Abstract
يمكن مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا تكرار في العصارة الخلوية أو في فجوات التي تحتوي على العوامل المسببة للأمراض المتخصصة (PCVS). للوصول إلى العصارة الخلوية، مثل البكتيريا الشغيلة الفلكسنرية والفرنسيسيلة القتولة تحتاج للحث على تمزق يبلوع. في المقابل، السالمونيلا التيفية الفأرية يتطابق في مقصورة فجوي، والمعروفة باسم السالمونيلا التي تحتوي فجوة (SCV). فشلت المسوخ ولكن بعض من السالمونيلا للحفاظ على سلامة SCV، وبالتالي فهي تطلق في العصارة الخلوية. النسبة المئوية للعصاري خلوي مقابل البكتيريا فجوي على مستوى البكتيريا واحدة يمكن أن يقاس permeabilization التفاضلي، المعروف أيضا باسم فحص يبلوع الحماية. نهج يجعل من استخدام خاصية المنظفات ديجيتونين لربط بشكل انتقائي الكولسترول. منذ غشاء البلازما يحتوي على أكثر الكولسترول من الأغشية الخلوية الأخرى، ديجيتونين يمكن استخدامها لpermeabilize انتقائي غشاء البلازما بينما يترك الخلايا الأغشيةسليمة. وباختصار، بعد العدوى مع الممرض تعبر عن البروتين علامة فلوري (على سبيل المثال mCherry وغيرها)، وpermeabilized الغشاء البلازمي للخلايا المضيفة مع حضانة قصيرة في ديجيتونين تحتوي على العازلة. ثم يتم غسل الخلايا وحضنت مع الأجسام المضادة الأولية (بالإضافة إلى fluorophore الاختيار) موجهة ضد البكتيريا الاختيار (مثل مكافحة السالمونيلا -FITC) وغسلها مرة أخرى. إذا تم استخدام البكتيريا تحمل علامات، ويمكن أن يتم خطوة إضافية، والتي هي permeabilized جميع أغشية وجميع البكتيريا ملطخة الضد المقابل. بعد التلوين، نسبة فجوي وعصاري خلوي البكتيريا يمكن أن يكون كميا بواسطة FACS أو المجهري عن طريق عد أحداث مفردة أو مزدوجة إيجابية. نحن هنا تقديم تفاصيل تجريبية لاستخدام هذه التقنية مع بكتيريا السالمونيلا التيفية الفأرية. الاستفادة من هذا الاختبار هو أنه، على النقيض من فحص آخر، فإنه يوفر الكمي على مستوى bacte واحدريا، واذا ما تم تحليلها بواسطة المجهر توفر العدد الدقيق للعصاري خلوي والبكتيريا فجوي في خلية معينة.
Introduction
مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا تتكاثر بشكل مباشر في العصارة الخلوية الخلية المضيفة، أو في حجرات فجوي المتخصصة 1. خلال المرحلة الأولى من العدوى الحصول المنضوية معظم مسببات الأمراض إما عن طريق البلعمة من قبل خلايا متخصصة (مثل الضامة) أو عن طريق بنشاط على تعزيز امتصاص الخاصة بهم في الخلايا غير البلعمية. في الخلايا البلعمية، ويبلوع الصمامات عادة مع الجسيمات الحالة لتشكيل المقصورة الهادمة، حيث يتم هضمها الجسيمات المبتلعة. البكتيريا عصاري خلوي المتخصصة، مثل الفرنسيسيلة القتولة أو الشيجلا الفلكسنرية، هربا من تدهور phagosomal عن طريق حفز تمزق يبلوع والهروب في وقت لاحق إلى 2،3 العصارة الخلوية. وهذا يتطلب آلية المرتبطة الفوعة مثل الإمراضية جزيرة الفرنسيسيلة (FPI) أو الشيجلا الفلكسنرية T3SS، الذي يحقن البروتينات المستجيب التي تعزز فجوي تمزق 2-4. الميزات العصارة الخلوية الخلية المضيفةعدد من الحفظ مستقبلات التعرف على الأنماط التي تعترف عادة وجود مسببات الأمراض وتحفيز المناعة الفطرية يشير 5. بالإضافة إلى ذلك، xenophagy، وهو شكل المضادة للميكروبات من الالتهام الذاتي يمكن أن تتحلل البكتيريا التي تدخل العصارة الخلوية. وعادة تكييفها البكتيريا عصاري خلوي جيدا لفظة أو الالتفاف على هذه الردود باستخدام استراتيجيات مختلفة. على سبيل المثال، الفرنسيسيلة يعدل LPS لتجنب الاعتراف المضيفة والشيجلا يمنع تجنيد الالتهام الذاتي باستخدام البروتينات المستجيب يفرز 6،7.
