Abstract
Intracellulaire bacteriële pathogenen kunnen repliceren in het cytosol of in gespecialiseerde pathogeen bevattende vacuolen (PCVs). Om de cytosol te bereiken, bacteriën zoals Shigella flexneri en Francisella novicida nodig om de breuk van de phagosome induceren. Daarentegen Salmonella typhimurium repliceert in een vacuolaire compartiment zogenaamde Salmonella bevattende vacuole (SCV). Maar bepaalde mutanten van Salmonella niet aan SCV integriteit te behouden en zijn dus vrij in het cytosol. Het percentage cytosolische vs. vacuole bacteriën op het niveau van afzonderlijke bacteriën kan worden gemeten door differentiële permeabilisatie, ook bekend als phagosome bescherming assay. De aanpak maakt gebruik van het onroerend goed van wasmiddel digitonine selectief cholesterol te binden. Aangezien de plasmamembraan bevat meer cholesterol dan andere cellulaire membranen kunnen digitonine worden gebruikt om selectief permeabiliseren het plasmamembraan terwijl intracellulaire membranenintact. Kortom, na infectie met het pathogeen expressie brengen van een fluorescente merker eiwit (bijv mCherry oa), wordt het plasmamembraan gastheercellen permeabel gemaakt met een korte incubatie in digitonine bevattende buffer. De cellen worden vervolgens gewassen en geïncubeerd met primair antilichaam (gekoppeld aan een fluorofoor keuze) gericht tegen de bacterie naar keuze (bijvoorbeeld anti- Salmonella FITC) en opnieuw gewassen. Als alleen bacteriën worden gebruikt, kan een extra stap worden uitgevoerd, waarbij alle membranen permeabel en bacteriën gekleurd met een corresponderende antilichaam. Na de kleuring, kan het percentage in vacuolen en cytosolische bacteriën worden gekwantificeerd door FACS of microscopie door telling met één of twee positieve gebeurtenissen. Hier hebben we experimentele details voor het gebruik van deze techniek met de bacterie Salmonella typhimurium. Het voordeel van deze test is dat, in tegenstelling tot andere assay biedt een kwantificering van het niveau van afzonderlijke bacte-ria, en indien geanalyseerd met behulp van microscopie levert het exacte aantal cytosolische en vacuolaire bacteriën in een bepaalde cel.
Introduction
Intracellulaire bacteriële pathogenen repliceren rechtstreeks in de gastheercel cytosol of in gespecialiseerde vacuolaire compartimenten 1. Tijdens de beginfase van de infectie meest pathogenen te geïnternaliseerd hetzij fagocytose door gespecialiseerde cellen (bijvoorbeeld macrofagen) of actief bevorderen hun opname in niet-fagocytaire cellen. In fagocytische cellen, de fagosoom normaal gen met lysosomen een degradatieve compartiment, waarbij de gefagocyteerde deeltjes gedigereerd vormen. Gespecialiseerde cytosolische bacteriën, zoals Francisella novicida of Shigella flexneri, ontsnappen phagosomal afbraak door het induceren van de breuk van de phagosome en vervolgens ontsnappen in de cytosol 2,3. Dit vereist-virulentie geassocieerd mechanisme zoals de Francisella Pathogeniteit Island (FPI), of de Shigella flexneri T3SS, die effector eiwitten die de vacuole breuk 2-4 bevorderen injecteert. De gastheercel cytosol functieseen aantal geconserveerde patroonherkenning receptoren die normaal gesproken de aanwezigheid van ziekteverwekkers herkennen en veroorzaken aangeboren immuunsysteem signalering 5. Bovendien xenophagy, een antimicrobieel vorm van autophagy kan bacteriën die de cytosol voeren degraderen. Cytosolische bacteriën zijn doorgaans goed aangepast aan het bot of te omzeilen deze reacties met behulp van verschillende strategieën. Bijvoorbeeld, Francisella wijzigt haar LPS gastheer erkenning te vermijden en Shigella voorkomt autofagie recruitment met uitgescheiden effector eiwitten 6,7.
