Introduction
En av de viktigaste bidragen till miljöbioteknik var utformningen av bioreaktorer där slammet används (inoculum) kunde prestera under sulfat reducerande betingelser. Sulfatreduktion (SR) möjliggör behandling av avloppsvattenströmmar som innehåller höga koncentrationer av sulfat i tillägg till samtidigt avlägsnande av COD, tungmetaller och organiska föroreningar, ett faktum som gör SR en önskvärd egenskap hos slammet 1. Några exempel på avloppsvatten förorenade med sulfat kommer från garveri, papper, läkemedels- och kemisk tillverkningsindustri 1. Men de flesta av litteraturen hänvisar till sulfidogenic slam när metanogena granulärt slam har anpassats till sulfidogenesis 2. Denna anpassning är ofta uppnås genom att manipulera COD / SO 4 2- förhållandet i bioreaktorn och tillsätta kemikalier för att hämma metanogener i slammet 2,3. Förutom den långa tid att may kräver bildandet av sulfidogenic granulat, konkurrensen mellan metanogener och sulfatförminsknings och toleransen av slammet till höga koncentrationer av sulfid är några av de största problemen som kan uppstå om sulfidogenic slam som används i bioreaktorn erhålls från anpassningen av övervägande metanogena slam till sulfat reducerande betingelser. I detta arbete, beskriver vi proceduren för att erhålla en övervägande sulfidogenic slam från hydrotermiska skorstenar sediment (Punta Mita, Nayarit, Mexiko) i en uppåtströmmande anaerob slamreaktor (UASB), sedan utvärderar vi dess sulfat reducerande aktivitet över tid och genomföra ett experiment att utvärdera dess tillämpning på reduktiv deklorering. Placeringen av sedimenten valdes eftersom det har rapporterats att i detta ställe finns det bildas sulfider på grund av sulfatreducerande aktivitet som uppvisas av den mikrobiella miljön bebor den platsen 4.
Det finns several fördelar i att erhålla denna sulfidogenic slam från sediment över anpassa metanogena granulärt slam till sulfidogenesis. Några av dessa fördelar är: (1) det inte är nödvändigt för att bilda granuler för bioreaktorn att fungera, (2) slammet tolererar relativt höga koncentrationer av sulfid jämfört med andra UASB som fungerar med anpassad metanogena slammet samt (3) det finns ingen konkurrens om substrat med metanogener även om acetat används i blandningen av flyktiga fettsyror som ingår i odlingsmediet för att befrämja bildningen av slammet.
Detta förfarande följdes för att främja sulfidogenesis eftersom marina sediment är en naturlig pool av ett stort antal av mikroorganismer såsom sulfatreducerande bakterier, jäsning bakterier och dehalogenering bakterier bara för att nämna några 5,6. Den typ av konsortiet utvecklats från marina sediment med hjälp av detta protokoll kan uppvisa effektivitet i sulfatreduktion och därmed höga s ulfate reducerande aktivitet över tid och högre tolerans mot sulfid vid koncentrationer högre än redovisat som giftigt för metanogener och sulfat reducerande bakterier. Å andra sidan, är det troligt att dehalogenering förmågan visas också i sedimenten genom att följa det protokoll som föreslås här, men det kan bero på den ursprungliga mikrobiella miljön. Detta antagande görs baserat på det faktum att reduktiva deklorering kan ske antingen genom andning eller cometabolism båda villkor som kan främjas i den marina mikrobiella samhället 7. Odlingen av sedimenten att erhålla slammet utfördes genom användning av en blandning av acetat, propionat och butyrat som substrat, eftersom dessa flyktiga fettsyror används av flera stammar av sulfatreducerande bakterier. Dessa syror är också den typ av kolföreningar som ofta återfinns i marina sediment, enligt flera rapporter i litteraturen om kolhaltiga material i havssediment 5,6.
innehåll "> Slutligen, några av de mest giftiga ämnen som finns i grundvatten och andra vattendrag runt om i världen är de klorerade lösningsmedel, såsom trikloretylen (TCE) eller perkloretylen (PCE). Dessa föreningar är giftiga, inte bara till människan, men även mikroorganismer, särskilt TCE, som fortfarande anses vara en prioriterad förorening av Environmental Protection Agency i USA 8. I detta arbete har vi föreslagit ett experiment där sulfidogenic slam testas på sin förmåga att minska TCE vid koncentrationer som är i intervall rapporterats för klorföreningar biologisk nedbrytning i metanogena förhållanden 9,10. Det är värt att nämna att de flesta av forskningen om biologisk nedbrytning av klorerade föreningar bedrivits under metanogena förhållanden 9,10. Vi anser att försöket med TCE föreslås i detta protokoll är en bra exempel på de potentiella tillämpningarna av slammet. Syftet med detta experiment var att evärdera toleransen av slammet till TCE och TCE effekten på sulfat reducerande aktivitet. Med tanke på att de flesta av forskningen om biologisk nedbrytning av klorerade föreningar utförs under metanogena förhållanden, tyder detta protokoll bildandet av ett slam kan användas för att samtidigt: (1) avlägsna sulfat, (2) ta bort COD och (3) ta bort klorerade föreningar. Ett ytterligare steg skulle kunna vara att utvärdera slam på samtidigt avlägsnande av TCE och tungmetaller (förutom sulfat och COD), två villkor som inte kan utvärderas i metanogena förhållanden.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Figur 1. System för stegen i protokollet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
1. Samla marina sediment för bildning av slammet
- Identifiera en lättillgänglig Subsea område antingen nära hydrotermiska skorstenar (på grund av närvaron av sulfider, vilket kan tyda på en högre sulfatreducerande aktivitet) eller till ett område där spillrorna av organiskt material kan detekteras.
