødvendig pufferopløsning ved opstarten. Det er ikke nødvendigt at tilføje pufferopløsning efter dette tidspunkt.
   3. Der fremstilles en stamopløsning af flygtige fedtsyrer: acetat, propionat og butyrat i en 2,5: 1: 1 COD andel. Tag højde for beregningerne af natriumacetat indgår i det basale medium. Den endelige COD-koncentrationen i reaktoren skal være 2,7 g / L.
      Advarsel: Forbered denne løsning i et stinkskab. Bær nitril handsker og beskyttelsesbriller for udarbejdelsen af ​​denne løsning. Tage hensyn til støkiometrien af de reaktioner sulfat med de flygtige fedtsyrer, der er vist i figur 3.
   4. Der fremstilles en stamopløsning af natriumsulfat _{(Na2SC 4)} i en passende koncentration til at levere til reaktoren en slutkoncentration på 4.000 mg / l af sulfat-ion (SO _{⁴ 2-).} Alternativt omfatter the mængde sulfat, der kræves i det basale medium stedet for at tilføje det fra en stamopløsning, så længe den endelige sulfat (SO _{⁴ 2-)} koncentration er rigtige.
5. Placer sedimenter i reaktoren blandet med en del af det basale medium for at sikre de når bunden af ​​reaktoren.
   1. Tilsæt resten af ​​det basale medium og pufferopløsning blandedes med flygtige fedtsyrer opløsning, og sulfat-opløsning. Sørg for, at løsningen af ​​flygtige fedtsyrer hældes i væsken. Bemærk: Udfør dette trin i et stinkskab.
   2. Indstil forbindelser og rørledninger i reaktoren til recirkulationspumpen. Indstil genanvendelse strømningshastighed på 60 ml / min. Indstil bioreaktoren i kammertemperaturen ved 34 ° C. Kontrollér regelmæssigt, at temperatursvingninger er små (dvs. 34 ± 1,7 ° C)
   3. Indstil forbindelserne til kolonnen gasfortrængning.
      Bemærk: Se figur 4 for trin 2.1 til 2.5.
   </ ol>

   
   Figur 3. Støkiometri af sulfat reduktion med VFA (acetat, propionat og butyrat). Klik her for at se en større version af dette tal.

   
   Figur 4. UASB reaktor. (A) Indledende tid. (B) Kontinuerlig regime efter 300 dages drift. Klik her for at se en større version af dette tal.

   3. Drift af reaktoren for at fremme Sulfidogenesis og vækst af mikroorganismerne

   Bemærk: Lad for inoculum at forbruge volatile fedtsyrer og sulfat. Til dette formål, vente en uge til at foretage den første analyse for sulfat, sulfid og COD forbrug.