Een andere strategie om lysosomale degradatie ontsnappen is in dienst van het model vacuole pathogeen Salmonella enterica serovar Typhimurium, daarna aangeduid als Salmonella typhimurium. Salmonella maakt gebruik van een T3SS aan effectoren dat de eerste phagosome verbouwen in zijn intracellulaire niche te injecteren, de Salmonella bevattende vacuole (SCV) 8,9. Continue manipulatie van gastheer paden ismoet deze vacuole door het aantrekken lipiden en andere voedingsstoffen naar de vacuole te handhaven. Inderdaad, een Sifa mutant van Salmonella nalaat vacuolaire stabiliteit, en komt in de cytosol gastheercellen binnen enkele uren na infectie, wat resulteert in activering van innate immune paden en autophagy recruitment 8. Vacuolaire ontsnappen van Salmonella varieert afhankelijk van het celtype dat studies en verschillende rapporten hebben aangetoond dat epitheelcellen zelfs WT Salmonella kunnen de SCV en hyperreplicate ontsnappen in de cytosol 10. Recente rapporten tonen aan dat aangeboren immuunsysteem detectie vacuolen pathogenen ook afhankelijk van het vermogen van de gastheer herkennen en destabiliseren pathogeen bevattende vacuolen (PCVs) 11-14.
Aangezien de host of de bacteriën kunnen genotype verdeling van intracellulaire bacteriën tussen de vacuole en cytosolische compartiment beïnvloeden, is het noodzakelijk om het aantal vacuolen vs. kwantificerencytosolische bacteriën. Aangezien in de meeste experimentele opstellingen gastheercellen worden geïnfecteerd met meer dan één bacterie, vervolgens kunnen verschillende bacteriën herbergen in verschillende subcellulaire compartimenten, is een techniek vereist die kwantificering mogelijk maakt op het niveau van afzonderlijke bacteriën. Differential permeabilisatie (ook bekend als bescherming phagosomal test) biedt deze resolutie 2,4,10,12. De assay is gebaseerd op selectieve permeabilisatie van het plasmamembraan gastheercel met het detergens digitonine, die vacuolaire membranen wordt afgebroken en maakt daardoor selectieve kleuring van cytosolisch bacteriën antilichamen. Hier hebben we twee protocollen voor het kwantificeren van cytosolische en vacuolaire Salmonella typhimurium middels differentiële permeabilisatie. Het principe van deze werkwijze wordt beschreven in Figuur 1: beenmerg afgeleide macrofagen (BMDMs) worden geïnfecteerd met stationaire fase mCherry-expressie Salmonella. Stationaire fase Salmonella nodig to worden gebruikt omdat ze downregulate de uitdrukking van de SPI-1 T3SS, waarvan de activiteit anders zouden worden erkend door de NLRC4 inflammasoom en veroorzaken een snelle celdood (pyroptosis) van de BMDMs 15. Na de infectie werden de cellen worden gewassen en behandeld met 50 ug / ml digitonine gedurende 1 minuut. Cellen worden onmiddellijk opnieuw gewassen en geïncubeerd met anti-Salmonella-antilichamen gekoppeld met FITC bacteriën markeren met toegang tot het cytosol. Na een additionele wasstap cellen worden gelyseerd en het percentage mCherry + (vacuole) en FITC + / + mCherry (cytosol) bacteriën wordt bepaald door FACS. We rapporteren ook een aanpassing van deze werkwijze die kan worden gebruikt als er geen fluorescerend eiwit tot expressie stammen zijn (figuur 2). Extra stappen zijn ingevoerd na de FITC labeling waarbij cellen gefixeerd en volledig gepermeabiliseerd. Daarna alle bacteriën worden gekleurd met anti-Salmonella antistoffen en bijbehorende secundaire antilichamen. Deteel gebeurt dan door middel van microscopisch plaats van FACS-analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Digitonine Assay met mCherry-expressie Salmonella (FACS-gebaseerde analyse)
- Voorbereiden van bacteriën
Opmerking: Salmonella wildtype SL1344 (streptomycineresistente) tot expressie mCherry uit een plasmide (pFPV codeert mCherry onder RPSM promoter) wordt gebruikt in deze test. Bacteriële fagocytose en proliferatie indien niet gewijzigd door de constitutieve expressie van mCherry (gegevens niet getoond) 16.- Inoculeer de stam 1 dag vóór de infectie in 3 ml LB medium aangevuld met streptomycine (90 gg / ml) en ampicilline (100 ug / ml, mCherry expressie vector) in een schudder bij 37 ° CO / N.
- Plating cellen voor infectie.
- Seed wildtype BMDMs in een 24 wells plaat met een dichtheid van 1,25 x 10 5 cellen / putje in 1 ml primaire macrofagen medium (DMEM gesupplementeerd met 10% foetaal kalfsserum (FCS, door warmte geïnactiveerd, 56 ° C, 30 min ), 1% HEPES, 1% niet-essentiële aminozuren (NEAA), 1% L-glutamine en 10% L929 supernatant (geconditioneerd medium van macrofaag-koloniestimulerende factor (M-CSF) producerende L929-cellen). Seed putjes volgens tabel 1 overeenkomt met het individuele omstandigheden. Dekglaasjes Aan de putjes als controles (tabel 1).