- För att detta arbete tar ungefär 3 eller 4 kg sediment och dränera vattnet utanför proverna. Placera proverna i mörker plastpåsar. Det behövs ingen kylning.
- Väl inne i labbet, hålla påsar med proverna i kylskåp om de inte ska användas omedelbart. Vid tillämpningen av detta arbete, samples kan vara i kylskåp i veckor eller månader innan du använder dem.
- Ta en stor del av prov sediment (dvs 1 eller 2 kg) och använda en lämplig mask (0,2 cm) för att eliminera från sedimenten den stora skräp av kolhaltiga material som kan hittas eller några stenar som kan förekomma.
Anmärkning: I detta fall kan en maskstorlek av 0,20 cm i diameter (0,0767 tum) användes men det kan vara av en annan storlek beroende på storleken av partiklama i provet.- Efter att ha passerat sedimentet genom nätet, blanda den del vald för att främja att delen är homogen.
- Ta separerade mindre prover (dvs 2-3 g) för att bestämma de flyktiga suspenderade ämnen (VSS) innehåll genom att följa standardmetoder 11.
Obs: Se Figur 2 för steg 1,2 till 1,4.
Figur 2. Fotografier av sedimentprover.(A) Sedimentprov strax efter att ha tagits. (B) sedimentprov efter att ha passerat genom nätet. (C) Prov taget för vägning före flyktiga suspenderade ämnen (VSS) beslutsamhet. Petriskål behöver inte steriliseras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
2. Bioreaktor Konfigurera
- Vid tillämpningen av detta arbete, använd en UASB glasreaktor med en total arbetsvolym av 3 L. Alternativt kan du använda en 1 eller 2 L volymglasreaktor.
- Baserat på VSS innehållet i sedimenten beräkna mängden sediment som skall användas som inokulum för att erhålla 5 g av VSS i 1 L.
- Ta hänsyn till att om mängden sediment efter beräkning är för stor, bör då ca 25% till 30% volym bioreaktorn upptas av sedimenten i stället.
- Anteckna VSS innehåll eftersom detkommer att förändras när den mikrobiella miljön anrikas i bioreaktorn. VSS innehåll behövs för beräkningarna av sulfat minskar aktiviteten i bioreaktorn.
- Se till att den slutliga koncentrationen av det basala mediet och buffertlösning i bioreaktorn liknar det som rapporterats av Guerrero-Barajas et al., (2014) 12.
- Se till att de slutliga volymerna av sedimenten, basalmedium, buffertlösning och flyktiga fettsyror är lika med den slutliga arbetsvolym av reaktorn. Basmediet receptet 12 innehåller lämpliga koncentrationer för spårmetaller och vitaminer lösning.
- Bered en förrådslösning av basalmedium och buffertlösning i en lämplig koncentration för den arbetande reaktorns volym används (dvs., två, tre eller fyra gånger mera koncentrerad än den rapporterade i steg 2,4) för att säkerställa att när den är utspädd, är det vid koncentrationen rapporterats av Guerrero-Barajas et al. (2014)12).
Obs: Förrådslösningen för det basala mediet är alltid nödvändigt emellertid buffertlösningen endast behövs vid uppstart. Det är inte nödvändigt att tillsätta buffertlösning efter denna tid. - Bered en förrådslösning av flyktiga fettsyror: acetat, propionat och butyrat i en 2,5: 1: 1 COD andel. Ta hänsyn till beräkningarna natriumacetatet ingår i det basala mediet. Den slutliga COD-koncentrationen i reaktorn måste vara 2,7 g / I.
Varning: Bered denna lösning i ett dragskåp. Bär nitrilhandskar och skyddsglasögon för framställning av denna lösning. Ta hänsyn till stökiometrin av reaktionerna från sulfat med de flyktiga fettsyror som visas i fig 3. - Bered en förrådslösning av natriumsulfat (Na 2 SO 4) i en lämplig koncentration för att leverera till reaktorn en slutlig koncentration av 4000 mg / I av sulfatjonen (SO 4 2-). Alternativt inkluderar the mängd sulfat som krävs i det basala mediet i stället för att tillsätta den från en förrådslösning, så länge som den slutliga sulfat (SO 4 2-) koncentration är rätt.
- Placera sediment i reaktorn blandades med en del av det basala mediet för att se till de når botten av reaktorn.
- Tillsätt resten av det basala mediet och buffertlösningen blandas med den flyktiga fettsyror lösning och sulfatlösningen. Se till att lösningen av flyktiga fettsyror hälls in i vätskan. Obs: Genomför detta steg i ett dragskåp.
- Ställ anslutningar och rörledningar i reaktorn till återvinningspumpen. Ställ återvinningsflödeshastighet på 60 ml / min. Ställ bioreaktorn i temperaturkammare vid 34 ° C. Kontrollera regelbundet att temperaturvariationerna är små (dvs 34 ± 1,7 ° C)
- Ställ anslutningarna till gas förskjutnings kolumnen.