يعمل استراتيجية أخرى للهروب من تدهور الليزوزومية من النموذج فجوي الممرض السالمونيلا الملهبة للضرب مصلي التيفية الفأرية، أشار بعد ذلك إلى أنه السالمونيلا التيفية الفأرية. يستخدم السالمونيلا وT3SS لحقن المستجيبات أن يعيد يبلوع الأولي إلى مكانته داخل الخلايا، والسالمونيلا التي تحتوي فجوة (SCV) 8،9. التلاعب المستمر لمسارات المضيفمن الضروري الحفاظ على هذا فجوة من خلال تجنيد الدهون والمواد المغذية الأخرى إلى فجوة. في الواقع، يفشل متحولة سيفا من السالمونيلا للحفاظ على الاستقرار فجوي، ويدخل في العصارة الخلوية للخلايا المضيفة في غضون ساعات بعد الإصابة، مما يؤدي إلى تفعيل مسارات المناعية الفطرية والتوظيف الالتهام الذاتي 8. الهروب فجوي السالمونيلا يختلف باختلاف نوع من الخلايا التي هي الدراسات، وأظهرت عدة تقارير أنه في الخلايا الظهارية حتى WT السالمونيلا يمكن الهروب من SCV وhyperreplicate في العصارة الخلوية 10. وتشير التقارير الأخيرة التي كشف المناعي الفطري من مسببات الأمراض فجوي يعتمد أيضا على قدرة المضيف على الاعتراف وزعزعة استقرار الفجوات التي تحتوي على العوامل المسببة للأمراض (PCVS) 11-14.
وبالنظر إلى أن كلا من المضيف أو البكتيريا النمط الجيني يمكن أن تؤثر على توزيع البكتيريا داخل الخلايا بين فجوي ومقصورة عصاري خلوي، فمن الضروري تحديد عدد فجوي مقابلالبكتيريا عصاري خلوي. منذ ذلك الحين، في معظم الاجهزة التجريبية مصابون الخلايا المضيفة مع بكتيريا أكثر من واحد، وبعد ذلك يمكن أن تؤوي العديد من البكتيريا في مقصورات التحت خلوية مختلفة، وهناك حاجة وهي تقنية تسمح الكمي على مستوى البكتيريا واحدة. permeabilization التفاضلي (المعروف أيضا باسم فحص حماية phagosomal) يوفر هذا القرار 2،4،10،12. ويستند الفحص على permeabilization الانتقائي للخلايا المضيفة غشاء البلازما مع ديجيتونين المنظفات، مما يترك الأغشية فجوي سليمة، وبالتالي يسمح تلطيخ الانتقائي للبكتيريا عصاري خلوي مع الأجسام المضادة. هنا نقدم بروتوكولين لتقدير حجم عصاري خلوي وفجوي السالمونيلا التيفية الفأرية باستخدام الفرق permeabilization. يوصف مبدأ هذه الطريقة في الشكل 1: مصابون نقي العظم الضامة المشتقة (BMDMs) مع مرحلة ثابتة mCherry، معربا عن السالمونيلا. مرحلة ثابتة السالمونيلا بحاجة رس استخدامها لأنها downregulate التعبير عن SPI-1 T3SS، التي لولاها أن تعترف بها inflammasome NLRC4 واستحثاث موت الخلايا السريع (pyroptosis) من BMDMs 15 النشاط. بعد الإصابة تغسل الخلايا وتعامل مع 50 ميكروغرام / مل من ديجيتونين لمدة 1 دقيقة. تغسل الخلايا مرة أخرى على الفور وحضنت مع الأجسام المضادة السالمونيلا مكافحة بالإضافة إلى FITC بمناسبة البكتيريا من الوصول إلى العصارة الخلوية. بعد غسل إضافي وهي lysed خلايا خطوة ونسبة mCherry + (فجوي) وFITC + / + mCherry (عصاري خلوي) البكتيريا يتم تحديدها من قبل FACS. نحن أيضا الإبلاغ عن التكيف مع هذه الطريقة التي يمكن استخدامها إذا لم السلالات، معربا عن بروتين فلوري المتاحة (الشكل 2). يتم تقديم خطوات إضافية بعد وضع العلامات FITC التي يتم إصلاحها الخلايا وpermeabilized تماما. بعد ذلك تم تلطيخ كل البكتيريا مع الأجسام المضادة السالمونيلا مكافحة وما يقابلها من الأجسام المضادة الثانوية. ديتثم يتم ection بواسطة المجهر بدلا من تحليل FACS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ديجيتونين الفحص مع mCherry، معربا عن السالمونيلا (FACS على أساس تحليل)
- البكتيريا إعداد
ملاحظة: يتم استخدام السالمونيلا من النوع البري SL1344 (مقاومة ستربتومايسين) معربا عن mCherry من البلازميد (pFPV ترميز mCherry تحت المروج rpsM) في هذا الاختبار. البلعمة البكتيرية والانتشار حيث لا تتغير من خلال التعبير التأسيسي للmCherry (لا تظهر البيانات) 16.- تطعيم اليوم السلالة 1 قبل الإصابة في 3 مل من LB المتوسطة تستكمل مع الستربتوميسين (90 ميكروغرام / مل)، والأمبيسلين (100 ميكروغرام / مل، mCherry معربا عن ناقلات) في شاكر في 37 ° CO / N.
- طلاء الخلايا للعدوى.