- Incubeer de cellen een nacht in een incubator bij 37 ° C en 5% CO 2.
| Permeabilisatie | Kleuring | ||||||
| Glas dekglaasje | Salmonella | Digitonine | Saponine | anti-Salmonella | anti-calnexin | anti PDI- | |
| A1 (monster) | - / + * | + | + | + | |||
| A2 (monster) | - / + * | + + | + | ||||
| A3 (monster) | - / + * | + | + | + | |||
| A4 (zonder permeabilisatie controle) | - / + * | + | + | ||||
| A5 (complete permeabilisatie control) | - / + * | + | + | + | |||
| B1 (gekleurd voor calnexin) | + | + | |||||
| B2 (gekleurd voor calnexin) | + | + | + | ||||
| B3 (gekleurd voor calnexin) | + | + | + | ||||
| C1 (gebrandschilderdvoor PDI) | + | + | |||||
| C2 (gekleurd voor PDI) | + | + | + | ||||
| C3 (gekleurd voor PDI) | + | + | + | ||||
Tabel 1: Plating regeling voor beenmerg afgeleide macrofagen (BMDMs) in een 24-well formaat voor daaropvolgende infectie met Salmonella, permeabilisatie en kleuring * Naargelang protocol 1 of 2 protocol wordt uitgevoerd..
- Voorbereiding van de bacteriën op infectie.
- De volgende dag, het gehalte van Salmonella in de overnacht kweek door verdunning van de kweek 1:10 in PBS en het meten van de OD 600 tegen een enkel PBS controle. Hierdoor wordt de OD 600 wordt gemeten in het linear bereik van de spectrofotometer.
- Bereken de concentratie van Salmonella per ml. Een OD600 van 1 komt overeen met 1 x 10 9 bacteriën.
- Verdun de bacteriën in macrofagen medium tot een concentratie van Salmonella 1,25 x 10 6 cellen / ml bereiken.
- Infectie van cellen met Salmonella.
- Verwijder medium uit BMDMs. Voeg 1 ml medium geïnfecteerde macrofaag controleputjes (B1-B3, C1-C3). Voeg 1 ml van Salmonella suspensie aan putjes A1 - A5 een multipliciteit van infectie (MOI) van 10 bacteriën per cel bereikt.
- Centrifugeer de plaat gedurende 15 min bij 300 xg bij 37 ° C om de infectie te synchroniseren. Breng de plaat in een incubator bij 37 ° C en 5% CO 2.
- Killing extracellulaire Salmonella met Gentamicine.
- Op 1 uur na infectie, verwijder plaat uit incubator en voeg 0,1 ml van macrofagen medium met 0,1 mg / ml Gentamicineextracellulaire bacteriën te doden. Toevoegen gentamicine aan alle putjes, zelfs uninfected controls, zodat alle cellen op dezelfde wijze behandeld worden. Breng de plaat in een incubator bij 37 ° C en 5% CO 2.
- Het wassen van de cellen.
- Op 2 uur na infectie, verwijder plaat uit incubator en wassen putjes 2x met 1 ml normaal DMEM (voorverwarmd tot 37 ° C) en vervangen door macrofagen medium (voorverwarmd tot 37 ° C) bevattende 10 ug / ml Gentamycine groei van overblijvende extracellulaire bacteriën te voorkomen. Breng de plaat in een incubator bij 37 ° C en 5% CO 2.
- Voorbereiden van vers buffers met detergenten en antilichamen.
- Vlak voor het gewenste tijdstip van analyse bereiden verse voorraadoplossing van digitonine bij 1 mg / ml in KHM buffer (110 mM kaliumacetaat, 20 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7,3). Filter de voorraad en verdun in KHM bufferen tot een werkende concentratievan 50 ug / ml digitonine. Bovendien wordt een oplossing van 0,1% saponine in KHM Buffer, anti- Salmonella antilichaam gekoppeld aan FITC (CSA-1-FITC) en 1/500, anti-calnexine op 1/100 of anti-PDI op 1/100 in KHM Buffer aangevuld met 3% BSA.
- Cel permeabilisatie.
- Verwijder de plaat uit incubator en was putjes 3x met 0,5 ml buffer KHM (voorverwarmd tot 37 ° C). Verwijder KHM buffer en voeg 0,25 ml plain KHM putjes A4 en B1 / C1, KHM Buffer met digitonine putjes A1 - A3 en B2 / C2 of KHM Buffer met saponine putjes A5 en B3 / C3 (volgens tabel 1). Incubeer gedurende precies 1 min bij kamertemperatuur en onmiddellijk alle putjes 3x met 0,5 ml buffer KHM (voorverwarmd tot 37 ° C).
