Abstract
세포 내 세균 병원체는 세포질 또는 전문 병원체 함유 액포 (PCVs)에 복제 할 수 있습니다. 세포질에 도달하기 위해, 시겔 flexneri 및 Francisella novicida 같은 박테리아는 phagosome의 파열을 유도 할 필요가있다. 대조적으로, 살모넬라 티피 무리 움 살모넬라 함유 액포 (SCV)라고도 액포 구획에 복제. 그러나 특정 살모넬라 돌연변이 SCV 무결성을 유지하는 데 실패함으로써 세포질로 방출된다. 세균의 하나의 레벨에 액포 박테리아 대 세포질의 비율은 phagosome 보호 분석법으로 알려진, 미분 투과성으로하여 측정 할 수있다. 접근 방식은 세제 디기 토닌의 재산의 사용이 선택적으로 콜레스테롤을 결합 할 수 있습니다. 세포막 다른 세포막 이상의 콜레스테롤을 포함하고 있으므로, 디기 토닌는 세포 막을 남기고 선택적으로 세포막을 Permeabilize 하시려면하는데 사용될 수있다그대로. 형광 마커 단백질 (예 중에서도 mCherry)를 발현하는 병원체 간략히, 다음의 감염, 숙주 세포의 세포막을 함유 디기 토닌 완충액으로 짧은 인큐베이션으로 투과성이있다. 세포를 세척하고 배양 한 다음 선택의 세균에 대해 유도 (원하는 형광 물질에 결합) 일차 항체 (예, 항 -FITC 살모넬라) 다시 세척한다. 도장이 박테리아가 사용되는 경우, 부가적인 단계가있는 모든 막을 투과 가능하며 모든 박테리아에는 해당 항체로 염색 할 수있다. 염색 후, 액포와 세균의 세포질 비율은 단일 또는 이중 양성 이벤트를 카운트하여 FACS 또는 현미경에 의해 정량화 될 수있다. 여기에서 우리는 박테리아 살모넬라 티피 무리 움이 기술의 사용을위한 실험적인 세부 사항을 제공합니다. 이 분석의 장점은 다른 분석 달리, 그것이 단일 bacte의 수준 정량을 제공한다는 것이다RIA, 현미경으로 분석 한 경우, 소정의 셀에서의 세포질과 액포 박테리아의 정확한 숫자를 제공한다.
Introduction
세균 세포 내 병원체를 직접 숙주 세포의 세포질 또는 전문 액포 구획 중 하나에 복제. 감염의 초기 단계에서 대부분의 병원균 (예 : 대 식세포) 또는 능동적으로 비 식세포로 자신의 흡수를 촉진하여 전문화 된 세포에 의한 식균 작용에 의해 내재화를 얻는다. 식세포에서 phagosome 정상적으로 포식 입자 소화 degradative 구획을 형성 리소좀과 융합한다. 이러한 Francisella novicida 또는 시겔 flexneri 같은 전문 세포질 박테리아는 phagosome의 파열을 유도하여 phagosomal 저하를 탈출 이후 세포질 2,3로 탈출. 이는 액포 파열 2-4을 촉진 이펙터 단백질을 주입 Francisella 병원성 섬 (FPI) 또는 시겔 flexneri T3SS, 같은 독성 관련 메커니즘을 필요로한다. 숙주 세포의 세포질 기능일반적 병원체의 존재를 인식하고 5 시그널링 선천성 면역을 유도 보존 패턴 인식 수용체의 수. 또한 xenophagy, 자식 작용의 항균 형태 세포질을 입력 세균을 저하 할 수있다. 박테리아 세포질 통상 잘 무딘 또는 다른 전략을 사용하여이 반응을 회피하도록 구성되어있다. 예를 들어, Francisella 호스트 인식을 피하기 위해 LPS를 수정하고 시겔은 분비 이펙터 단백질 6,7를 사용하여 자식 작용 모집을 방지 할 수 있습니다.