- البذور البرية من نوع BMDMs في 24 لوحة جيدا في مناطق ذات كثافة 1.25 × 10 5 خلايا / جيد في 1 مل من المتوسط بلعم الأساسي (DMEM تستكمل مع 10٪ الجنين العجل المصل (FCS، الحرارة المعطل، 56 ° C، 30 دقيقة )، 1٪ HEPES، 1٪ الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA)، 1٪ L-الجلوتامين و 10٪ L929 طاف (متوسطة مكيفة من بلعم عامل تحفيز مستعمرة (M-CSF) إنتاج L929 الخلايا). آبار البذور وفقا للجدول 1 لمراعاة الظروف الفردية. إضافة coverslips إلى الآبار المستخدمة والضوابط (الجدول 1).
- احتضان خلايا بين عشية وضحاها في حاضنة عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪.
| Permeabilization | تلطيخ | ||||||
| ساترة الزجاج | السالمونيلا | ديجيتونين | سابونين | مكافحة السالمونيلا | مكافحة Calnexin | مكافحة PDI | |
| A1 (عينة) | - / + * | + | + | + | |||
| A2 (عينة) | - / + * | + + | + | ||||
| A3 (عينة) | - / + * | + | + | + | |||
| A4 (أي سيطرة permeabilization) | - / + * | + | + | ||||
| A5 (مراقبة permeabilization كاملة) | - / + * | + | + | + | |||
| B1 (الملون لcalnexin) | + | + | |||||
| B2 (الملون لcalnexin) | + | + | + | ||||
| B3 (الملون لcalnexin) | + | + | + | ||||
| C1 (الملونلPDI) | + | + | |||||
| C2 (الملون لPDI) | + | + | + | ||||
| C3 (الملون لPDI) | + | + | + | ||||
الجدول 1: مخطط الطلاء لنقي العظم الضامة المشتقة (BMDMs) في شكل 24-جيدا للعدوى لاحقة مع السالمونيلا، permeabilization، وتلطيخ * اعتمادا على ما إذا كان البروتوكول 1 أو 2 بروتوكول يتم.
- إعداد البكتيريا لعدوى.
- في اليوم التالي، وتحديد تركيز السالمونيلا في الثقافة بين عشية وضحاها عن طريق تمييع الثقافة 01:10 في برنامج تلفزيوني وقياس OD 600 ضد السيطرة الوحيدة PBS. هذا يضمن أن OD 600 يقاس في لترمجموعة inear من الطيف.
- حساب تركيز السالمونيلا لكل مل. وOD600 من 1 يتوافق مع 1 × 10 9 البكتيريا.
- يخفف من البكتيريا في المتوسط بلعم للوصول إلى تركيز السالمونيلا 1.25 × 10 6 خلية / مل.
- إصابة الخلايا مع السالمونيلا.
- إزالة المتوسطة من BMDMs. إضافة 1 مل من المتوسط بلعم إلى آبار المراقبة غير المصابة (B1-B3، C1-C3). إضافة 1 مل من السالمونيلا تعليق على الآبار A1 - A5 للوصول إلى عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من 10 جرثومة لكل خلية.
- أجهزة الطرد المركزي لوحة لمدة 15 دقيقة في 300 x ج في 37 ° C لمزامنة العدوى. نقل لوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية و CO 2 5٪.
- قتل السالمونيلا خارج الخلية مع جنتاميسين.
- في 1 ساعة بعد الإصابة، وإزالة لوحة من الحاضنة وإضافة 0.1 مل من المتوسط بلعم تحتوي على 0.1 ملغ / مل جنتاميسينلقتل البكتيريا خارج الخلية. إضافة جنتاميسين لجميع الآبار، حتى لضوابط غير المصابة، لضمان أن جميع خلايا يعاملون بنفس الطريقة. نقل لوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية و CO 2 5٪.
- غسل الخلايا.
- في 2 ساعة بعد العدوى، وإزالة لوحة من الحاضنة وتغسل جميع الآبار 2X مع 1 مل من DMEM عادي (ما قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية) واستبدالها المتوسطة بلعم (قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية) تحتوي على 10 ميكروغرام / مل الجنتاميسين لمنع نمو البكتيريا خارج الخلية المتبقية. نقل لوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية و CO 2 5٪.
- إعداد مخازن جديدة مع المنظفات والأجسام المضادة.
- فقط قبل نقطة الوقت المطلوب للتحليل، وإعداد محلول المخزون جديدة من ديجيتونين في 1 ملغ / مل في KHM العازلة (110 ملي خلات البوتاسيوم، 20 ملي HEPES، 2 مم MgCl 2، ودرجة الحموضة 7.3). تصفية الأسهم وتمييع في KHM العازلة إلى تركيز العملمن 50 ميكروغرام / مل من ديجيتونين. بالإضافة إلى ذلك، يعد حل من 0.1٪ سابونين في KHM العازلة، المضادة للأجسام المضادة السالمونيلا بالإضافة إلى FITC (CSA-1-FITC) في 1/500، ومكافحة calnexin في 1/100 أو مكافحة PDI في 1/100 في KHM تستكمل عازلة مع 3٪ BSA.
- permeabilization الخلية.