Obs: Se Figur 4 för steg 2,1 till 2,5. </ ol>
Figur 3. Stökiometri av sulfat reduktion med VFA (acetat, propionat och butyrat). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. UASB reaktor. (A) Inledande tid. (B) Kontinuerlig regim efter 300 dagars drift. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
3. drift av reaktorn för att främja Sulfidogenesis och tillväxten av mikroorganismerna
Obs: Låt för inokulatet att konsumera volatile fettsyror och sulfat. För detta ändamål, vänta en vecka för att utföra den första analysen för sulfat, sulfid och COD-förbrukning.
- Efter en veckas inkubation ta ett prov av 5 till 7 ml av vätskan för att genomföra analyser för COD, sulfat och sulfid innehåll och pH enligt standardmetoder 11, 13.
- Analysera sulfid i vätske spektrofotometriskt (vid en våglängd (λ) av 670 nm) genom att följa metylenblått metod 13.
- Placera 5 ml av en zinkacetatlösning (2% vikt / vikt) i en 25 ml mätkolv, tillsätt snabbt 200 | il av provet till zinkacetatlösning.
- Tillsätt 2,5 ml av en N, N-dimetyl-p-fenylendiamin-oxalat (DMP) -lösning (0,2% vikt / vikt i 20% H 2 SO 4) och 125 | il av järn (III) ammoniumsulfatlösning (10% vikt / vikt i 2% H 2 SO 4) och komplett med destillerat vatten 25 ml i den volumetriska kolven. Vänta 30 minuter för reaktionenatt inträffa, tiden vid vilken den blå färgen stabiliseras. 13.
Obs! Vänta minst 15 minuter, men inte mer än 60 minuter för att testa proven i spektrofotometer. Genomför läsningen av den blå slutliga lösningen i spektrofotometern.
- Analysera sulfat enligt standardmetoder 11. Här, kvantifiera sulfat som bariumsulfat med en turbidimetrisk metod.
- Placera 5 ml av en konditioneringslösning (saltsyra HCI 1: 1) i en mätkolv på 25 ml, tillsätt 1 ml av den tidigare centrifugerade provet (vid 11.320 x g), fylla i 25 ml mätkolven med destillerat vatten och lägg 1 g bariumklorid.
- Blanda lösningen under 1 min i en virvel. Vänta fyra min för bariumsulfat för att bilda och läsa provet i spektrofotometern vid en våglängd (λ) av 420 nm 11.
- Analysera COD enligt standardmetoder 11. Alternativt kan du använda en COD faststältionssatsen.
- Före COD bestämning, centrifugera provet noggrant (vid 11.320 xg) för att avlägsna kvarvarande svavelväte som kan störa i bestämningen. Om det behövs, centrifugera två gånger: första gången omedelbart efter provtagningen och andra gången vänta 6 eller 8 timmar och sedan genomföra COD-analys.
- Tillsätt 2 ml av provet med en reaktionsflaska av COD bestämning kit, täta flaskan och homogenisera blandningen genom försiktig omrörning. Förbered en blank genom att tillsätta 2 ml destillerat vatten till en annan reaktionsflaska och homogenisera blandningen.
- Placera rören i rötningsreaktor vid 150 ° C under 2 h. Ta bort flaskorna och låt dem svalna i mörkret. Ta avläsningar av flaskorna i spektrofotometer vid en våglängd av 620 nm.
- Skaffa gasvolymen från gasen förskjutnings kolumnen.
- Analysera sulfid i vätske spektrofotometriskt (vid en våglängd (λ) av 670 nm) genom att följa metylenblått metod 13.
- Vänta i upp till ytterligare 5 till 7 dagar, tills sulfat förbrukas. Sulfat och COD måste konsumeras i enpproximately 85% till 90% innan en ny satsvis startas.
- När sulfat (och COD) konsumeras helt upprepa steg 2.4. Supply färskt medium och nya näringsämnen för varje parti.
- Upprepa steg 3.1 och 3.2. Vid det här laget bör varje parti pågå mellan 7 och 10 dagar.
- När 3 till 4 omgångar har slutförts, upprepa steg 2,4 men ökar COD koncentrationen till 4 g / L.
- Upprepa steg 3.1 och steg 3.2.
- Upprepa steg 3.3 men ökar COD koncentrationen till 6 g / L.
- Upprepa 3,6 och 3.6.1 gradvis ökande COD-koncentrationen tills den är 10 g / I.
Obs! Grafen som presenterar sulfatkoncentrationen (mg / L) mot tiden (d).
- När sulfat konsumtionen är över 80% på mindre än 24 timmar och detta sker i mer än en vecka, växla driften av reaktorn till kontinuerligt läge. För det kontinuerliga läget in den hydrauliska retentionstiden (HRT) vid 24 h och bibehålla sulfatkoncentrationen vid 4 g / I och CODvid 10 g / I.
Obs: Med tiden sulfat konsumtionen bör vara snabbare.
4. sulfatreducerande aktivitetstest
- Före detta test se till att bioreaktorn under kontinuerlig regim presenterar mindre än 10% variation i sulfatkoncentrationen kvar.
- Vid varje given dag, stoppa reaktorn efter en HRT cykel och uppförande steg 2.4. För steg 2.4.3 använda ett COD koncentration av 10 g / I.
- När bioreaktorn matas, ta 5 till 7 ml prover av vätskan och göra analyser för COD, sulfat, sulfid (steg 3,1) och pH varje timme. Anteckna gas producerad volym.
- Beräkna sulfatreducerande aktivitet enligt litteraturen 14.