- Primair antilichaam kleuring.
- Verwijder de KHM buffer en voeg het primaire antilichaam oplossing (Goat anti Salmonella FITC, 250 ul / putje, 0,1 gg / ml) aan de geschikte putjes (Figuur 1 tabel 1). Incubeer de plaat gedurende 15 minuten in een incubator bij 37 ° C en 5% CO 2.
- Was de cellen 1x met 1 ml PBS.
- Geïnfecteerde cellen (wells A1 - A5): FACS-analyse
- Was de cellen 3x met PBS en voeg 0,5 ml ijskoude PBS bevattende 0,1% Triton. Transfer naar een 5 ml FACS buis met mobiele zeefdop te breken celaggregaten. Houd monsters op ijs.
- Analyseer de monsters van een FACS. De volledig gepermeabiliseerde controles, stelt de poort voor de totale bacteriën op basis van voorwaartse en zijwaartse verstrooiing (FSC / SSC) eerste, en de mCherry signaal (610 nm ± 20 nm filter).
- Vervolgens analyseert het FITC-signaal in de totale bacteriële populatie De volledig permeabel en niet permeabel controles om de poorten van cytosolische bacteriën (FITC +, mCherry +) en vacuolaire bacteriën (FITC, mCherry +) (figuur 3) in te stellen.
- Met set poorten, analyse van deze monsters en bepaalt het percentage cytosolische vs.vacuole bacteriën gebruiken FlowJo software volgens het protocol van de fabrikant.
- Geïnfecteerde permeabilisatie controles (putten B1 - B3, C1 - C3): microscopie
- Bevestiging
- Verwijder PBS en voeg 250 pl 4% PFA in PBS. Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C.
- Was de putjes 2x met 1 ml PBS en voeg 250 ul van 0,1 M glycine in PBS gedurende 10 min naar het fixeermiddel blussen. Was de putjes 2x met 1 ml PBS.
- Secundair antilichaam kleuring.
- Stain permeabilisatie regelaars voor 1 uur bij KT met geschikte secundaire antilichamen gekoppeld met fluoroforen in PBS gesupplementeerd met 0,1% saponine en 3% BSA volledig permeabilize cellen.
- Wassen dekglaasjes 3x met 1 ml PBS en monteer de dekglaasjes analyse montage medium met DAPI (1,5 ug / ml).
- Microscopie analyse.
- Analyseer de dekglaasjes met de controles op een 40x of 63x vergroting met behulp van een confocale fluocerend microscoop. Als de permeabilisatie heeft gewerkt, mag er geen kleuring van niet- gepermeabiliseerde cellen, calnexin kleuring voor zowel digitonin- en saponine-gepermeabiliseerde cellen en PDI kleuring alleen saponine-gepermeabiliseerde cellen (figuur 4) zijn.
- Bevestiging
2. Digitonine Assay met Unlabeled Salmonella (Microscopie-gebaseerde analyse)
- Voorbereiding bacteriën O / N culturen.
- Inoculeer ongelabeld wildtype Salmonella SL1344 (streptomycineresistente) 1 dag vóór de infectie in 3 ml LB medium aangevuld met streptomycine (90 gg / ml) in een schudder bij 37 ° CO / N.
- Plating cellen voor infectie.
- Seed BMDMs in een 24 wells plaat met steriele dekglaasjes bij een dichtheid van 1,25 x 10 5 cellen / putje in 1 ml macrofaag medium (DMEM gesupplementeerd met 10% foetaal kalfsserum (FCS, aangevuld-de, 56 ° C,30 min), 1% HEPES, 1% L-niet-essentiële aminozuren (NEAA), 1% L-glutamine en 10% L929 supernatant). Seed putjes volgens tabel 1 overeenkomt met het individuele omstandigheden.
- Incubeer de cellen O / N in een incubator bij 37 ° C en 5% CO 2.
- Voorbereiding van de bacteriën op infectie.
- De volgende dag, het gehalte van Salmonella in de O / N kweek door verdunning van de kweek 1:10 in PBS en het meten van de OD 600 tegen een enkel PBS controle. Hierdoor wordt de OD 600 wordt gemeten in het lineaire bereik van de spectrofotometer.
- Bepaal de concentratie van Salmonella per milliliter. Een OD 600 van 1 komt overeen met 1 x 10 9 bacteriën.