- إزالة لوحة من الحاضنة وغسل الآبار 3X مع 0.5 مل من KHM العازلة (تسخينه مسبقا إلى 37 درجة مئوية). إزالة KHM العازلة وإضافة 0.25 مل عادي KHM العازلة إلى الآبار A4 وB1 / C1، KHM العازلة مع ديجيتونين إلى الآبار A1 - A3 و B2 / C2 أو KHM العازلة مع سابونين إلى الآبار A5 و B3 / C3 (وفقا للجدول 1). احتضان بالضبط 1 دقيقة في RT وعلى الفور غسل جميع الآبار 3X مع 0.5 مل من KHM العازلة (قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية).
- تلوين الأجسام المضادة الأولية.
- إزالة العازلة KHM وإضافة حلول الأجسام المضادة الأولية (عنزة مكافحة السالمونيلا -FITC، 250 ميكرولتر / جيد، 0.1 ميكروغرام / مل) إلى الآبار المناسبة (الشكل 1 الجدول 1). احتضان لوحة لمدة 15 دقيقة في حاضنة عند 37 درجة مئوية و CO 2 5٪.
- غسل الخلايا 1X مع 1 مل PBS.
- الخلايا المصابة (الآبار A1 - A5): تحليل FACS
- غسل الخلايا 3X مع برنامج تلفزيوني وإضافة 0.5 مل من PBS الجليد الباردة تحتوي على 0.1٪ تريتون. نقل إلى أنبوب 5 مل FACS مع غطاء مصفاة الخلية لتفريق المجاميع الخلية. الاحتفاظ بعينات على الجليد.
- تحليل عينات من FACS. باستخدام عناصر التحكم permeabilized بالكامل، تعيين بوابة لمجموع البكتيريا استنادا إلى الأمام والجانب مبعثر (FSC / SSC) أولا، وإشارة mCherry (610 نانومتر ± 20 نانومتر فلتر).
- المقبل، وتحليل إشارة FITC في مجموع السكان البكتيرية باستخدام عناصر التحكم permeabilized permeabilized تماما وعدم تعيين بوابات للبكتيريا عصاري خلوي (FITC +، mCherry +) والبكتيريا فجوي (FITC-، mCherry +) (الشكل 3).
- مع مجموعة من البوابات، وتحليل العينات وتحديد نسبة مقابل عصاري خلويالبكتيريا فجوي باستخدام برنامج FlowJo وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- ضوابط permeabilization غير المصابة (الآبار B1 - B3، C1 - C3): المجهر
- تثبيت
- إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 250 ميكرولتر من PFA 4٪ في برنامج تلفزيوني. احتضان لمدة 10 دقيقة عند 37 ° C.
- غسل الآبار 2X مع 1 مل من برنامج تلفزيوني وإضافة 250 ميكرولتر من 0.1 M الجلايسين في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة لإرواء تثبيتي. غسل الآبار 2X مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.
- تلوين الأجسام المضادة الثانوية.
- ضوابط permeabilization صمة عار لمدة 1 ساعة على RT مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة بالإضافة إلى fluorophores في برنامج تلفزيوني تستكمل مع 0.1٪ سابونين و 3٪ BSA إلى خلايا permeabilize تماما.
- غسل coverslips 3X مع 1 مل من برنامج تلفزيوني وجبل لل coverslips للتحليل في تصاعد المتوسطة مع دابي (1.5 ميكروغرام / مل).
- التحليل المجهري.
- تحليل لل coverslips مع الضوابط في 40X 63X التكبير أو باستخدام فلوو متحد البؤرالمجهر rescence. إذا عملت permeabilization، ينبغي أن يكون هناك أي تلطيخ للخلايا غير permeabilized، Calnexin تلطيخ لكل من خلايا digitonin- وسابونين permeabilized وPDI تلطيخ فقط عن الخلايا permeabilized سابونين (الشكل 4).
- تثبيت
2. ديجيتونين الفحص مع السالمونيلا ليس لها علامة (التحليل القائم على الميكروسكوب)
- إعداد البكتيريا لO / N الثقافات.
- تطعيم الخالي من الملصقات السالمونيلا من النوع البري SL1344 (مقاومة ستربتومايسين) قبل الإصابة في 3 مل من LB المتوسطة تستكمل مع الستربتوميسين (90 ميكروغرام / مل) في شاكر في 37 ° CO / N 1 يوم.
- طلاء الخلايا للعدوى.
- BMDMs البذور في 24 لوحة جيدا تحتوي على coverslips الزجاج معقمة في مناطق ذات كثافة 1.25 × 10 5 خلايا / جيد في 1 مل من المتوسط بلعم (تستكمل DMEM مع 10٪ الجنين العجل المصل (FCS،-تستكمل دي، 56 ° C،30 دقيقة)، 1٪ HEPES، 1٪ الأحماض-L غير الاساسيين الأمينية (NEAA)، 1٪ L-الجلوتامين و 10٪ L929 طاف). آبار البذور وفقا للجدول 1 لمراعاة الظروف الفردية.
- احتضان الخلايا O / N في حاضنة عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪.
- إعداد البكتيريا لعدوى.
- في اليوم التالي، وتحديد تركيز السالمونيلا في O / N الثقافة عن طريق تمييع الثقافة 01:10 في برنامج تلفزيوني وقياس OD 600 ضد السيطرة الوحيدة PBS. هذا يضمن أن يتم قياس OD 600 في مجموعة خطية من الطيف.