리소좀 저하를 탈출하는 또 다른 전략 모델 액포 병원체 살모넬라 엔테 혈청 형 티피 뮤 리움에 의해 고용되어, 그 후 살모넬라 티피 무리 움라고도합니다. 살모넬라 균은 세포 내 틈새 시장에 초기 phagosome 개조 이펙터를 주입하는 T3SS를 사용, 살모넬라 공포 (SCV) 함유 8,9. 호스트 경로의 연속 조작이다필요는 공포에 지질 및 기타 영양소를 보충하여이 공포를 유지합니다. 실제로, 살모넬라 SIFA 돌연변이 액포 안정성을 유지하는 데 실패하고 선천성 면역 경로와 자식 작용 모집 (8)의 활성화를 초래 감염 후 시간 이내에 숙주 세포의 세포질을 입력한다. 살모넬라 공포 성 탈출 연구하다 세포 유형에 따라 다양하고, 여러 가지보고 상피 세포에서도 WT 살모넬라 세포질 10 SCV 및 hyperreplicate 벗어날 수 있다는 것을 보여 주었다. 최근 보고서는 액포 병원균의 선천성 면역 검출도 인식하고 병원체 함유 액포 (PCVs) 11 ~ 14를 불안정하게 할 수있는 호스트의 능력에 달려 있음을 보여준다.
호스트 또는 박테리아 모두 유전자형 액포와 세포질 구획 사이의 세포 내 박테리아의 분포에 영향을 미칠 수 있음을 감안할 때, 그것은 액포 대들의 수를 정량화하는 것이 필요하다세포질 박테리아. , 이후 가장 실험 셋업에서 숙주 세포는 다른 세포 내 구획에서 여러 박테리아를 가질수이어서 하나 이상의 박테리아로 감염되고, 기술은 단일 박테리아의 수준을 정량화 허용하는 필요하다. (또한 phagosomal 보호 분석라고도 함) 차동 투과성으로는이 해상도 2,4,10,12를 제공합니다. 분석은 그대로 액포 막 잎 세제 디기 토닌와 숙주 세포 혈장 막의 선택적 투과성으로 기반으로하며, 따라서 항체의 선택적 박테리아 세포질 염색을 허용한다. 여기에서 우리는 차동 투과성으로를 사용하여 세포질과 액포 살모넬라 균의 정량이 프로토콜을 제공합니다. 이 방법의 원리는 그림 1에 설명되어 있습니다 : 골수 유래 대 식세포 (BMDMs)은 정지상이 살모넬라 균을 mCherry 발현에 감염된다. 고정상 살모넬라 균은 T가 필요그들이 활성 그렇지 NLRC4의 inflammasome을 인식하고 BMDMs 15의 신속한 세포 사멸 (pyroptosis)를 유도 할 것이다 T3SS SPI-1의 발현을 하향 조절하기 때문에 O 사용될. 세포를 세척하고 1 분간의 디기 토닌를 50㎍ / ㎖로 처리하여 감염에 이어. 세포를 다시 세척하고, 즉시 세포질에 접근 박테리아 마크 FITC 결합 항 살모넬라 항체와 함께 배양한다. 단계의 세포가 용해되어 추가 세척 및 mCherry + (액포)과 FITC + / mCherry + (세포질) 박테리아의 비율 후 FACS에 의해 결정된다. 우리는 또한 더 형광 단백질 발현 균주를 사용할 수는 (그림 2)없는 경우에 사용할 수있는이 방법의 적응을보고합니다. 추가 단계는 세포 투과성이 완전히 고정되는 FITC 표지 후에 도입된다. 그 후 모든 박테리아는 항 살모넬라 항체 및 해당 이차 항체로 염색된다. DETection은 다음 대신 FACS 분석의 현미경으로 이루어집니다.
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Protocol
살모넬라 균을 mCherry가 발현 1. 디기 토닌 분석 (분석 FACS 기반)
- 준비 박테리아
주 : 플라스미드 (PFPV가 rpsM 프로모터하에 mCherry을 코딩)에서 mCherry 발현 살모넬라 야생형 SL1344은 (스트렙토 마이신 내성)이 분석에 사용된다. mCherry의 구성 적 발현에 의해 변경되지 세균 증식 식세포 16 (데이터는 보이지 않음).- 37 ° CO / N에서 통에 스트렙토 마이신 (90 μg의 / ㎖) 및 암피실린 (100 ㎍ / ml의 mCherry 발현 벡터)와 보충 LB 배지 3 ㎖에 감염되기 전에 변형 일일 접종.
- 감염 세포를 도금.