- Verdun de bacteriën in macrofagen medium tot een concentratie van Salmonella 1,25 x 10 6 cellen / ml bereiken.
- Infectie van cellen met Salmonella.
- Centrifugeer de plaat gedurende 15 min bij 300 xg bij 37 ° C om de infectie te synchroniseren. Breng de plaat in een incubator bij 37 ° C en 5% CO 2.
- Killing extracellulaire Salmonella met Gentamycin.
- Op 1 uur na infectie verwijderd plaat uit incubator en voeg 0,1 ml van macrofaag medium dat 1 mg / ml gentamycine extracellulaire bacteriën te doden alle putjes. Breng de plaat in een incubator bij 37 ° C en 5% CO 2.
- Het wassen van de cellen.
- Op 2 uur na infectie verwijderd plaat uit incubator en was 3 x elke well met 1 ml vers medium bevattende macrofagen 10 ug / ml Gentamycine voorkomengroei van overblijvende extracellulaire bacteriën. Breng de plaat in een incubator bij 37 ° C en 5% CO 2.
- Voorbereiden van vers buffers met detergenten en antilichamen.
- Vlak voor het gewenste tijdstip van analyse bereiden verse voorraadoplossing van digitonine bij 1 mg / ml in KHM buffer (110 mM kaliumacetaat, 20 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7,3). Filter de voorraad en verdun in KHM Buffer om een werkende concentratie van 50 ug / ml van digitonine.
- Bovendien wordt een oplossing van 0,1% saponine in KHM Buffer, anti- Salmonella FITC (CSA-1, 0,1 ug / ml), anti-calnexine op 1/100 of anti-PDI op 1/100 in KHM buffer gesupplementeerd met 3% BSA (zie materialen tabel voor antilichaamconcentratie).
- Cel permeabilisatie.
- Verwijder de plaat uit incubator en was putjes 3x met 0,5 ml buffer KHM (voorverwarmd tot 37 ° C). Verwijder KHM Buffer en voeg 0,25 ml vlakte KHM Bufferputjes A4 en B1 / C1, KHM Buffer met digitonine putjes A1 - A3 en B2 / C2 of KHM Buffer met saponine putjes A5 en B3 / C3 (volgens tabel 1). Incubeer gedurende precies 1 min bij kamertemperatuur en onmiddellijk alle putjes 3x met 0,5 ml buffer KHM (voorverwarmd tot 37 ° C).
- Primair antilichaam kleuring.
- Verwijder de KHM buffer en voeg het primaire antilichaam oplossing (Goat anti Salmonella CSA1-FITC, 250 ul / putje, 0,1 gg / ml) aan de geschikte putjes (Figuur 2, Tabel 1). Incubeer de plaat gedurende 15 minuten in een incubator bij 37 ° C en 5% CO 2. Was 3 x met 1 ml PBS.
- Fixatie.
- Verwijder PBS en voeg 250 pl 4% PFA in PBS. Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C.
- Was de putjes 2x met 1 ml PBS en voeg 250 ul van 0,1 M Glycine in PBS gedurende 10 min naar het fixeermiddel blussen. Was de putjes 2x met 1 ml PBS.
- TotaalSalmonella kleuring van geïnfecteerde monsters.
- Wassen dekglaasjes 3x met PBS met 0,1% Saponine / 3% BSA en incubeer de monsters met een anti-CSA1 antilichaam (geit anti-CSA1, 0,1 gg / ml, muis anti-LPS werkt ook, 0,1 gg / ml) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in PBS met 0,1% Saponine / 3% BSA.
- Was 3x in PBS met 0,1% Saponine / 3% BSA. Incubeer uw monsters met een secundair anti-geit-antilichaam gekoppeld aan fluorofoor keuze in PBS met 0,1% Saponine / 3% BSA gedurende 30 min bij kamertemperatuur in het donker.
- Wassen dekglaasjes 3x met 1 ml PBS en monteer de dekglaasjes analyse montage medium met DAPI (1,5 ug / ml).
- Microscopie analyse.