   1. Efter en uges inkubation udtage en prøve på 5 til 7 ml af væsken til at foretage analyser for COD, sulfat og sulfid indhold og pH efter standardmetoder ^{11, 13.}
      1. Analyser sulfid i væsken spektrofotometrisk (ved en bølgelængde (λ) på 670 nm) ved at følge methylenblåt metode ^13.
         1. Placer 5 ml af en zinkacetat-opløsning (2% vægt / vægt) i en 25 ml målekolbe, tilsættes hurtigt 200 pi af prøven til zinkacetatopløsning.
         2. Tilføj 2,5 ml af en N, N-dimethyl-p-phenylendiamin oxalat (DMP) opløsning (0,2% vægt / vægt i _20% H2 SO ₄₎ og 125 pi af jern (III) ammoniumsulfatopløsning (10% vægt / w i 2% H _{2 SO 4)} og komplet med destilleret vand 25 ml i målekolbe. Vent 30 min for reaktionenat forekomme, tidspunkt, hvor den blå farve er stabiliseret. ^13.
            Bemærk: Vent mindst 15 minutter, men ikke mere end 60 min at teste prøverne i spektrofotometer. Gennemføre aflæsningen af ​​det blå endelige løsning i spektrofotometeret.
      2. Analyser sulfat ifølge standardmetoder ^11. Her kvantificere sulfat som bariumsulfat ved hjælp af en turbidimetrisk metode.
         1. Placer 5 ml af en konditionering opløsning (saltsyre HCI 1: 1) i en målekolbe på 25 ml, tilsættes 1 ml af den tidligere centrifugeret prøve (ved 11.320 × g), udfyld den 25 ml målekolben med destilleret vand og tilsættes 1 g bariumchlorid.
         2. Bland opløsningen i 1 minut i en hvirvel. Vent til 4 min for barium sulfat til at danne og læse prøven i spektrofotometer ved en bølgelængde (λ) på 420 nm ^11.
      3. Analyser COD ifølge standardfremgangsmåder ^11. Alternativt kan du bruge en COD determination kit.
         1. Forud for COD bestemmelse, centrifugeres prøven grundigt (ved 11.320 xg) for at fjerne resterende sulfid, der kan blande sig i bestemmelsen. Hvis det er nødvendigt, centrifuge to gange: første gang umiddelbart efter prøveudtagningen og anden gang vente 6 eller 8 timer og derefter gennemføre COD-analyse.
         2. Tilsæt 2 ml prøve til en reaktion hætteglas med beslutsomhed kit COD, forsegle hætteglasset og homogenisere blandingen ved forsigtig omrøring. Der fremstilles en tom ved tilsætning af 2 ml destilleret vand til en anden reaktion hætteglas og homogenisere blandingen.
         3. Placer hætteglassene i fordøjelsen reaktoren ved 150 ° C i 2 timer. Fjern hætteglassene og lad dem afkøle i mørke. Tag læsninger af hætteglassene i spektrofotometer ved en bølgelængde på 620 nm.
      4. Opnå gasmængden fra kolonne gassen forskydning.
   2. Vente op til en anden 5 til 7 dage, indtil sulfat forbruges. Sulfat og COD skal forbruges i enpproximately 85% til 90%, før en ny fed-batch startes.
   3. Når sulfat (og COD) forbruges, helt gentage trin 2.4. Leverer frisk medium og nye næringsstoffer til hvert parti.
   4. Gentag trin 3.1 og 3.2. På dette tidspunkt hvert parti skal vare mellem 7 og 10 dage.
   5. Når 3 til 4 batches er blevet afsluttet, gentag trin 2.4 men øger COD fusions 4 g / L.
   6. Gentag trin 3.1 og trin 3.2.
      1. Gentag trin 3.3 men øger COD fusions 6 g / l.
      2. Gentag 3,6 og 3.6.1 gradvist stigende COD-koncentration indtil det er 10 g / l.
         Bemærk: Kontroller grafen, der præsenterer sulfat (mg / L) mod tiden (d).
   7. Når sulfat forbruget er over 80% på mindre end 24 timer, og dette sker i mere end en uge, skifte driften af ​​reaktoren til kontinuerlig drift. For den kontinuerlige indstillet den hydrauliske retentionstid (HRT) på 24 timer og vedligeholde sulfatkoncentration ved 4 g / l og CODved 10 g / l.
      Bemærk: Over tidsforbrug sulfatet bør være hurtigere.

   4. Sulfate Reduktion aktivitetstest

   1. Før denne test at sikre, at bioreaktoren under konstant ordning viser mindre end 10% variation i sulfatkoncentration tilbage.
   2. På en given dag, stoppe reaktoren efter en HRT cyklus og adfærd trin 2.4. For trin 2.4.3 bruge en COD-koncentration på 10 g / l.
   3. Når bioreaktoren fødes, tage 5 til 7 ml prøver af væsken og foretage analyser for COD, sulfat, sulfid (trin 3.1) og pH hver time. Optag gasmængden produceret.
   4. Beregn sulfat reducerende virkning ifølge litteraturen ^14.
      
      

   SRA = sulfat reducerende virkning (mg _COD-H2S) / gVSS * d

   m H ₂ COD-H2S

   VSS = flygtige koncentration af suspenderede stoffer

   t = tid (d eller hr)

   5. Gør de tilsvarende grafer, der viser procentdelen af ​​sulfat forbrug versus sulfid koncentration over tid i mg / l. Gøre graferne, der viser procentdel af COD forbruget over tid. Gøre graferne, der viser pH-variation over tid.