- 1.25 × 105 세포의 밀도로 24 웰 플레이트에 시드 야생형 BMDMs / 웰 주 식세포 배지 1 ㎖에가 (DMEM은 10 % 태아 송아지 혈청 (FCS, 열 - 불 활성화 된 56 ° C, 30 분간으로 보충 ), 1 % HEPES, 1 % 비 필수 아미노산 (NEAA), 1 % L 글루타민, 10 % L929 상등액 (대 식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF로부터의 조정 배지) L929 세포를 제조). 표 1에 따른 종자 우물은 개별 조건을 설명합니다. 컨트롤 (표 1)로 사용 된 우물로 된 커버를 추가합니다.
- 37 ℃ 배양기에서 밤새 인큐베이션하고 세포를 5 % CO 2.
| 투과성으로 | 염색 | ||||||
| 유리 커버 슬립 | 살모넬라 | 디기 토닌 | 사포닌 | 안티 살모넬라 | 안티 Calnexin | 안티 PDI | |
| A1 (샘플) | - / + * | + | + | + | |||
| A2 (샘플) | - / + * | + + | + | ||||
| A3 (샘플) | - / + * | + | + | + | |||
| A4 (NO 투과성으로 제어) | - / + * | + | + | ||||
| A5 (완전 투과성으로 제어) | - / + * | + | + | + | |||
| B1 (calnexin에 대한 염색) | + | + | |||||
| B2 (calnexin에 대한 염색) | + | + | + | ||||
| B3 (calnexin에 대한 염색) | + | + | + | ||||
| C1 (스테인드) PDI에 대한 | + | + | |||||
| C2 (PDI에 대한 염색) | + | + | + | ||||
| C3 (PDI에 대한 염색) | + | + | + | ||||
표 1 : 살모넬라, 투과성으로하고, 염색과 이후의 감염 24 웰 형식의 골수 유래 대 식세포 (BMDMs)에 대한 도금 방식 * 프로토콜 1 프로토콜이 완료되어 있는지 여부에 따라 다릅니다..
- 감염 박테리아를 준비.
- 다음날, PBS에 문화 1:10 희석 PBS 만 제어에 대한 외경 (600)를 측정하여 하룻밤 문화에 살모넬라 균의 농도를 결정한다. 이것은 OD 600 리터로 측정되는 것을 보장분광 광도계의 inear 범위.
- ml의 당 살모넬라 균의 농도를 계산한다. 하나의 OD600은 1 × 109 박테리아에 대응한다.
- 1.25 × 106 세포 / ㎖의 살모넬라의 농도에 도달 할 식세포 배지에서 세균을 희석.
- 살모넬라 균과 세포의 감염.
- BMDMs에서 매체를 제거합니다. 감염되지 않은 제어 우물 (B1-B3, C1-C3)에 대 식세포 매체의 1 ML을 추가합니다. 웰스 A1에 살모넬라 균 현탁액 1 ML을 추가 - A5는 셀 당 10 세균의 감염 (MOI)의 다양성에 도달 할 수 있습니다.
- 감염을 동기화하기 위해 37 ° C에서 300 XG에 15 분 동안 플레이트를 원심 분리기. 37 ℃ 배양기에서 플레이트를 이동시켜, 5 % CO 2.
- 겐타 마이신과 세포 외 살모넬라 균을 죽이는.
- 1 시간 후 감염에, 인큐베이터에서 접시를 제거하고 0.1 ㎎ / ㎖ 젠타 마이신을 포함하는 대 식세포 매체의 0.1 ml에 추가세포 외 박테리아를 죽일. 모든 셀들이 동일한 방식으로 처리되도록, 짝수 비감염 컨트롤에, 모든 웰에 추가 젠타 마이신. 37 ℃ 배양기에서 플레이트를 이동시켜, 5 % CO 2.
- 세포를 세척.
- 2 시간 게시물 감염에서 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 모든 우물 일반 DMEM의 1 ml의 2 배 세척 (미리 예열 37 ° C까지)와 대 식세포 매체로 교체 10 ㎍ / ml에 포함 (37 ° C로 미리 예열) 겐타 마이신은 남아있는 세포 외 박테리아의 성장을 방지합니다. 37 ℃ 배양기에서 플레이트를 이동시켜, 5 % CO 2.
- 세제 및 항체와 신선한 버퍼를 준비.