SRA = sulfat reducerande aktivitet (mg COD-H2 S) / gVSS * d
m H 2 COD-H2 S
VSS = flyktiga suspenderade ämnen koncentration
t = tid (d eller h)
- Gör motsvarande grafer som visar andelen sulfat förbrukning kontra sulfidkoncentrationen över tiden i mg / L. Gör grafer som visar andelen COD konsumtion över tiden. Gör grafer som visar pH-variation över tiden.
5. Trikloretylen (TCE) Minskning Test
- Före detta test se till att bioreaktorn arbetar under kontinuerlig regim och presenterar mindre än 10% variation i sulfatkoncentrationen återstående. Starta inte detta test om sulfatreduktion i bioreaktorn är mindre än 90%.
- Bered en förrådslösning av trikloretylen (TCE) med hänsyn till att den slutliga koncentrationen av denna förening i den flytande fasen i bioreaktorn måste vara 300 pM. Betrakta partitioning av föreningen till det övre utrymmet genom att använda Henry's lag dimensionslös konstant (H') för TCE vid 34 ° C. H'at 34 ° C under TKE är 0,4722.
Varning: Bered denna lösning i en fumehood och bära handskar och skyddsglasögon.- Till exempel för en 5000 | iM stamlösning, beräkna som följer:
TCE gasfas koncentration = (0,4722) * (5000) = 2139 iM. Inkludera denna koncentration i beredningen av förrådslösningen eftersom denna mängd TCE kommer att vara i huvudutrymmet.
Sedan i vätskan (vatten) av förrådslösningen, kommer den faktiska TCE koncentrationen vara: 5.000 + 2,139 = 7,139 iM. TCE densitet = 1,43 g / ml. Konvertera 7139 iM till mg och sedan med hjälp av densitet TCE beräkna volymen av TCE för stamlösningen.
Obs: Koncentrationen av TCE stamlösningen may vara lägre än 5000 pM, dvs 3000 eller 1000 ^ M, detta beror på hur stor volym av denna lösning kan levereras till bioreaktorn enligt dess volym vätskefas.
- Till exempel för en 5000 | iM stamlösning, beräkna som följer:
- Bered standardkurvor i gaskromatografen för TCE, cis-1,2-dikloretylen, trans-1,2-dikloroetylen, vinylklorid och eten. Förbered cis-1,2-dikloroetylen och trans-1,2-dikloroetylen standardkurvor från en förrådslösning av dessa föreningar genom att följa samma procedur som beskrivits i 5,2 för TCE stamlösning. Bered standardkurvor för vinylklorid och eten genom utspädning av koncentrationen av varje gas från de standarder (gasflaskor).
- Bered standardkurvorna för dessa föreningar i ett intervall av 20 till 300 ^ M. Använd den metod som rapporterats av Guerrero-Barajas et al. (2011) 15 för analys av dessa föreningar i gaskromatografen.
Varning: Förbered dessa standard lösningar i en fumehood och bära handskar och skyddsglasögon.
- Bered standardkurvorna för dessa föreningar i ett intervall av 20 till 300 ^ M. Använd den metod som rapporterats av Guerrero-Barajas et al. (2011) 15 för analys av dessa föreningar i gaskromatografen.
- Vid varje given dag, stoppa reaktorn efter en HRT cykel och uppförande steg 2.4. För steg 2.4.3 använda ett COD koncentration av 10 g / I.
- När bioreaktorn matas, till TCE direkt till vätskan i bioreaktorn från förrådslösningen framställd i 5,2 måste den slutliga TCE-koncentrationen i den flytande fasen i bioreaktorn vara 300 pM. Ställ in HRT till 12 h.
- I slutet av en HRT cykel ta prover av vätskan (500 till 1000 il) och beteende analys för COD, sulfat och sulfid (steg 3.1.1, 3.1.2 och 3.1.3). Ta prover av det fria utrymmet (100 till 250 ^) och genomföra analyser för TCE, cis-1,2-dikloretylen, trans-1,2-dikloroetylen, vinylklorid och eten i gaskromatografen.
- Upprepa steg 2.4. För steg 2.4.3 använda ett COD koncentration av 10 g / I.
- Upprepa inte någon TCE reduktionstest tills bioreaktorn presenterar över 90% minskning sulfat och mindre av 10% variation i båda, sulfatreduktion och sulfat som finns kvar i bioreaktom.
- Upprepa 5,4, 5,5 och 5,6 två eller tre gånger mer.
- Ta sedimentprover (0,5 g) för att genomföra identifiering av mikroorganismerna precis efter en TCE reduktionstest har avslutats. Gör detta efter 2 eller 3 TCE minskning tester.
6. sulfatreducerande aktivitetstest efter TCE Reduction Experiment
- Upprepa steg 4 helt.
7. Identifiering av Mikroorganismer
- Ta prover av slam på ca 0,5 g vardera och genomföra RNA total extraktion enligt schablonmetoden 12.
- Amplifiera 16S rRNA-genen med omvänd transkription och genomföra polymeraskedjereaktionen (RT-PCR) amplifiering ett steg 12.
- Utforma primers för att förstärka eller använda som ett första tillvägagångssätt dem som föreslås i litteraturen 11. Följ amplifblue förfarande som föreslås i litteraturen 12.
- Konstruera 16S rRNA biblioteken. PCR-amplikoner kan klonas genom användning av en klonings-kit 11. Normalt kan 10 kolonier från varje platta (varje koloni representerar en PCR-produkt) klonas. Förbered plasmid-DNA för sekvensering enligt det förfarande som föreslås i litteraturen 12.