   5. trichlorethylen (TCE) Reduktion Test

   1. Før denne test at sikre, at bioreaktoren arbejder under kontinuerlig styret og præsenterer mindre end 10% variation i sulfatkoncentration tilbage. Start ikke denne test, hvis sulfat reduktion i bioreaktoren er mindre end 90%.
   2. Der fremstilles en stamopløsning af trichlorethylen (TCE) under hensyntagen til, at slutkoncentrationen af ​​denne forbindelse i den flydende fase af bioreaktoren skal være 300 uM. Overvej partitioning af forbindelsen til headspace ved hjælp af Henry Thelanders lov dimensionsløs konstant (H') for TCE ved 34 ° C. H'at 34 ° C for TCE er 0,4722.
      
      Advarsel: Forbered denne løsning i et stinkskab og handsker og beskyttelsesbriller.
      1. For eksempel, for en 5.000 uM stamopløsning, beregnes som følger:
         
         Gasfase koncentration TCE = (0,4722) * (5.000) = 2.139 uM. Medtag denne koncentration i forberedelsen af ​​bestanden løsning, da denne mængde TCE vil være i headspace.
         Så i væsken (vand) af stamopløsningen, vil den faktiske TCE koncentrationen være: 5.000 + 2.139 = 7,139 pM. TCE densitet = 1,43 g / ml. Konverter 7139 uM til mg og derefter ved hjælp af tætheden af ​​TCE beregne mængden af ​​TCE til stamopløsning.
         Bemærk: Koncentrationen af ​​TCE stamopløsning may være lavere end 5.000 pM, dvs. 3000 eller 1000 uM, det afhænger af, hvor meget volumen af denne opløsning kan leveres til bioreaktoren ifølge dens fase volumen væske.
   3. Forbered standardkurver i gaskromatografen for TCE, cis-1,2-dichlorethylen, trans-1,2-dichlorethylen, vinylchlorid og ethen. Forbered cis-1,2-dichlorethylen og trans-1,2-dichlorethylen standardkurver ud fra en stamopløsning af disse forbindelser ved at følge samme procedure som beskrevet i 5.2 for TCE stamopløsning. Fremstil kurverne for vinylchlorid og ethen ved at fortynde koncentrationen af ​​hver gas fra standarderne (gasflasker).
      1. Forbered standardkurverne af disse forbindelser i en række 20 til 300 uM. Brug det rapporteret af Guerrero-Barajas et al. (2011) ¹⁵ til analyse af disse forbindelser i gaskromatografen.
         Forsigtig: Forbered disse stårard løsninger i et stinkskab og handsker og beskyttelsesbriller.
   4. På en given dag, stoppe reaktoren efter en HRT cyklus og adfærd trin 2.4. For trin 2.4.3 bruge en COD-koncentration på 10 g / l.
   5. Når bioreaktoren fødes, tilføje TCE direkte til væsken i bioreaktoren fra stamopløsningen fremstillet i 5.2, skal den endelige TCE-koncentrationen i den flydende fase af bioreaktoren være 300 uM. Indstil HRT til 12 timer.
      1. Ved slutningen af ​​en HRT cyklus tager prøver af væsken (500 til 1.000 pi) og adfærd analyse for COD, sulfat og sulfid (trin 3.1.1, 3.1.2 og 3.1.3). Tag prøver af headspace (100 til 250 pi) og gennemføre analyse for TCE, cis-1,2-dichlorethylen, trans-1,2-dichlorethylen, vinylchlorid og ethen i gaskromatografen.
   6. Gentag trin 2.4. For trin 2.4.3 bruge en COD-koncentration på 10 g / l.
   7. Gentag ikke TCE reduktion test indtil bioreaktoren præsenterer over 90% sulfatreduktion og mindre af 10% variation i både, sulfatreduktion og sulfat tilbage i bioreaktoren.
   8. Gentag 5.4, 5.5 og 5.6 to eller tre gange mere.
   9. Tag sedimentprøver (0,5 g) at foretage identifikation af mikroorganismerne lige efter en TCE reduktion test er afsluttet. Gør dette efter 2 eller 3 forsøg TCE reduktion.