- 다만 분석 원하는 시점 전에 1 밀리그램 / KHM 완충액 ㎖ (110 mM의 아세트산 칼륨, 20 mM의 HEPES, 2 mM의의 MgCl 2, 7.3의 pH)에서의 디기 토닌 신선한 스톡 용액을 제조 하였다. 작업 농도 버퍼 주식을 필터와 KHM에 희석50 μg의 디기 토닌 / ㎖의. 또한, 버퍼 KHM, KHM에서 1/100에서 1/100 또는 항 PDI에서 1/500, 안티 calnexin에 FITC (CSA-1-FITC)에 커플 항 살모넬라 항체 0.1 % 사포닌 용액을 조제 버퍼는 3 % BSA로 보충.
- 세포 투과성으로.
- 인큐베이터에서 접시를 제거하고 세척 우물은 KHM 버퍼의 0.5 ㎖로 (37 ° C로 미리 예열) 배. A3 우물의 A5과 B3에 사포닌과 B2 / C2 또는 KHM 버퍼 / C3 (표 1에 따라) - KHM 버퍼를 제거하고 웰스 (A1)에 디기 토닌과 우물 A4와 B1 / C1, KHM 버퍼에 0.25 ㎖의 일반 KHM 버퍼를 추가합니다. 모든 우물이 KHM 버퍼의 0.5 ㎖로 3 배 씻어 즉시 실온에서 정확히 1 분 동안 품어 (37 ° C로 미리 예열).
- 차 항체 염색.
- 적절한 우물에 차 항체 솔루션 (염소 항 살모넬라 -FITC, 250 μL / 웰, 0.1 μg의 / ㎖) KHM 버퍼를 제거하고 추가 (그림 1 표 1). 37 ℃ 배양기에서 15 분 동안 플레이트를 인큐베이션, 5 % CO 2.
- 1 mL의 PBS로 1X 세포를 씻으십시오.
- 감염된 세포 (웰스 A1 - A5) : FACS 분석
- 워시 세포는 PBS로 3 배 및 0.1 % 트리톤을 포함하는 얼음처럼 차가운 PBS 0.5 mL를 넣어. 세포 집합체를 헤어 셀 스트레이너 캡 5 ㎖ 외과 튜브에 전송합니다. 얼음에 샘플을 유지합니다.
- 외과의 샘플을 분석 할 수 있습니다. 완전히 투과성이 컨트롤을 사용하여, 총 순방향 기반 박테리아 제 및 측면 산란 (FSC / SSC)를위한 게이트를 설정하고 mCherry 신호 (610 ± 20 nm의 나노 필터).
- 다음, 세포질 박테리아 게이트 (FITC + mCherry +)와 액포 박테리아 (FITC-, mCherry +) (그림 3)을 설정하기 위해 충분히 투과성이 아닌 투과성이 컨트롤을 사용하여 총 세균 집단의 FITC 신호를 분석 할 수 있습니다.
- 게이트 설정으로, 시료를 분석 및 대 세포질의 비율을 결정제조사의 프로토콜에 따라 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 액포 박테리아.
- 감염되지 않은 투과성으로 컨트롤 (우물 B1 - B3, C1 - C3) : 현미경
- 정착
- PBS를 제거하고 PBS에 PFA 4 %의 250 μl를 추가합니다. 37 ℃에서 10 분 동안 품어.
- 우물은 1 ml의 PBS로 2 배 세척 및 정착을 해소하기 위해 10 분 동안 PBS 0.1 M 글리신의 250 μl를 추가합니다. 워시 웰 PBS 1 ㎖로 2 배.
- 이차 항체 염색.
- PBS에 적합한 형광 물질에 결합 이차 항체와 함께 1 시간 동안 실온에서 얼룩 투과성으로 컨트롤 사포닌 0.1 % 3 % BSA 완전히 Permeabilize 하시려면 세포로 보충.
- 워시는 1 ml의 PBS로 3 배를 커버 슬립과 DAPI (1.5 μg의 / ml)로 매체를 장착에서 분석 된 커버를 탑재합니다.
- 현미경 분석.
- 공 초점 FLUO을 사용하여 40X 또는 63X 배율에서 컨트롤 된 커버 분석rescence 현미경. 투과성으로 일한 경우, digitonin- 사포닌 투과성이 세포와 PDI는 사포닌 투과성이 세포 (그림 4) 만 염색 모두에 대한 비 투과성이 세포 염색, Calnexin 염색이 없어야합니다.