- تحديد تركيز السالمونيلا في الملليمتر الواحد. وOD 600 من 1 يناظر 1 × 10 9 البكتيريا.
- يخفف من البكتيريا في المتوسط بلعم للوصول إلى تركيز السالمونيلا 1.25 × 10 6 خلية / مل.
- إصابة الخلايا مع السالمونيلا.
- أجهزة الطرد المركزي لوحة لمدة 15 دقيقة في 300 x ج في 37 ° C لمزامنة العدوى. نقل لوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية و CO 2 5٪.
- قتل السالمونيلا خارج الخلية مع الجنتاميسين.
- في 1 ساعة بعد الإصابة، وإزالة لوحة من الحاضنة وإضافة 0.1 مل من المتوسط بلعم تحتوي على 1 ملغ / مل الجنتاميسين لقتل البكتيريا خارج الخلية لجميع الآبار. نقل لوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية و CO 2 5٪.
- غسل الخلايا.
- في 2 ساعة بعد الإصابة، وإزالة لوحة من الحاضنة ويغسل كل 3X جيدا مع 1 مل من المتوسط بلعم الطازجة التي تحتوي على 10 ميكروغرام / مل الجنتاميسين لمنعنمو البكتيريا خارج الخلية المتبقية. نقل لوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية و CO 2 5٪.
- إعداد مخازن جديدة مع المنظفات والأجسام المضادة.
- فقط قبل نقطة الوقت المطلوب للتحليل، وإعداد محلول المخزون جديدة من ديجيتونين في 1 ملغ / مل في KHM العازلة (110 ملي خلات البوتاسيوم، 20 ملي HEPES، 2 مم MgCl 2، ودرجة الحموضة 7.3). تصفية الأسهم وتمييع في KHM المخزن المؤقت إلى تركيز العمل من 50 ميكروغرام / مل من ديجيتونين.
- بالإضافة إلى ذلك، يعد حل من 0.1٪ سابونين في KHM العازلة، ومكافحة السالمونيلا -FITC (CSA-1، 0،1 ميكروغرام / مل)، ومكافحة calnexin في 1/100 أو مكافحة PDI في 1/100 في KHM العازلة تستكمل مع 3٪ BSA (انظر الجدول مواد لتركيز الأجسام المضادة).
- permeabilization الخلية.
- إزالة لوحة من الحاضنة وغسل الآبار 3X مع 0.5 مل من KHM العازلة (تسخينه مسبقا إلى 37 درجة مئوية). إزالة KHM العازلة وإضافة 0.25 مل عادي KHM العازلةإلى الآبار A4 وB1 / C1، KHM العازلة مع ديجيتونين إلى الآبار A1 - A3 و B2 / C2 أو KHM العازلة مع سابونين إلى الآبار A5 و B3 / C3 (وفقا للجدول 1). احتضان بالضبط 1 دقيقة في RT وعلى الفور غسل جميع الآبار 3X مع 0.5 مل من KHM العازلة (قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية).
- تلوين الأجسام المضادة الأولية.
- إزالة العازلة KHM وإضافة حلول الأجسام المضادة الأولية (عنزة مكافحة السالمونيلا CSA1-FITC، 250 ميكرولتر / جيد، 0.1 ميكروغرام / مل) إلى الآبار المناسبة (الشكل 2، الجدول 1). احتضان لوحة لمدة 15 دقيقة في حاضنة عند 37 درجة مئوية و CO 2 5٪. غسل 3X مع 1 مل PBS.
- تثبيت.
- إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 250 ميكرولتر من PFA 4٪ في برنامج تلفزيوني. احتضان لمدة 10 دقيقة عند 37 ° C.
- غسل الآبار 2X مع 1 مل من برنامج تلفزيوني وإضافة 250 ميكرولتر من 0.1 M جليكاين في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة لإرواء تثبيتي. غسل الآبار 2X مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.
- مجموعالسالمونيلا تلطيخ العينات المصابة.
- غسل coverslips 3X مع برنامج تلفزيوني مع 0.1٪ سابونين / 3٪ BSA واحتضان عينات مع الأجسام المضادة لمكافحة CSA1 (عنزة مكافحة CSA1، 0.1 ميكروغرام / مل، والماوس مكافحة LPS يعمل كذلك، 0.1 ميكروغرام / مل) لمدة 1 ساعة في RT في برنامج تلفزيوني مع 0.1٪ سابونين / 3٪ BSA.
- غسل 3X في برنامج تلفزيوني مع 0.1٪ سابونين / 3٪ BSA. احتضان العينات الخاصة بك مع الثانوي الأجسام المضادة لمكافحة الماعز بالإضافة إلى fluorophore الاختيار في برنامج تلفزيوني مع 0.1٪ سابونين / 3٪ BSA لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام.
- غسل coverslips 3X مع 1 مل من برنامج تلفزيوني وجبل لل coverslips للتحليل في تصاعد المتوسطة مع دابي (1.5 ميكروغرام / مل).
- التحليل المجهري.