   6. Sulfate Reduktion Activity Test efter TCE Reduction Experiment

   1. Gentag trin 4 fuldstændigt.

   7. Identifikation af mikroorganismer

   1. Tag prøver af slam på ca. 0,5 g hver og gennemføre RNA samlede indvinding i henhold til standard metode ^12.
   2. Amplificere 16S rRNA-genet med revers transkription og udfører polymerasekædereaktion (RT-PCR) amplifikation et trin ^12.
   3. Designe primere til at forstærke eller bruge som en indledende tilgang dem foreslået i litteraturen ^11. Følg amplifgement procedure foreslået i litteraturen ^12.
   4. Konstruere 16S rRNA biblioteker. PCR amplikoner kan klones ved hjælp af en kloning-kit ^11. Typisk kan 10 kolonier fra hver plade (hver koloni repræsenterer en PCR-produkt) klones. Forbered plasmid DNA til sekventering ifølge fremgangsmåden foreslået i litteraturen ^12.
   5. Gennemføre den sekventering af fragmenter. Re-amplifikation ca. 1.400 bp af PCR eksterne produkter med protokollen til PCR-amplifikation beskrevet tidligere (trin 7,4) og klon ifølge fremgangsmåden foreslået i litteraturen ^12. Isoler det rekombinante plasmid fra E. coli kolonier som foreslået i litteraturen ^12. Gå gennemføre den delvise procedure for sekventering med universelle primere M13 ^12.
   6. Gennemføre den sekvenser analyse. Juster nukleotidsekvenserne ved hjælp af Clustal X og manuelt justere i teksteditoren. Udfør BLAST ransagninger af NCBI database. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi) ^12.
   7. Opnå nukleotidsekvens deponeringsnumre. Depositum nukleotidsekvenserne af de identificerede i EMBL nukleotidsekvensdatabase (Gen-Bank / EMBL / DDBJ) i de tilsvarende accessionsnumre (dvs. JQ713915eJQ713925 for sekvenser fra amplikoner) ¹² kloner.

Representative Results

En typisk opførsel af sulfatreduktion i bioreaktoren er vist i figur 5. Det er vigtigt at bemærke, at i de første ugers drift sulfatreduktion vil være langsom. Men langsomt, forbruget af over 90% af sulfat over tid for, at inokulum er ved at udvikle en mikrobiel fællesskab stand til at reducere sulfat og derfor beriget med sulfat reducerende bakterier. De forskellige perioder i figuren indikerer, at sulfatreduktion øgede sin hastighed over tid. I begyndelsen, partiet tog 20 dage for sulfat reduceres (Periode I), så dens reduktion sats var stigende, og det tog ca. 10 dage for at reducere fodret sulfat (Periode II). Periode III præsenterede mindre variation i sulfat reduktion og dette blev opnået i et gennemsnit på 10 dage, som det ses i figur 5. Efter denne periode, reduktion af sulfat tog gennemsnitligt 4 dage (periode IV) og i perioden V 4.000 mg / l af sulfatblev forbrugt i mindre end 24 timer. Forestillingen i bioreaktoren blev sat under kontinuerlig tilstand efter 200 dage på HRT af 24 timer.

Figur 5. sulfat (SO _{⁴ 2-)} koncentration over tid under dannelse af sulfidogenic slam i bioreaktoren. Den fuldt optrukne linje betegner tilløb sulfat koncentration. Firkanter henviser til sulfat koncentration i spildevandet. Dette tal er taget fra Guerrero-Barajas et al. (2014) ¹² med den tilsvarende tilladelse ophavsret. Klik her for at se en større version af dette tal.

Repræsentative gode resultater på sulfatreduktion, sulfid koncentration, COD forbrug og pH-variationer over tid shegne i figur 6A. Disse resultater blev opnået i eksperimenter udført, når bioreaktoren blev under kontinuerlig styret næsten et år. På dette tidspunkt mikrobielle samfund blev udviklet i bioreaktoren og en sort slam blev dannet som det kan ses i figur 4B. I figur 6A kan det ses, at sulfat blev reduceret i 4 timer og sulfid nåede en maksimal koncentration på 1.200 ± 30 mg / L og 188 ± 50 mg _COD-H2S / g VSS * d blev sulfat reducerende virkning. Det er værd at nævne, at koncentrationen af ​​sulfid opnået i bioreaktoren anses for høj og toksiske for mikroorganismer, og i dette tilfælde bioreaktoren ikke ophøre med sulfat reducerende virkning.