- 정착
레이블이없는 살모넬라 (현미경 기반 분석) 2. 디기 토닌 분석
- O / N 문화에 대한 박테리아를 준비합니다.
- 레이블이없는 살모넬라 야생형 SL1344 접종 (스트렙토 마이신 내성) 37 ° CO / N에서 통에 스트렙토 마이신 (90 ㎕ / ml)이 첨가 된 LB 배지 3 ㎖에 감염 1 일 전.
- 감염 세포를 도금.
- 1.25 × 105 세포의 밀도로 멸균 된 유리 커버 슬립을 함유하는 24 웰 플레이트에 시드 BMDMs / 웰 식세포 배지 1 ㎖ (DMEM은 10 % 태아 송아지 혈청 (FCS와 디 보완, 56 ° C를 보충에,30 분), 1 % HEPES, 1 % L 비 필수 아미노산 (NEAA), 1 % L- 글루타민 및 10 % 상등액 L929). 표 1에 따른 종자 우물은 개별 조건을 설명합니다.
- 37 ℃ 세포 배양기에서 O / N을 부화 및 5 % CO 2.
- 감염 박테리아를 준비.
- 다음날, PBS에 문화 1:10 희석 PBS 만 제어에 대한 외경 (600)를 측정하여 O / N 문화에서 살모넬라 균의 농도를 결정한다. 이것은 OD 600 분광 광도계의 선형 범위에서 측정되는 것을 보장한다.
- 밀리리터 당 살모넬라 균의 농도를 결정합니다. (1)의 OD (600)는 1 × 109 박테리아에 대응한다.
- 1.25 × 106 세포 / ㎖의 살모넬라의 농도에 도달 할 식세포 배지에서 세균을 희석.
- 살모넬라 균과 세포의 감염.
- 감염을 동기화하기 위해 37 ° C에서 300 XG에 15 분 동안 플레이트를 원심 분리기. 37 ℃ 배양기에서 플레이트를 이동시켜, 5 % CO 2.
- 겐타 마이신 외 살모넬라 균을 죽이는.
- 1 시간 후 감염에, 인큐베이터에서 접시를 제거하고 모든 우물에 세포 외 박테리아를 죽일 1 ㎎ / ㎖ 겐타 마이신을 포함하는 대 식세포 매체의 0.1 ml를 추가합니다. 37 ℃ 배양기에서 플레이트를 이동시켜, 5 % CO 2.
- 세포를 세척.
- 2 시간 게시물 감염에서 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 10 μg의 / ㎖를 포함하는 신선한 식세포 매체의 1 ml의 각 웰 배를 씻어 방지하기 위해 겐타 마이신남아있는 세포 외 박테리아의 성장. 37 ℃ 배양기에서 플레이트를 이동시켜, 5 % CO 2.
- 세제 및 항체와 신선한 버퍼를 준비.
- 다만 분석 원하는 시점 전에 1 밀리그램 / KHM 완충액 ㎖ (110 mM의 아세트산 칼륨, 20 mM의 HEPES, 2 mM의의 MgCl 2, 7.3의 pH)에서의 디기 토닌 신선한 스톡 용액을 제조 하였다. 주식 필터 및 50 μg의 / ㎖의 작업 농도 KHM 버퍼에 희석 디기 토닌의.
- 또한, KHM 완충액 0.1 % 사포닌 용액을 준비 살모넬라 항 -FITC (CSA-1는 0.1㎍ / ㎖) KHM 완충액 1/100에서 1/100 또는 항 PDI에서 안티 calnexin이 보충 된 3 % BSA (항체 농도 재료 표 참조).
- 세포 투과성으로.
- 인큐베이터에서 접시를 제거하고 세척 우물은 KHM 버퍼의 0.5 ㎖로 (37 ° C로 미리 예열) 배. KHM 버퍼를 제거하고 0.25 ㎖의 일반 KHM 버퍼를 추가웰스 A1에 디기 토닌과 우물 A4와 B1 / C1, KHM 버퍼 - A3 및 B2 / 사포닌과 C2 또는 KHM 버퍼 웰스 A5과 B3에 / C3 (표 1 항). 모든 우물이 KHM 버퍼의 0.5 ㎖로 3 배 씻어 즉시 실온에서 정확히 1 분 동안 품어 (37 ° C로 미리 예열).