- الحصول على البيانات مع المجهر متحد البؤر من خلال إحصاء السالمونيلا عصاري خلوي (مكافحة السالمونيلا -FITC إيجابية) ومجموع السالمونيلا (مزدوج إيجابي) (الشكل 5). يجب أن الضوابط Permeabilization تظهر: أي تلطيخ للخلايا غير permeabilized، Calnexin الصورةtaining عن الخلايا permeabilized ديجيتونين وPDI تلطيخ للخلايا permeabilized سابونين (الشكل 4). سوف الآبار A4 و A5 خدمة الرقابة الداخلية كما لتلطيخ السالمونيلا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الرقم 1 والرقم 2 تظهر الخطط للمقايسة ديجيتونين هو موضح في البروتوكول 1 و 2 بروتوكول توضح الخطوات الحاسمة في البروتوكول والنتائج التي تم الحصول عليها. ويبين الشكل 3 النتائج FACS نموذجية. تستخدم الضوابط الإيجابية والسلبية لضبط بوابات للmCherry + / البكتيريا FITC- (فجوي السالمونيلا) وmCherry + / FITC + البكتيريا (عصاري خلوي السالمونيلا). وبناء على هذه البوابات نسبة البكتيريا عصاري خلوي وفجوي يمكن تحديد في العينات التجريبية. في هذا المثال قمنا بالمقارنة من النوع البري وΔsifA السالمونيلا. ويبين الشكل 3 بيانات تمثيلية تم الحصول عليها مع mCherry + السالمونيلا التيفية الفأرية من النوع البري ومتحولة ΔsifA في العظام المستمدة من نخاع الفئران الضامة. يبين الشكل 4 Calnexin المعتاد (A) وPDI (B) تلطيخ التي يتم الحصول عليها في permeabilization الضوابط رreated مع ديجيتونين أو سابونين. منذ Calnexin هو بروتين الغشاء ER، يمكن أن ينظر Calnexin تلطيخ جميع أنحاء العصارة الخلوية وحول النواة في كل من خلايا digitonin- وpermeabilized سابونين. في ديجيتونين permeabilized الضوابط أي تلطيخ PDI (ER التجويف) مرئيا، يمكن ملاحظتها في الخلايا permeabilized سابونين بينما تلطيخ. ويبين الشكل 5A السالمونيلا مكافحة نتيجة تلطيخ في الخلايا التي تم permeabilized مع ديجيتونين. مجموع البكتيريا باللون الأحمر، في حين أن البكتيريا عصاري خلوي هي باللون الأخضر (ملطخة مكافحة السالمونيلا -FITC). السكان FITC إيجابية لالسالمونيلا مع الحصول على العصارة الخلوية، في حين أن عدد السكان FITC سلبية هي بكتيريا كانوا يقيمون في السالمونيلا سليمة المحتوية فجوة (SCV)، وبالتالي كانت محمية من العلامات السالمونيلا -FITC. قمنا بالمقارنة أيضا من النوع البري السالمونيلا إلى سلالة متحولة ΔsifA. منذ سيفا هو ضروري لالسالمونيلا للحفاظ Sسلامة CV زيادة النسبة المئوية من السالمونيلا هي عصاري خلوي. في الشكل 5B نظهر عنصر تحكم، حيث تقوم الخلايا لم ديجيتونين permeabilized قبل أن يضيف مكافحة السالمونيلا -FITC. وفقا لذلك، لا يمكن رؤية البكتيريا FITC إيجابي.
الشكل 1. تمثيل تخطيطي للبروتوكول 1. الخلايا المصابة التي تحتوي على السالمونيلا mCherry إيجابية سواء في فجوات سليمة أو العصارة الخلوية وpermeabilized تفاضلي مع ديجيتونين. هي ملطخة عصاري خلوي السالمونيلا مع مكافحة السالمونيلا بالإضافة إلى FITC. تغسل الخلايا وهي lysed مع تريتون X-100 لتحليل FACS. لا permeabilized الخلايا السيطرة السلبية، في حين يتم permeabilized الخلايا السيطرة الإيجابية تماما قبل تلوين الأجسام المضادة.
الشكل 2. تمثيل تخطيطي للبروتوكول 2. الخلايا المصابة التي تحتوي على السالمونيلا الخالي من الملصقات سواء في فجوات سليمة أو العصارة الخلوية وpermeabilized تفاضلي مع ديجيتونين. هي ملطخة عصاري خلوي السالمونيلا مع مكافحة السالمونيلا بالإضافة إلى FITC. تغسل الخلايا وثابتة مع 4٪ PFA. وpermeabilzed تماما الخلايا وملطخة الأجسام المضادة السالمونيلا المضادة، تليها تلطيخ مع الأجسام المضادة الثانوية بالإضافة إلى اليكسا 568. المجهري يستخدم لحساب FITC + / + Alexa568 السالمونيلا (عصاري خلوي) وAlexa568 + السالمونيلا (فجوي).
الرقم تحليل 3. FACS من permeabilized تماما، وعينات permeabilized unpermeabilized أو تفاضلي إصابة لمدة 6 ساعة مع mCherry + من النوع البري أو & #916؛ سيفا السالمونيلا لمدة 6 ساعة.
الرقم 4. المضادة للCalnexin (A) ومكافحة PDI (B) تلطيخ BMDMs غير مصاب permeabilized مع ديجيتونين أو سابونين. القضبان مقياس 10 ميكرون.