Figur 6. Udførelse af bioreaktoren før (A) og efter (B) TCE tilsætning. Sulfat (SO _{⁴ 2-)} (◇), sulfid_(H2S) (•). Data er den gennemsnitlige og standardafvigelsen for n = 3. Dette tal er taget fra Guerrero-Barajas et al. (2014) ¹² med den tilsvarende tilladelse ophavsret. Klik her for at se en større version af dette tal.

For forsøg, hvor slammet blev testet på evnen til at reducere TCE, er de opnåede resultater vist i tabel 1. Den sulfat reducerende virkning opnås var en smule lavere end den opnået før TCE tilsætning og ca. 80% af TCE blev reduceret til ethen (se tabel 1). Disse resultater skal det forventede i henhold til den tid, hvor reaktoren havde været i drift under sulfat reducerende forhold. Det er usandsynligt, at TCE reduktion opstår, hvis slammet er taget, når reaktoren er i drift i periode I eller II (se figur 5

Parameter	Værdi under prøven TCE reduktion
Procentdel af SO 4 2- fjernelse (%)	98 (± 0,06)
Sulfid (H2S) koncentration (mg / L)	971 (± 72)
Procent af konvertering af SO 4 2- til H2S (%)	68 (± 2)
Procentdel af COD-fjernelse (%)	93 (± 0,1)
pH-interval	7,1-7,7
Gasproduktionen (ml / d)	200 (± 55)
Sulfat reducerende virkning (mg COD-H2S / g VSS * d)	161 (± 7)
* TCE slutkoncentration (uM)	77 (± 8)	Vinylchlorid koncentration (uM)	16 (± 0,3)
Ethen koncentration (uM)	202 (± 81)
Andel af TCE fjernelse (%)	74.3 (± 14)

. Tabel 1. Resultater på udførelsen af sulfidogenic slam under TCE bionedbrydning eksperiment Denne tabel er blevet ændret fra Guerrero-Barajas et al (2014) ^* TCE oprindelige koncentration:.. 300 uM. Data er middelværdien og standardafvigelsen for n = 3.

Efter testen TCE reduktion, er resultaterne for sulfatreduktion, sulfid koncentration, COD forbrug og pH-variationer over tid er vist i figur 6B. Disse resultater viser, at sulfat blev reduceret i 5 timer og sulfid koncentration opnået 1.400 ± 35 mg / L, sammen med et sulfat reducerende aktivitet248 ± 22 mg _COD-H2S / g VSS * d. Den lidt højere sulfat reducerende aktivitet - sammenlignet med 188 ± 50 mg _COD-H2S / g VSS * d - angiver, at den mikrobielle samfund ikke blev hæmmet af TCE.

Resultater på mikroorganismer, der er identificeret i slammet anvendes i denne protokol, er vist i tabel 2. Sulfat reducerende bakterier, gærende bakterier og dehalogenering bakterier blev identificeret i slammet er udviklet ved hjælp af denne protokol. Resultaterne er ikke overraskende, fordi bioreaktoren opererede løbet af et år under sulfat reducerende forhold og flere dage med TCE. Slægter af bakterier såsom Desulfovibrio, Desulfomicrobium, Desulfitobacterium, Clostridium, Dehalobacte r og Sulfurospirillum har været relateret til sulfat reduktion og biologisk nedbrydning af klorerede forbindelser. Identifikationen af ​​disse mikroorganismer i slammetbekræfter, at protokollen lykkedes at udvikle en sulfidogenic slam, kan anvendes til samtidig fjernelse af sulfat og trichlorethylen, som er en af ​​de mest giftige chlorerede forbindelser.