- Verwerven van gegevens met een confocale microscoop door het tellen cytosolische Salmonella (anti- Salmonella FITC positief) en de totale Salmonella (dubbel positief) (Figuur 5). Permeabilisatie controles moeten tonen: geen kleuring voor niet-gepermeabiliseerde cellen, calnexin sbevattende voor digitonine gepermeabiliseerde cellen en PDI kleuring voor saponine gepermeabiliseerde cellen (figuur 4). Wells A4 en A5 zal dienen als interne controles voor de Salmonella vlekken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 en Figuur 2 tonen de schema's van de digitonine assay in protocol 1 en protocol 2 ter illustratie van de kritische stappen in het protocol en de verkregen resultaten worden beschreven. Figuur 3 toont typische FACS resultaten. Positieve en negatieve controles worden gebruikt om de poorten die voor mCherry + / FITC bacteriën (Salmonella vacuole) en mCherry + / + FITC bacteriën (Salmonella cytosol). Op basis van deze poorten het percentage cytosolische en vacuolaire bacteriën kan worden bepaald in de experimentele monsters. In dit voorbeeld hebben we wildtype Salmonella en ΔsifA vergeleken. Figuur 3 toont representatieve gegevens verkrijgbaar mCherry + Salmonella typhimurium wild-type en mutant ΔsifA in beenmerg afgeleide murine macrofagen. Figuur 4 toont de gebruikelijke calnexin (A) en PDI (B) kleuring die is verkregen in permeabilisatie controls treated met digitonine of saponine. Aangezien calnexin is een ER membraaneiwit kan calnexine kleuring zichtbaar gehele cytosol en rond de kern, zowel digitonin- en saponine gepermeabiliseerde cellen. In digitonine permeabel controles geen PDI kleuring (ER lumen) zichtbaar, terwijl kleuring worden waargenomen bij met saponine gepermeabiliseerde cellen. Figuur 5A toont anti- Salmonella kleuring resulteren in cellen die zijn gepermeabiliseerd met digitonine. Totaal bacteriën zijn in het rood, terwijl de cytosolische bacteriën zijn in het groen (gekleurd met anti- Salmonella FITC). De FITC-positieve populatie Salmonella toegang tot het cytosol, terwijl de FITC-negatieve populatie bacteriën die zijn geïntegreerd in een intacte Salmonella bevattende vacuole (SCV) en werden derhalve beschermd tegen Salmonella FITC labeling. We hebben ook vergeleken wildtype Salmonella een ΔsifA mutante stam. Aangezien SIFA is noodzakelijk voor Salmonella aan S behoudenCV integriteit een verhoogd percentage van Salmonella cytosolische. In figuur 5B tonen wij een controle waarbij de cellen niet permeabel digitonine voor het toevoegen anti- Salmonella FITC. Bijgevolg kan geen FITC-positieve bacteriën zien.
Figuur 1. Schematische weergave van het protocol 1. Geïnfecteerde cellen bevatten mCherry-positieve Salmonella hetzij in intacte vacuolen of het cytosol worden differentieel gepermeabiliseerd met digitonine. Cytosol Salmonella worden gekleurd met anti- Salmonella gekoppeld aan FITC. Cellen worden gewassen en gelyseerd met Triton X-100 voor FACS-analyse. Negatieve controle cellen niet permeabel, terwijl positieve controlecellen volledig permeabel voor antilichaam kleuring.
Figuur 2. Schematische weergave van protocol 2. Geïnfecteerde cellen met niet-gemerkte Salmonella hetzij in intacte vacuolen of het cytosol worden differentieel gepermeabiliseerd met digitonine. Cytosol Salmonella worden gekleurd met anti- Salmonella gekoppeld aan FITC. Cellen worden gewassen met 4% PFA gefixeerd. De cellen zijn volledig permeabilzed en gekleurd met anti-Salmonella antilichamen, gevolgd door kleuring met secundaire antilichamen gekoppeld aan Alexa 568. Microscopie wordt gebruikt om FITC + / Alexa568 + Salmonella (cytosolische) en Alexa568 + Salmonella (vacuole) tellen.
Figuur 3. FACS-analyse volledig gepermeabiliseerde, unpermeabilized of verschillend doorlaatbaar monsters geïnfecteerd 6 uur met mCherry + wild-type of & #916; SIFA Salmonella voor 6 uur.
Figuur 4. Anti-calnexine (A) en anti-PDI (B) kleuring van ongeïnfecteerde BMDMs gepermeabiliseerde met digitonine en saponine. Schaalbalken 10 urn.