الرقم 5. صور الممثل من permeabilization فحص التفاضلية مع السالمونيلا التيفية الفأرية البرية من نوع وسلالة متحولة ΔsifA في 6 ساعات بعد الإصابة. وأشار عصاري خلوي السالمونيلا ومجموع السالمونيلا. وكانت الخلايا إما ديجيتونين permeabilized (A) أو اليسار unpermeabilized (B) قبل تلطيخ مع مكافحة السالمونيلا -FITC لالسالمونيلا عصاري خلوي. بعد هذه الخطوة تلطيخ، جتم permeabilized ملتعلمي اللغة اإلنكليزية مع سابونين وكانت ملطخة مجموع السالمونيلا مع مكافحة الأجسام المضادة السالمونيلا تليها تلطيخ الضد الثانوية (أحمر). على نطاق ويمنع 10 ميكرون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
permeabilization الفرق هو طريقة سهلة وقوية لتحليل وتحديد التوزيع التحت خلوية من مسببات الأمراض البكتيرية بين المقصورات فجوي والعصارة الخلوية. وقد استخدم نفس الفحص بنجاح مع البكتيريا مثل الفرنسيسيلة القتولة 2،4 والشيجلا الفلكسنرية 12. ومع ذلك، لأن العديد من العوامل المسببة للأمراض الخلايا تغير أو تعدل الهياكل endomembrane المضيف، فإن متانة permeabilization ديجيتونين يجب أن يتحدد على أساس فردي. صقل للفحص فيما يتعلق الممرض أو خلية خط المستخدمة قد تكون ضرورية. مقايسة لا يقتصر فقط على الأحياء العدوى، ولكن يمكن استخدامها أيضا لتطبيق البيولوجي خلية أخرى، مثل موت الخلايا مما يشير إلى 17،18.
المفتاح لهذا الاختبار هو أن غشاء البلازما وغشاء الخلايا لديها تكوين الدهون مختلفة، ولا سيما أغشية الخلايا تحتوي على أقل تشوlesterol. ديجيتونين يمكن الكولسترول معقدة، وبالتالي يؤدي لتباين permeabilization، وكفاءة والانتقائية الذي يعتمد على طول فترة العلاج ديجيتونين وتركيز المنظفات. للسيطرة على هذا فمن المهم فحص الخلايا permeabilized التي تلطيخ للبروتينات علامة مع تعريف التعريب داخل الخلايا، مثل ذيل عصاري خلوي من calnexin أو PDI ER البروتين اللمعية.
في حين permeabilization التفاضلية ليست جديدة، وهذا البروتوكول يسمح بالإضافة إلى تقدير سريع وموضوعي من البكتيريا عصاري خلوي وفجوي على أساس FACS. لتحليل FACS من المهم أن تشمل اثنين من الضوابط، التي هي خلايا غير permeabilized وpermeabilized تماما. وبناء على هذه العينات تحكم سيتم تعيين بوابات لغير ملوثين وملطخة تماما أي فجوي والبكتيريا عصاري خلوي.
A خطوة حاسمة من البروتوكول هو permeabilization وخطوات الغسيل اللاحقة. الابمحاليل ومواد التنظيف مستعدة eshly لا بد من استخدامها. يجب أن تكون جميع الحلول إعداد قبل الاستخدام. نقطة هامة أخرى هي توقيت permeabilization. هنا 1 دقيقة بتركيز ديجيتونين من 50 ميكروغرام / مل وقد ثبت للعمل بشكل جيد لنقي العظم الضامة مشتقة. عند استخدام خطوط مختلفة من الخلايا، قد تحتاج إلى تركيز العمل على أن تحدد تجريبيا. تركيزات عالية من ديجيتونين أو الحضانة مرات أكثر من 1 دقيقة يمكن أن يؤدي إلى permeabilization أغشية الداخلية، ونتائج إيجابية كاذبة. حلول ديجيتونين مستقرة فقط ل1-2 ساعة. إعداد حل جديد من ديجيتونين قبل هو في غاية الأهمية. أيضا قدرة ديجيتونين إلى permeabilze يمكن الأغشية تختلف من دفعة لدفعة وبين مختلف الموردين.
ولذلك إذا كان في حاجة العديد من العينات المراد علاجها فإنه من المستحسن تقسيم هذه إلى مجموعات أصغر التي يمكن معالجتها بسهولة وبسرعة. أخيرا، عن خطوات الغسيل بعد بيرمeabilization تحتاج إلى القيام به بعناية فائقة منذ علاج ديجيتونين تضعف الأغشية الخلوية. وينبغي أن يتم إضافة العازلة والطموح برفق على جانب البئر وليس في منتصف البئر.