Bakterier rapporteret	Stor lighed	max ident
gi | 386685641 ukultiverede Desulfovibrio sp.	Desulfovibrio desulfuricans	96%
gi | 386685640 ukultiverede Desulfomicrobium sp.	Desulfomicrobium norvegicum	99%
gi | 386685639 ukultiverede Desulfomicrobium sp.	Desulfomicrobium baculatum	99%
gi | 386685638 ukultiverede Desulfomicrobium sp.	Desulfomicrobium hypogeium	99%
gi | 386685637 ukultiverede Desulfotomaculum sp.	Desulfotomaculum acetoxidans	99%
gi | 386685636 uncultured Clostridium sp.	Clostridium celerecrescens	99%
gi | 386685635 ukultiverede Desulfovibrio sp.	Desulfovibrio halophilus	98%
gi | 386685634 ukultiverede Dehalobacter sp.	Dehalobacter restrictus	99%
gi | 386685633 ukultiverede Desulfitobacterium sp.	Desulfitobacterium hafniense	99%
gi | 386685632 ukultiverede Sulfurospirillum sp.	Sulfurospirillum multivorans	97%
gi | 386685631 ukultiverede Sulfurospirillum sp.	Sulfurospirillum halorespirans	97%

Tabel 2. Consortium identificeret i slammet bioreaktorens og dets lighed med andre bakterier Max ident:. Maksimal identitet.

Discussion

Der er flere anvendelser af sulfidogenesis i miljømæssig bioteknologi, en af ​​de mest brugte anvendelser af metabolismen af ​​sulfat reducerende bakterier i konsortier med gærende bakterier er i spildevandsrensning. UASB reaktorer er blandt de vigtigste manipuleret tilgange til industriel spildevandsrensning med høje sulfat koncentrationer. I dette arbejde, præsenterer vi en protokol til at opnå sulfidogenic slam fra marine sedimenter i en UASB reaktor. De kritiske skridt i protokollen til at opnå en sulfidogenic slam fra marine sedimenter er: (1) at fremme homogenitet af prøven sediment, der skal placeres i reaktoren, (2) at fodre den rigtige koncentration af sulfat og flygtige fedtsyrer (COD / SO _{⁴ 2-)} forhold, (3) analyse af sulfat, sulfid, COD og pH periodisk, (4) forfriskende det basale medium, der indeholder spormetaller og vitaminer, hver gang et parti startes. Det er vigtigt at overveje, at udviklingen af ​​den sludge afhænger i høj grad på det mikrobielle samfund i den oprindelige prøve og på de rigtige massebalancer (sulfat og COD). Selv om det tager tid for sulfat reducerende aktivitet at udvikle, bioreaktoren kræver løbende overvågning for at undgå lækager, ulykker eller tidsmæssige mangel på energi, der kan stoppe cirkulationspumpen eller lukke temperaturstyring. Særlig opmærksomhed skal rettes i udførelsen af ​​analysen af ​​sulfid, sulfat og COD.

Marine sedimenter i almindelighed er en naturlig kilde til en lang række mikroorganismer; Det er sandsynligt, at slam kan dannes med marine sedimenter fra forskellige dybder. Det blev i denne protokol, valgt at bruge hydrotermiske marine sedimenter af to hovedårsager: (1) disse lavvandede ventilationskanaler er placeret tæt på omkostningerne og (2) disse type steder er mere rigelige i sulfider, hvilket er en indikation af sulfat reduktion og derfor af tilstedeværelsen af ​​sulfat- reducerende bakterier. Hvis noget, at tage de sediments fra ethvert andet sted i den undersøiske gulvet vil kun kræve mere tid til slammet til at udvikle sig, selv om vi synes, det er meget usandsynligt.