Figuur 5. Vertegenwoordiger beelden van een differentiële permeabilisatie test met Salmonella typhimurium wild-type en de ΔsifA mutante stam op 6 uur na infectie. Cytosolische Salmonella en totale Salmonella worden aangegeven. Cellen werden ofwel digitonine permeabel (A) of links unpermeabilized (B) vóór kleuring met FITC anti- Salmonella voor cytosolische Salmonella. Na deze kleuring stap cells werden gepermeabiliseerd met Saponine en totaal Salmonella werden gekleurd met anti-Salmonella antilichamen gevolgd door secundair antilichaam kleuring (rood). Schaalbalken 10 urn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Differential permeabilisatie is een eenvoudige en robuuste methode te analyseren en kwantificeren van de subcellulaire verdeling van de bacteriële ziekteverwekkers tussen vacuole compartimenten en het cytosol. Dezelfde test is met succes gebruikt bij bacteriën zoals Francisella novicida 2,4 en Shigella flexneri 12. Aangezien vele intracellulaire pathogenen wijzigen of de ontvangende structuren endomembrane wijzigen, de robuustheid van de digitonine permeabilisatie zal moeten worden bepaald op een individuele basis. Verfijning van de bepaling met betrekking tot het pathogeen of de cellijn kan noodzakelijk zijn. De assay is niet alleen beperkt tot infectiebiologie, maar kan ook worden gebruikt voor andere biologische toepassingen die cellen, zoals mobiele doodsignaleringscomplex 17,18.
De sleutel tot deze assay is dat het plasmamembraan en intracellulaire membraan een andere lipidensamenstelling in het bijzonder intracellulaire membranen bevatten minder cholesterol. Digitonine kunnen complexe cholesterol en aldus leidt tot permeabilisatie, de doelmatigheid en selectiviteit afhankelijk is van de duur van digitonine behandeling en de concentratie van het detergens differentiële. Bepalen hiervoor is het belangrijk om cellen permeabel te controleren door kleuring merker eiwitten met gedefinieerde intracellulaire lokalisatie, zoals de cytosolische staart van calnexin of ER luminale proteïne PDI.
Terwijl differentieel permeabilisatie is niet nieuw, dit protocol kan bovendien een snelle en objectieve kwantificatie van cytosolisch en vacuolaire bacteriën op basis van FACS. Voor FACS-analyse is het belangrijk om twee bedieningsorganen, die niet doorlaatbaar en volledig gepermeabiliseerde cellen omvatten. Op basis van deze controlemonsters de poorten voor de ongekleurd en volledig gebrandschilderde ie vacuole en cytosolische bacteriën wordt ingesteld.
Een kritische stap in het protocol is de permeabilisatie en de volgende wasstappen. Freshly bereide buffer en detergent oplossingen worden gebruikt. Alle oplossingen moeten bereiden net voor gebruik. Een ander kritisch punt is de timing van de permeabilisatie. Hier 1 minuut bij een digitonine concentratie van 50 ug / ml heeft bewezen goed te werken voor beenmerg afgeleide macrofagen. Bij gebruik van verschillende cellijnen, kan het werkconcentratie moet empirisch worden bepaald. Hoge concentraties van digitonine of incubatietijden meer dan 1 min kan leiden tot een permeabilisatie van interne membranen, en vals-positieve resultaten. Digitonine oplossingen zijn alleen stabiel gedurende 1-2 uur. Het voorbereiden van een verse oplossing van digitonine net voor is absoluut cruciaal. Ook het vermogen van digitonine voor permeabilze membranen variëren van partij tot partij en tussen leveranciers.
Dus als vele monsters behandeld moeten worden is het raadzaam deze splitsen in kleinere groepen die gemakkelijk en snel verwerkt. Tot slot alle stappen wassen na de permeabilization moet zeer zorgvuldig gebeuren aangezien de behandeling digitonine verzwakt celmembranen. Toevoeging van buffer en aspiratie moet voorzichtig aan de zijkant van de put en niet gedaan in het midden van de put.