كما أشار وتقنيات أخرى لتحليل التوزيع التحت خلوية من البكتيريا بين العصارة الخلوية ومقصورات فجوي موجودة، مثل استخدام للانشقاق ب اكتاماز الحنق مراسل CCF4-AM 19. في حين أن طريقة CCF4-AM توفر ميزة قياس تمزق فجوي في الوقت الحقيقي، وأنها تفتقر إلى قرار على مستوى البكتيريا واحد ويمكن أن توفر معلومات عن مستوى الخلية المضيفة واحد فقط. وبالتالي مزيج من الاثنين معا المقايسات مثالية للحصول على معلومات حول مستويات خلايا البكتيريا / مضيف واحد على مر الزمن. الأهم من ذلك، على حد سواء المقايسات يمكن استخدامها ليس فقط في سياق الالتهابات البكتيرية، ولكن أيضا في سياق الدراسات البيولوجية الخلايا الأخرى التي تهدف إلى تحديد التعريب شبه الخلوية الهدف صroteins 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نود أن نعترف ماتياس S. ديك، رولاند F. دراير وسيباستيان رول للمناقشة. وأيد هذا العمل من قبل SNSF الأستاذية PP00P3_139120 / 1 وجامعة بازل منحة المشروع ID2153162 لPB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digitonin | Sigma | D5628 | 50 μg/ml |
| PFA | mpbio | 219998380 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630 | |
| Potassium Acetate | Sigma | 791733 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| anti-Salmonella CSA-1-FITC | KPL | 01-91-99-MG | 1/500 |
| anti-Salmonella CSA-1 | KPL | 02-91-99-MG | 1/500 |
| anti-Calnexin | Enzo Lifesciences | SPA-860D | 1/100 |
| anti-PDI | Enzo Lifesciences | SPA-890 | 1/100 |
| Saponin | Sigma | 47036 | |
| Vectashield mounting medium | Vectorlabs | H-1200 | |
| Anti Rabbit antibody-488 | Molecular Probes | A-11070 | 1/500 |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15710-49 | 100 μg/ml and 10 μg/ml |
| Triton X-100 | Promega | H5141 | |
| PBS | Gibco | 20012-019 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| NEAA | Amimed | 5-13K00-H | |
| LSM700 Confocal microscope | Zeiss | imaging done at 63X | |
| FACS Fortessa | BD technologies | detection mCherry 610 nm | |
| FACS Fortessa | BD technologies | detection FITC 530 nm |
References
- Kumar, Y., Valdivia, R. H. Leading a sheltered life: intracellular pathogens and maintenance of vacuolar compartments. Cell Host Microbe. 5, 593-601 (2009).
- Chong, A., et al. The early phagosomal stage of Francisella tularensis determines optimal phagosomal escape and Francisella pathogenicity island protein expression. Infect Immun. 76, 5488-5499 (2008).
- Mellouk, N., et al. Shigella subverts the host recycling compartment to rupture its vacuole. Cell Host Microbe. 16, 517-530 (2014).
- Checroun, C., Wehrly, T. D., Fischer, E. R., Hayes, S. F., Celli, J. Autophagy-mediated reentry of Francisella tularensis into the endocytic compartment after cytoplasmic replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 14578-14583 (2006).
- Broz, P., Monack, D. M. Newly described pattern recognition receptors team up against intracellular pathogens. Nat Rev Immunol. 13, 551-565 (2013).
- Hagar, J. A., Powell, D. A., Aachoui, Y., Ernst, R. K., Miao, E. A. Cytoplasmic LPS activates caspase-11: implications in TLR4-independent endotoxic shock. Science. 341, 1250-1253 (2013).
- Ogawa, M., et al. Escape of intracellular Shigella from autophagy. Science. 307, 727-731 (2005).
- Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. Salmonellae interplay with host cells. Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).
- Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole. J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).
- Malik-Kale, P., Winfree, S., Steele-Mortimer, O. The bimodal lifestyle of intracellular Salmonella in epithelial cells: replication in the cytosol obscures defects in vacuolar replication. PLoS One. 7, e38732 (2012).
- Zhao, Y. O., Khaminets, A., Hunn, J. P., Howard, J. C. Disruption of the Toxoplasma gondii parasitophorous vacuole by IFNgamma-inducible immunity-related GTPases (IRG proteins) triggers necrotic cell death. PLoS Pathog. 5, e1000288 (2009).
- Meunier, E., et al. Caspase-11 activation requires lysis of pathogen-containing vacuoles by IFN-induced GTPases. Nature. 509, 366-370 (2014).
- Yamamoto, M., et al. A cluster of interferon-gamma-inducible p65 GTPases plays a critical role in host defense against Toxoplasma gondii. Immunity. 37, 302-313 (2012).
- Degrandi, D., et al. Murine guanylate binding protein 2 (mGBP2) controls Toxoplasma gondii replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 294-299 (2013).
- Mariathasan, S., et al. Differential activation of the inflammasome by caspase-1 adaptors ASC and Ipaf. Nature. 430, 213-218 (2004).
- Knodler, L. A., Nair, V., Steele-Mortimer, O. Quantitative assessment of cytosolic Salmonella in epithelial cells. PLoS One. 9, e84681 (2014).
- Ng, H., Smith, D. J., Nagley, P. Application of flow cytometry to determine differential redistribution of cytochrome c and Smac/DIABLO from mitochondria during cell death signaling. PLoS One. 7, e42298 (2012).
- Krawczyk, E., Suprynowicz, F. A., Sudarshan, S. R., Schlegel, R. Membrane orientation of the human papillomavirus type 16 E5 oncoprotein. J Virol. 84, 1696-1703 (2010).
- Keller, C., et al. Single cell measurements of vacuolar rupture caused by intracellular pathogens. J Vis Exp. , e50116 (2013).