Det er også nødvendigt at gennemføre flere TCE reduktion tests for at fremme nærvær af dehalogenering mikroorganismer i slam, der skal identificeres yderligere ved at følge proceduren foreslået i denne protokol eller en anden molekylær biologi teknik. Det er vigtigt at overveje, at udviklingen af dehalogenering mikroorganismer afhænger også af kilden af slammet, selv om litteraturen henviser til tilstedeværelsen af denne type af mikroorganismer i flere søsedimenter rundt om i verden ^7. Et sulfat reducerende virkning assay anbefales efter udsættelse af slammet til den toksiske forbindelse for at vurdere levedygtigheden af sulfidogenic slam efter en stressende tilstand, f.eks tilstedeværelsen af TCE. Hvis sulfat reducerende virkning af slammet reduceres det vil være nødvendigt at opretholde det several uger i batchvis fodret med sulfat og COD igen for at fremme en forøgelse af sulfat reducerende virkning. Dette kan gøres ved at følge trinene foreslået i protokollen til fremme sulfidogenesis og vækst af mikroorganismerne. Det er vigtigt at nævne, at det blev forsøgt at opnå en sulfidogenic-dehalogenering slam ved tilsætning af TCE og sulfat siden begyndelsen af ​​dyrkningen af ​​sedimenter, men ingen aktivitet (enten sulfat reduktion eller dehalogenering) blev nogensinde observeret. Det blev antaget, at det lave indhold af mikroorganismer til stede i de tidlige stadier af kulturen ikke tolerere TCE (selv ved 20 uM koncentration), men tilsætning af TCE siden begyndelsen af ​​berigelse kan altid forsøgt med andre sedimenter.

Et godt resultat i dette tilfælde en reduktion af TCE til ethen, dog afhængigt af mikroorganismer, der kunne have udviklet sig i slammet reduktion af TCE kan give hovedsageligt dichloroethenes og vinyl chlorid (VC). I dette tilfælde de opnåede data for reduktionen TCE blev registreret efter hver cyklus HRT i bioreaktoren stedet for prøveudtagning for TCE og mellemprodukter konstant under testen. Det blev gjort på denne måde for at undgå fordampning af chlorerede forbindelser på grund af hyppig prøvetagning. Derfor er der ingen grafer af TCE koncentration over tid for at vise, men koncentrationerne i slutningen af ​​hvert forsøg. Det er vigtigt at undgå fordampning af de flygtige chlorerede forbindelser til at indberette nøjagtige koncentrationer af dem, og til at skelne, om der kan tilskrives ændringer til biologisk reduktion i stedet for tab. Tilstedeværelsen af ethen og fraværet af fælles mellemprodukter med TCE såsom cis-1,2-dichlorethylen i slutprodukterne efter reduktionen TCE er særlig interessant. Det har altid været rapporteret, at den komplette TCE reduktion til ethen kan kun udføres af Dehalococcoides sp. Og i dette tilfælde disse microorgamer blev ikke påvist blandt de slægter identificeret i slammet. Vi tilskriver TCE reduktion til cometabolisme som kan være opstået i slammet blandt dehalorespiring, den gærende og sulfat reducerende bakterier. En mangel i denne konsortium er, at det fremmer dannelsen af ​​forbigående VC, en forbindelse mere toksisk end TCE, men det er til stede i relativt lave koncentrationer. Det kan være muligt at sige på dette tidspunkt, at en meget usædvanlig cometabolic aktivitet blev udviklet af konsortiet, og at en ny TCE reduktion vej under sulfat reducerende forhold kan undersøges nærmere i overværelse af de halorespiring mikroorganismer identificeret i dette arbejde. På den anden side er det blevet tidligere rapporteret, at dehalogenering gener ofte påvises i underjordiske marine sedimenter men der er ingen rapporter om TCE bionedbrydning med undersøiske sedimenter kombineret med sulfat reducerende betingelser, det er, ved hjælp af sulfat som en alternativ elektronacceptor.

5,6. Vi vil anbefale kombinationer såsom: acetat-butyrat, propionat-butyrat eller kun butyrat. Men vi anbefaler ikke anvendelsen af ​​lactat fordi når det blev anvendt, oplevede vi udviklingen af ​​sulfat reducerende bakterier, men ophobning af acetat i bioreaktoren og formålet med denne metode er at opnå en slam, som kan bruge acetat. Acetat akkumulation er en mangel i mange af de sulfidogenic reaktorer rapporteret i litteraturen. Desuden har vi ikke forsøgt brugen af ​​alkoholer. På den anden side, anbefaler vi - hvis det ønskes - startende med lavere koncentrations sulfat (dvs. 1 g / L) og gradvist forøge koncentrationen og samtidig opretholde en passende massebalance, dvs den korrekte koncentration af COD i bioreaktoren (COD / SO _{⁴ 2-} ratio). Det er ikke egnet, imidlertid til at begynde med højere koncentrationer af sulfat (højere end 4 g / L), selvom det kan øges over tid sammen med den tilsvarende COD. COD / SO _{⁴ 2-} forholdet kan ligge i et område mellem 0,67 og 2,5 for at starte, og det kan modificeres, når slammet er udviklet.