- Genomför sekvensering av fragment. Åter förstärka cirka 1400 bp av PCR externa produkter med protokollet för PCR-amplifiering tidigare beskrivits (steg 7,4) och klon enligt det förfarande som föreslås i litteraturen 12. Isolera den rekombinanta plasmiden från E. coli kolonier som föreslås i litteraturen 12. Äger genomföra den partiella förfarandet för sekvensbestämning med M13 universella primrar 12.
- Genomför sekvenser analys. Rikta in nukleotidsekvenser med hjälp av Clustal X och manuellt justera i textredigeraren. Gör BLAST-sökningar i NCBI database. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi) 12.
- Erhålla nukleotidsekvensen accessionsnummer. Deponera nukleotidsekvensema för klonema som identifierats i EMBL nukleotidsekvensdatabas (Gen-Bank / EMBL / DDBJ) i motsvarande accessionsnummer (dvs JQ713915eJQ713925 för sekvenser från amplikoner) 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett typiskt uppträdande av sulfatreduktion i bioreaktorn visas i figur 5. Det är viktigt att lägga märke till att under de första veckorna av drift sulfatreduktion kommer att vara långsam. Emellertid långsam, förbrukningen av över 90% av sulfat med tiden indikerar att inokulatet utvecklar en mikrobiella förmåga att reducera sulfat och därför, anrikad i sulfatreducerande bakterier. De olika perioder i figuren visar att sulfatreduktion ökade sin hastighet över tiden. I början, tog satsen 20 dagar för sulfat som skall reduceras (period I), därefter dess minskningstakten ökade, och det tog ungefär 10 dagar för att reducera den matade sulfat (period II). Period III presenterade mindre variation i sulfatreduktion och detta uppnåddes i genomsnitt 10 dagar som det framgår av Figur 5. Efter denna period, en minskning av sulfat tog i genomsnitt 4 dagar (Period IV) och i period V 4000 mg / I av sulfatkonsumerades på mindre än 24 timmar. Prestandan i bioreaktorn sattes under kontinuerlig läge efter 200 dagar vid HRT av 24 timmar.
Figur 5. Sulfate (SO 4 2-) koncentration över tiden under sulfidogenic slambildning i bioreaktorn. Den heldragna linjen avser inflödet sulfatkoncentrationen. Fyrkanter avser sulfatkoncentrationen i utflödet. Denna siffra har tagits från Guerrero-Barajas et al. (2014) 12 med motsvarande upphovsrätts tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Representativa goda resultat på sulfatreduktion, sulfidkoncentrationen, COD konsumtion och pH-variationer över tiden är shegna i figur 6A. Dessa resultat erhölls i experiment som utförts när bioreaktorn var under ständig regimen nästan ett år. Vid denna punkt var den mikrobiella miljön utvecklades i bioreaktorn och en svart slam bildades som det kan ses i figur 4B. I fig 6A kan det ses att sulfat reducerades i 4 timmar och sulfid nådde en maximal koncentration av 1200 ± 30 mg / l och 188 ± 50 mg COD-H 2 S / g VSS * d var sulfatet reducerande aktivitet. Det är värt att nämna att koncentrationen av sulfid som erhållits i bioreaktorn anses hög och toxiska för mikroorganismer, och i detta fall bioreaktorn inte upphörde sulfatet reducerande aktivitet.
Figur 6. Utförande av bioreaktorn före (A) och efter (B) TCE tillsatsen. Sulfat (SO 4 2-) (◇), Sulfid(H 2 S) (•). Data som presenteras är medelvärden och standardavvikelse för n = 3. Denna siffra har tagits från Guerrero-Barajas et al. (2014) 12 med motsvarande upphovsrätts tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
För experiment i vilket slammet testades på förmågan att minska TCE, är de erhållna resultaten visas i tabell 1. Den sulfatreducerande erhållna aktiviteten var något lägre än den som erhölls före TCE tillsats och ca 80% av TCE reducerades till eten (se tabell 1). Dessa resultat bör den förväntade beroende på den tid, i vilken reaktorn hade varit i drift i enlighet med sulfat reducerande betingelser. Det är osannolikt att TCE minskning inträffar om slammet tas när reaktorn arbetar under period I eller II (se figur 5
| Parameter | Värde under test TCE minskningen | ||
| Andel av SO 4 2- borttagning (%) | 98 (± 0,06) | ||
| Sulfid (H 2 S) koncentration (mg / I) | 971 (± 72) | ||
| Procent av omvandling av SO 4 2- till H2S (%) | 68 (± 2) | ||
| Andel av COD borttagning (%) | 93 (± 0,1) | ||
| pH-område | 7,1-7,7 | ||
| Gasproduktionen (ml / d) | 200 (± 55) | ||
| Sulfatreducerande aktivitet (mg COD-H2 S / g VSS * d) | 161 (± 7) | ||
| * TCE slutkoncentration (^ M) | 77 (± 8) | Vinylklorid koncentration (pM) | 16 (± 0,3) |
| Eten koncentration (pM) | 202 (± 81) | ||
| Andel av TCE borttagning (%) | 74,3 (± 14) |
. Tabell 1. Resultaten på utförandet av sulfidogenic slammet under TCE biologisk nedbrytning experiment Denna tabell har ändrats från Guerrero-Barajas et al (2014) * TCE initial koncentration.. 300 iM. Data som presenteras är medelvärdet och standardavvikelsen för n = 3.