- 차 항체 염색.
- KHM 버퍼를 제거하고 적절한 우물 (그림 2, 표 1)에 차 항체 솔루션 (염소 항 살모넬라 CSA1-FITC, 250 μL / 웰, 0.1 μg의 / ㎖)를 추가합니다. 37 ℃ 배양기에서 15 분 동안 플레이트를 인큐베이션, 5 % CO 2. 1 ml의 PBS로 세척 배.
- 고정.
- PBS를 제거하고 PBS에 PFA 4 %의 250 μl를 추가합니다. 37 ℃에서 10 분 동안 품어.
- 우물은 1 ml의 PBS로 2 배 세척 및 정착을 해소하기 위해 10 분 동안 PBS 0.1 M 글리신의 250 μl를 추가합니다. 워시 웰 PBS 1 ㎖로 2 배.
- 합계감염된 샘플의 살모넬라 균 염색.
- 물로 0.1 % 사포닌 / 3 % BSA와 함께 PBS와 배를 커버 슬립 및 안티 CSA1 항체 샘플 배양을 1 시간 동안 (염소 항 CSA1는 0.1 ㎍ / ml의 마우스 항 - LPS는 0.1 μg의 / ㎖으로 잘 작동) 사포닌 0.1 % / 3 % BSA와 함께 PBS에서 RT에서.
- 0.1 % 사포닌 / 3 % BSA와 PBS에 세척 배. 어둠 속에서 실온에서 30 분 동안 0.1 % 사포닌 / 3 % BSA와 PBS에 선택의 형광에 결합 된 보조 항 염소 항체로 샘플을 품어.
- 워시는 1 ml의 PBS로 3 배를 커버 슬립과 DAPI (1.5 μg의 / ml)로 매체를 장착에서 분석 된 커버를 탑재합니다.
- 현미경 분석.
- 세포질 살모넬라 (양의 항 살모넬라 -FITC) 총 살모넬라 (더블 플러스) (그림 5)를 계산하여 공 초점 현미경으로 데이터를 수집. 투과성으로 컨트롤을 보여해야합니다 비 투과성이 세포 Calnexin들에 대한 염색을디기 토닌 - 투과성이 세포와 사포닌 투과성이 세포 PDI 염색에 대한 이닝 (그림 4). 웰스 A4와 A5는 살모넬라 오염에 대한 내부 통제를 제공합니다.
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Representative Results
도 1 및도 2는도 1 및 프로토콜이 프로토콜은 프로토콜의 중요한 단계 및 수득 한 결과를 나타내는 디기 토닌에 기재된 분석법의 회로도를 도시한다. 3 FACS 전형적인 결과를 나타낸다. 긍정적이고 부정적인 컨트롤은 mCherry + / FITC- 박테리아 (액포 살모넬라) 및 mCherry + / FITC + 박테리아 (세포질 살모넬라 균)의 게이트를 설정하는 데 사용됩니다. 이들 게이트에 근거 세포질과 액포 세균의 비율은 실험 샘플에서 결정될 수있다. 이 예에서 우리는 야생 형 및 ΔsifA 살모넬라 균을 비교했다. 그림 3은 mCherry + 살모넬라 티피 무리 움 야생형 및 골수 유래 쥐의 대 식세포에 ΔsifA 돌연변이로 얻은 대표적인 데이터를 보여줍니다. 그림 4는 일반적인 Calnexin (A)와 PDI를 보여줍니다 (B) 투과성으로 컨트롤 T에서 얻어진 염색디기 토닌 또는 사포닌과 reated. Calnexin는 ER 세포막 단백질이므로 Calnexin 염색 세포질 전반과 digitonin- 사포닌 투과성이 세포 모두에서 핵 주위에 알 수있다. 디기 토닌에서 사포닌 투과성이 세포에서 관찰 할 수있다 염색하는 동안 더 PDI 염색 (루멘 ER)이, 보이지 컨트롤을 투과성이. 그림 5a는 디기 토닌과 투과성이 된 세포에서 항 살모넬라 균 염색 결과를 보여줍니다. 세포질 박테리아 (항 살모넬라 -FITC 염색) 녹색에있는 동안 총 박테리아는 빨간색에 있습니다. FITC 음성 인구가 공포 (SCV)를 함유 그대로 살모넬라 균에 거주하고 따라서 살모넬라 -FITC 라벨으로부터 보호하고 세균 동안 인구 FITC 양성은 세포질에 액세스 할 수있는 살모넬라 균이다. 우리는 또한 ΔsifA 돌연변이 균주에 야생형 살모넬라 균을 비교했다. SIFA이 필요하기 때문에 살모넬라 균은 S를 유지하기 위해이력서 무결성은 살모넬라 균의 증가 비율은 세포질입니다. 도 5b에서는 세포 살모넬라 항 -FITC를 추가하기 전에 투과성이 디기 토닌되지 않은되는 제어를 나타낸다. 따라서, 어떠한 FITC 양성균 볼 수 없다.