Zoals opgemerkt, andere technieken om de subcellulaire verdeling van bacteriën tussen het cytosol en de vacuole compartimenten bestaan, zoals het gebruik van de b-lactamase splitsing analyseren FRET reporter CCF4 AM-19. Terwijl de CCF4-AM werkwijze het voordeel meten vacuolaire breuk in real-time, ontbreekt de resolutie in enkele bacterie niveau en kan alleen informatie over de interne gastheercel niveau. Aldus wordt een combinatie van beide testen is ideaal om informatie over het niveau van afzonderlijke bacteriën / gastheercellen tijd krijgen. Belangrijk is, kunnen beide assays worden gebruikt, niet alleen in de context van bacteriële infecties, maar ook in de context van andere celbiologische studies die gericht zijn op de subcellulaire lokalisatie van doel p bepalenroteins 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
We willen graag Mathias S. Dick, Roland F. Dreier en Sebastian Rühl erkennen voor discussie. Dit werk werd ondersteund door een SNSF lectoraat PP00P3_139120 / 1 en een universiteit van Basel projectsubsidie ID2153162 naar PB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digitonin | Sigma | D5628 | 50 μg/ml |
| PFA | mpbio | 219998380 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630 | |
| Potassium Acetate | Sigma | 791733 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| anti-Salmonella CSA-1-FITC | KPL | 01-91-99-MG | 1/500 |
| anti-Salmonella CSA-1 | KPL | 02-91-99-MG | 1/500 |
| anti-Calnexin | Enzo Lifesciences | SPA-860D | 1/100 |
| anti-PDI | Enzo Lifesciences | SPA-890 | 1/100 |
| Saponin | Sigma | 47036 | |
| Vectashield mounting medium | Vectorlabs | H-1200 | |
| Anti Rabbit antibody-488 | Molecular Probes | A-11070 | 1/500 |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15710-49 | 100 μg/ml and 10 μg/ml |
| Triton X-100 | Promega | H5141 | |
| PBS | Gibco | 20012-019 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| NEAA | Amimed | 5-13K00-H | |
| LSM700 Confocal microscope | Zeiss | imaging done at 63X | |
| FACS Fortessa | BD technologies | detection mCherry 610 nm | |
| FACS Fortessa | BD technologies | detection FITC 530 nm |
References
- Kumar, Y., Valdivia, R. H. Leading a sheltered life: intracellular pathogens and maintenance of vacuolar compartments. Cell Host Microbe. 5, 593-601 (2009).
- Chong, A., et al. The early phagosomal stage of Francisella tularensis determines optimal phagosomal escape and Francisella pathogenicity island protein expression. Infect Immun. 76, 5488-5499 (2008).
- Mellouk, N., et al. Shigella subverts the host recycling compartment to rupture its vacuole. Cell Host Microbe. 16, 517-530 (2014).
- Checroun, C., Wehrly, T. D., Fischer, E. R., Hayes, S. F., Celli, J. Autophagy-mediated reentry of Francisella tularensis into the endocytic compartment after cytoplasmic replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 14578-14583 (2006).
- Broz, P., Monack, D. M. Newly described pattern recognition receptors team up against intracellular pathogens. Nat Rev Immunol. 13, 551-565 (2013).
- Hagar, J. A., Powell, D. A., Aachoui, Y., Ernst, R. K., Miao, E. A. Cytoplasmic LPS activates caspase-11: implications in TLR4-independent endotoxic shock. Science. 341, 1250-1253 (2013).
- Ogawa, M., et al. Escape of intracellular Shigella from autophagy. Science. 307, 727-731 (2005).
- Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. Salmonellae interplay with host cells. Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).
- Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole. J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).
- Malik-Kale, P., Winfree, S., Steele-Mortimer, O. The bimodal lifestyle of intracellular Salmonella in epithelial cells: replication in the cytosol obscures defects in vacuolar replication. PLoS One. 7, e38732 (2012).
- Zhao, Y. O., Khaminets, A., Hunn, J. P., Howard, J. C. Disruption of the Toxoplasma gondii parasitophorous vacuole by IFNgamma-inducible immunity-related GTPases (IRG proteins) triggers necrotic cell death. PLoS Pathog. 5, e1000288 (2009).
- Meunier, E., et al. Caspase-11 activation requires lysis of pathogen-containing vacuoles by IFN-induced GTPases. Nature. 509, 366-370 (2014).
- Yamamoto, M., et al. A cluster of interferon-gamma-inducible p65 GTPases plays a critical role in host defense against Toxoplasma gondii. Immunity. 37, 302-313 (2012).
- Degrandi, D., et al. Murine guanylate binding protein 2 (mGBP2) controls Toxoplasma gondii replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 294-299 (2013).
- Mariathasan, S., et al. Differential activation of the inflammasome by caspase-1 adaptors ASC and Ipaf. Nature. 430, 213-218 (2004).
- Knodler, L. A., Nair, V., Steele-Mortimer, O. Quantitative assessment of cytosolic Salmonella in epithelial cells. PLoS One. 9, e84681 (2014).
- Ng, H., Smith, D. J., Nagley, P. Application of flow cytometry to determine differential redistribution of cytochrome c and Smac/DIABLO from mitochondria during cell death signaling. PLoS One. 7, e42298 (2012).
- Krawczyk, E., Suprynowicz, F. A., Sudarshan, S. R., Schlegel, R. Membrane orientation of the human papillomavirus type 16 E5 oncoprotein. J Virol. 84, 1696-1703 (2010).
- Keller, C., et al. Single cell measurements of vacuolar rupture caused by intracellular pathogens. J Vis Exp. , e50116 (2013).