Efter test TCE minskning, är resultaten för sulfatreduktion, sulfidkoncentrationen, COD konsumtion och pH-variationer över tiden visas i figur 6B. Dessa resultat visar att sulfat reducerades i 5 h och sulfid koncentrationen nådde 1400 ± 35 mg / I, tillsammans med ett sulfat reducerande aktivitet av248 ± 22 mg COD-H2 S / g VSS * d. Den något högre sulfatreducerande aktivitet - jämfört med 188 ± 50 mg COD-H2 S / g VSS * d - indikerar att den mikrobiella miljön inte hämmades av TCE.
Resultat på mikroorganismer som identifierats i slam som används i detta protokoll presenteras i tabell 2. Sulfatreducerande bakterier, jäsning bakterier och dehalogenering bakterier identifierades i slammet som utvecklats med hjälp av detta protokoll. Resultaten är inte förvånande eftersom bioreaktorn fungerade under ett år i enlighet med sulfat reducerande betingelser och flera dagar med TCE. Släkten av bakterier såsom Desulfovibrio, Desulfomicrobium, Desulfitobacterium, Clostridium, Dehalobacte r och Sulfurospirillum har i samband med sulfatreduktion och biologisk nedbrytning av klorerade föreningar. Vidare identifieringen av dessa mikroorganismer i slammetbekräftar att protokollet var framgångsrika i att utveckla ett sulfidogenic slam som kan användas för samtidigt avlägsnande av sulfat och trikloretylen, vilket är en av de mest toxiska klorföreningar.
| Rapporterade Bakterier | Hög likhet | max ident |
| gi | 386685641 obildade Desulfovibrio sp. | Desulfovibrio desulfuricans | 96% |
| gi | 386685640 obildade Desulfomicrobium sp. | Desulfomicrobium norvegicum | 99% |
| gi | 386685639 obildade Desulfomicrobium sp. | Desulfomicrobium baculatum | 99% |
| gi | 386685638 obildade Desulfomicrobium sp. | Desulfomicrobium hypogeium | 99% |
| gi | 386685637 obildade Desulfotomaculum sp. | Desulfotomaculum acetoxidans | 99% |
| gi | 386685636 obildade Clostridium sp. | Clostridium celerecrescens | 99% |
| gi | 386685635 obildade Desulfovibrio sp. | Desulfovibrio halophilus | 98% |
| gi | 386685634 obildade Dehalobacter sp. | Dehalobacter restrictus | 99% |
| gi | 386685633 obildade Desulfitobacterium sp. | Desulfitobacterium hafniense | 99% |
| gi | 386685632 obildade Sulfurospirillum sp. | Sulfurospirillum multivorans | 97% |
| gi | 386685631 obildade Sulfurospirillum sp. | Sulfurospirillum halorespirans | 97% |
Tabell 2. Consortium identifierats i slammet i bioreaktorn och dess likhet med andra bakterier Max ID:. Maximal identitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns flera tillämpningar av sulfidogenesis i miljöbioteknik, en av de mest använda tillämpningar av metabolismen av sulfatreducerande bakterier i konsortier med jäsande bakterier i avloppsvattenrening. UASB reaktorer är bland de viktigaste tekniska metoder för industriellt avloppsvatten med höga sulfatkoncentrationer. I detta arbete presenterar vi ett protokoll för att erhålla sulfidogenic slam från marina sediment i en UASB reaktor. De kritiska stegen i protokollet för att erhålla en sulfidogenic slam från marina sediment är: (1) att främja homogeny av sedimentet provet som skall placeras i reaktorn, (2) inmatning av rätt koncentration av sulfat- och flyktiga fettsyror (COD / SO 4 2-) förhållande, (3) analys av sulfat, sulfid, COD och pH regelbundet, (4) uppfriskande basalmediet, som innehåller spårmetaller och vitaminer varje gång en sats påbörjas. Det är viktigt att beakta att utvecklingen av sludge beror till stor del på den mikrobiella miljön i det ursprungliga provet och på rätt massbalanser (sulfat och COD). Även om det tar tid för sulfatet reducerande aktivitet att utveckla, kräver bioreaktom kontinuerlig övervakning för att undvika läckor, olyckor, eller tidsmässiga brist på energi som kan sluta återcirkulationspumpen eller stänga av temperaturkontroll. Särskild uppmärksamhet måste ägnas vid utförandet av analysen av sulfid, sulfat och COD.
Marina sediment i allmänhet är en naturlig källa till en bred variation av mikroorganismer; det är sannolikt att slam kan bildas med marina sediment tagna från olika djup. I detta protokoll valdes att använda hydrotermiska marina sediment för två huvudskäl: (1) dessa grunda ventiler ligger nära till kostnaden och (2) dessa typer av platser är mer rikligt i sulfider, vilket är en indikation på sulfatreduktion och därför, av närvaron av sulfatreduktions bakterier. Om något, ta sediments från någon annan plats i undervattens golvet kommer bara att kräva mer tid för slammet att utveckla, även om vi tror att det är mycket osannolikt.