En af begrænsningerne ved denne metode er, at strukturen af ​​slam afhænger af de fysiske karakteristika af sedimentet anvendes, og selv om der i denne fremgangsmåde slammet dannes have en god fluidisering af reaktoren og dannelsen af ​​biofilm på glasset, kan vi ikke forudsige, hvor ville det rent faktisk arbejder bruge sedimenter af forskellige steder. Det kan være muligt at anvende mindre reaktorer til at udføre undersøgelser, tests ogobservere, hvis det er muligt. Hvis det er hensigten at operere med slammet i en bioreaktor, anbefaler vi ikke at starte med mikrokosmos. Det foreslås at indstille reaktoren fra starten, men med et mindre volumen for det første forsøg.

Metoden præsenteres her er signifikant i at slammet dannes tolererer højere koncentrationer sulfid end andre sulfidogenic slam, der opnås gennem tilpasning af metanfase kornet slam til sulfidogenesis. Fremgangsmåden fremmer dannelsen af ​​slam med et konsortium, der omfatter sulfat reducerende bakterier og fermentering bakterier og kan let tilpasses til bionedbrydes toksiske forbindelser. I denne protokol anvendte vi TCE som et eksempel på en toksisk forbindelse, som kun er blevet nedbrudt under methanogene forhold i UASB reaktorer. For eksempel, hvis formålet med reaktoren er at biotransform chlorerede opløsningsmidler kunne det være nyttigt at gradvist øge koncentrationen opløsningsmiddel, dvs. højere TCE-koncentration i prøverne, mens faldende sulfat koncentrationen til at stimulere dehalogenering løbet sulfat reduktion. Selv efter de opnåede resultater i dette arbejde, mener vi stadig, at sulfat ikke helt kan fjernes fra kulturen, hvis sulfat reducerende betingelser er ønskelige. Desuden bør sulfat reducerende betingelser opretholdes da nogle dehalorespirers er også sulfat reduktionsgear. Slammet genereret under betingelserne beskrevet i denne protokol kunne i sidste ende bruges til at fjerne samtidig COD, sulfat, chlorerede giftige forbindelser og tungmetaller. Tungmetallerne kan udfældes med sulfid produceres af slammet.

Endelig kan sulfidogenic slam dannet testes for: (1) tolerancen af højere sulfid koncentrationer (f.eks til udfældning af tungmetaller), (2) den biologiske nedbrydning af andre organiske stoffer, eller (3) forbruget af kulbrinter som elektrondonorer i stedet for flygtige fedtsyrer til further udforske dens anvendelser i miljømæssig bioteknologi. Det er vigtigt at overveje, at når slammet dannes det kan bruges som frø slam til podning andre reaktorer. I så fald vil sulfatreduktion processen forekomme øjeblikkeligt, og derfor vil det ikke være nødvendigt at vente et år til fuldt ud at drive bioreaktoren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
trichloroethylene	sigma Aldrich	251402
cis-1,2-dichlorotehylene	sigma Aldrich
trans-1,2-dichloroethylene	sigma Aldrich	D-62209
vinyl chloride scotty standard	supelco		1,000 ppm v/v in nitrogen
ethene scotty standard	supelco		99% purity
pump	Masterflex		Model 7553-75
spectrophotometer	any
microcentrifuge	any
gas tight syringes	any		100 and 200 microliters
UASB glass reactor	any		under design
gas chromatograph	any		FID detector
capillary column SPB-624	supelco
pH meter	any
viton tubing	Masterflex
basal medium reagents	any
trace metals reagents	any
vitamins solution reagents	any
sodium sulfate	any
volatile fatty acids	any
COD determination kit	HACH		range 0-15,000 mg/L
TOPO-TA cloning kit pCR®4.0	Invitrogen, US
S.N.A.P. TM Miniprep Kit	Invitrogen, UK
Pure link TM Quick Plasmid Miniprep kit	Invitrogen