Dessutom är det nödvändigt att genomföra flera TCE reduktionstest för att främja närvaron av dehalogenering mikroorganismer i slammet som skall identifieras ytterligare genom att följa det förfarande som föreslås i detta protokoll eller någon annan molekylärbiologi teknik. Det är viktigt att tänka på att utvecklingen av dehalogenering mikroorganismer beror också på källan av slammet, även om litteraturen hänvisar till förekomsten av denna typ av mikroorganismer i flera havssediment runt om i världen 7. En sulfatreducerande aktivitetsanalys rekommenderas efter exponeringen av slammet till den toxiska föreningen i syfte att utvärdera lönsamheten för sulfidogenic slam efter en ansträngande tillstånd, till exempel förekomsten av TCE. Om sulfat reducerande aktivitet av slammet minskar det kommer att vara nödvändigt att bibehålla det several veckor i satsvis matas med sulfat och COD för att främja åter en ökning av sulfat reducerande aktivitet. Detta kan göras genom att följa stegen som föreslås i protokollet att främja sulfidogenesis och tillväxt av mikroorganismer. Det är viktigt att nämna att det var försök att erhålla en sulfidogenic-dehalogenering slam genom att lägga till TCE och sulfat sedan början av odling av sedimenten, men ingen aktivitet (antingen sulfatreducerande eller dehalogenering) någonsin observerats. Det antogs att den låga halten av mikroorganismer närvarande i ett tidigt skede av kulturen inte tolerera TCE (även vid 20 | iM koncentration) emellertid tillsatsen av TCE sedan början av anrikn kan alltid försökt med andra sediment.
Ett bra resultat i detta fall var en minskning av TCE till eten, dock beroende på mikroorganismerna som kunde ha utvecklats i slammet minskning av TCE kan ge främst dichloroethenes och vinyl klorid (VC). I detta fall uppgifterna om den TCE minskning registrerades efter varje HRT cykel i bioreaktorn i stället för provtagning för TCE och dess mellanprodukter konstant under testet. Det gjordes på detta sätt för att undvika förångning av de klorerade föreningar på grund av frekventa provtagning. Därför finns det inga grafer av TCE koncentration över tiden för att visa men koncentrationerna vid slutet av varje experiment. Det är viktigt att undvika avdunstning av de flyktiga klorföreningar att rapportera exakta koncentrationer av dem och att urskilja om förändringar kan tillskrivas biologisk reduktion i stället för förluster. Närvaron av eten och frånvaron av gemensamma mellan av TCE såsom cis -1,2-dikloretylen i slutprodukterna efter TCE minskningen är särskilt intressant. Det har alltid varit rapporterats att den fullständiga TCE reduktion till eten kan endast utföras av Dehalococcoides sp. och i detta fall dessa microorganismer detekterades inte bland de släkten som identifieras i slammet. Vi tillskriver TCE reduktion till cometabolism som kan ha uppstått i slammet bland dehalorespiring, den jäsande och sulfatreducerande bakterier. En brist i detta konsortiet är att det främjar gående bildandet av VC, en förening giftigare än TCE, men det är närvarande vid relativt låga koncentrationer. Det kan vara möjligt att säga på denna punkt som en mycket ovanlig cometabolic aktivitet har utvecklats av konsortiet och att en ny TCE minskning väg enligt sulfat reducerande betingelser kan undersökas ytterligare i närvaro av halorespiring mikroorganismer som identifierats i detta arbete. Å andra sidan har det tidigare rapporterats att dehalogenering gener är ofta detekteras i under ytan marina sediment men det finns inga rapporter om TCE bionedbrytning med subsea sediment kombination med sulfat reducerande betingelser, är detta, med användning av sulfat såsom ett alternativt elektronacceptor.
En av begränsningarna med denna metod är att strukturen för slammet beror på de fysikaliska egenskaperna hos sedimentet som används och även om det i denna metod slammet bildade tillät en god fluidisering av reaktorn och bildning av biofilm på glaset, kan vi inte förutsäga hur Det skulle faktiskt arbetar med hjälp av sediment i olika platser. Det kan vara möjligt att använda mindre reaktorer för att genomföra preliminära tester ochobservera om det är genomförbart. Om avsikten är att arbeta med slammet i en bioreaktor, rekommenderar vi inte börjar med mikrokosmos. Förslaget är att ställa av reaktorn från början, men med en mindre volym för det första försöket.
Den metod som presenteras här är betydande i att slammet som bildas tolererar högre sulfid halter än andra sulfidogenic slam som erhålls genom anpassning av metanogena granulärt slam till sulfidogenesis. Förfarandet främjar bildningen av ett slam med ett konsortium som inkluderar sulfatreducerande bakterier och fermenterande bakterier och är lätt anpassad för att brytas ned biologiskt toxiska föreningar. I detta protokoll använde vi TCE som ett exempel på en toxisk förening som bara har biologiskt enligt metanogena förhållanden i UASB reaktorer. Till exempel, om syftet med reaktorn är att biotransformera klorerade lösningsmedel kan det vara lämpligt att successivt öka koncentrationen lösningsmedel, det vill säga högre TCE koncentration i testerna, att samtidigt minska sulfatkoncentrationen stimulera dehalogenering över sulfatreduktion. Även om det enligt de resultat som uppnåtts i detta arbete, anser vi fortfarande att sulfat inte helt kan avlägsnas från odlings om sulfat reducerande betingelser är önskvärda. Dessutom bör sulfat reducerande betingelser upprätthållas eftersom vissa dehalorespirers är också sulfatförminsknings. Slammet som genereras under de förhållanden som beskrivs i detta protokoll kan slutligen användas för att avlägsna samtidigt COD, sulfat, klorerade giftiga föreningar och tungmetaller. Tungmetallerna kan utfällas med sulfiden produceras av slammet.
Slutligen kan sulfidogenic slam bildas testas för: (1) den tolerans av högre sulfid koncentrationer (t.ex. för att utfälla tungmetaller), (2) biologisk nedbrytning av andra organiska föroreningar, eller (3) förbrukningen av kolväten som elektrondonatorer i stället för flyktiga fettsyror till further utforska dess tillämpningar inom miljöbioteknik. Det är viktigt att tänka på att när slammet bildas det kan användas som utsäde slam för att ympa andra reaktorer. I vilket fall kommer sulfatreduktionsprocessen ske omedelbart och således kommer det inte vara nödvändigt att vänta ett år för att fungera fullt ut bioreaktorn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| trichloroethylene | sigma Aldrich | 251402 | |
| cis-1,2-dichlorotehylene | sigma Aldrich | ||
| trans-1,2-dichloroethylene | sigma Aldrich | D-62209 | |
| vinyl chloride scotty standard | supelco | 1,000 ppm v/v in nitrogen | |
| ethene scotty standard | supelco | 99% purity | |
| pump | Masterflex | Model 7553-75 | |
| spectrophotometer | any | ||
| microcentrifuge | any | ||
| gas tight syringes | any | 100 and 200 microliters | |
| UASB glass reactor | any | under design | |
| gas chromatograph | any | FID detector | |
| capillary column SPB-624 | supelco | ||
| pH meter | any | ||
| viton tubing | Masterflex | ||
| basal medium reagents | any | ||
| trace metals reagents | any | ||
| vitamins solution reagents | any | ||
| sodium sulfate | any | ||
| volatile fatty acids | any | ||
| COD determination kit | HACH | range 0-15,000 mg/L | |
| TOPO-TA cloning kit pCR®4.0 | Invitrogen, US | ||
| S.N.A.P. TM Miniprep Kit | Invitrogen, UK | ||
| Pure link TM Quick Plasmid Miniprep kit | Invitrogen |
References
- Lens, P., Esposito, M. V. G., Zandvoort, M. Perspectives of sulfate reducing bioreactors in environmental biotechnology. ReViews Environmental Science and Biotechnology. 1 (4), 311-325 (2002).
- Omil, F., Lens, P., Hulshoff, P., Lettinga, G. Characterization of biomass from a sulfidogenic, volatile fatty acid-degrading granular sludge reactor. Enzyme and MicrobialTechnology. 20, 229-236 (1997).
- Lopes, S. I. C., Wang, X., Capela, M. I., Lens, P. N. L. Sulfate reduction during the acidification of sucrose at pH 5 under thermophilic (55 °C) conditions.II: Effect of sulfide and COD/SO4-2 ratio. Bioresource Technology. 101, 4278-4284 (2010).
- Alfonso, P., Prol-Ledesma, R. M., Canet, C., Melgarejo, J. C., Fallick, A. E. Sulfur isotope geochemistry of the submarine hydrothermal coastal vents of Punta Mita, Mexico. Journal of Geochemical Exploration. 78-79, 301-304 (2003).
- Valdemarsen, T., Kristensen, E. Degradation of dissolved organic monomers and short chain fatty acids in sandy marine sediment by fermentation and sulfate reduction. Geochimica et Cosmochimica Acta. 74, 1593-1605 (2010).
- Quistad, S. D., Valentine, D. L. Anaerobic propane oxidation in marine hydrocarbon seep sediments. Geochimica et Cosmochimica Acta. 75, 2159-2169 (2011).
- Futagami, T., Morono, Y., Terada, T., Kaksonen, A. H., Inagaki, F. Dehalogenation activities and distribution of reductive dehalogenase homologous genes in marine subsurface sediments. Applied and Environmental Microbiology. 75 (21), 6905-6909 (2009).
- U.S. Environmental Protection Agency. List of priority pollutants. Clean Water Methods. , (2014).
- Ozdemir, C., Dursun, S., Karatas, M., Sen, N., Sahinkaya, S. Removal of trichloroethylene (TCE) in upFlow anaerobic sludge blanket reactors (UASB). Biotechnology and Biotechnological Equipment. 21 (1), 107-112 (2007).
- Zhang, Y., Wang, X., Hu, M., Li, P. Effect of hydraulic retention time (HRT) on the biodegradation of trichloroethylene wastewater and anaerobic bacterial community in the UASB reactor. Applied Microbiology and Biotechnology. 99, 1977-1987 (2015).
- Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. , 20th Edn., American Public Health Association. Washington, DC. (1998).
- Guerrero-Barajas, C., et al. Enhanced sulfate reduction and trichloroethylene (TCE) biodegradation in a UASB reactor operated with sludge developed from hydrothermal vents sediments: process and microbial ecology. International Biodeterioration and Biodegradation. 94, 182-191 (2014).
- Trüper, H. G., Schlegel, H. G. Sulphur metabolism in Thiorhodaceae I. Quantitative measurements on growing cells of Chromatium okenii. Antoine van Leeuwenhoek. 30, 225-238 (1964).
- Gallegos-García, M. G. Biological processes of sulfate reduction in biofilms for metals precipitation [Ph D thesis]. , Intituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica. San Luis potosí, Mexico. (2009).
- Guerrero-Barajas, C., Garibay-Orijel, C., Rosas-Rocha, L. E. Sulfate reduction and trichloroethylene biodegradation by a marine microbial community from hydrothermal vents sediments. International Biodeterioration and Biodegradation. 65, 116-123 (2011).