그대로 액포 또는 세포질에 하나 mCherry 양성 살모넬라 균을 포함하는 프로토콜 1. 감염된 세포의 그림 1. 도식 표현은 차등 디기 토닌과 투과성이있다. 세포질 살모넬라는 FITC 결합 항 살모넬라으로 염색된다. 세포를 세척하고, FACS 분석에 트리톤 X-100으로 용해된다. 양성 대조군 세포는 완전 항체 염색 전에 투과성이있는 동안 음성 대조군 세포 투과성이 아니다.
그대로 액포 또는 세포질에 어느 레이블이없는 살모넬라 균을 포함하는 프로토콜 2. 감염된 세포의 그림 2. 도식 표현은 차등 디기 토닌과 투과성이있다. 세포질 살모넬라는 FITC 결합 항 살모넬라으로 염색된다. 세포를 세척하고 4 % PFA로 고정되어 있습니다. 세포는 완전히 FITC + / Alexa568 + 살모넬라 (세포질) 및 Alexa568 + 살모넬라 (액포)을 계산하는 데 사용됩니다 permeabilzed 알렉사 (568) 현미경에 연결된 보조 항체로 염색 한 다음 항 살모넬라 항체로 염색된다.
완전히 투과성이, unpermeabilized 또는 차등 투과성이 샘플 그림 3. FACS 분석은 mCherry + 야생형 또는 & # 6 시간 동안 감염916 6 시간 동안 SIFA 살모넬라 균.
그림 4. 안티 Calnexin (A)와 감염되지 않은 BMDMs의 안티 PDI (B) 염색 디기 토닌 또는 사포닌과 투과성이. 스케일 바 10 μm의.
도 6 시간에서의 살모넬라 티피 무리 움 야생형과 ΔsifA 변이주와 차동 투과성으로 분석 5. 대표적인 이미지 감염 후. 세포질 살모넬라 총 살모넬라 나타낸다. 세포는 있었다 중 세포질 살모넬라에 대한 항 살모넬라 -FITC 염색 전에 디기 토닌 투과성이 (A) 또는 왼쪽 unpermeabilized (B). 이 염색 단계, C 후ELL 학생은 사포닌과 투과성이되었고, 총 살모넬라는 이차 항체 염색 (적색) 다음 항 살모넬라 항체로 염색 하였다. 규모는 10 μm의 바.
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Discussion
차동 투과성으로 분석하고 액포 구획과 세포질 사이의 세균성 병원균의 세포 내 분포를 정량화 할 수있는 쉽고 강력한 방법입니다. 같은 분석은 Francisella novicida 2,4와 시겔 flexneri (12) 박테리아에 성공적으로 사용되어왔다. 많은 세포 내 병원체 변경하거나 호스트 endomembrane 구조를 수정하기 때문에, 디기 토닌의 투과성으로의 견고성은 개별적으로 결정되어야 할 것이다. 해야 할 수 있습니다 사용되는 병원체 또는 셀 라인에 측면에서 분석의 미세 조정. 분석은 단지 감염 생물에 한정되지 않고, 또한 세포 사멸이 17,18 시그널링 같은 다른 세포 생물학적 응용에 사용될 수있다.
이 분석의 핵심은 특정 세포 내 세포막 덜 CHO를 포함에서 세포막과 세포 막은, 다른 지질 조성물을 가지고있다lesterol. 디기 토닌 복잡한 콜레스테롤 따라서 리드 투과성으로, 디기 토닌 치료의 길이 및 세제의 농도에 의존하는 효율성 및 선택성을 차동있다. 이를 위해 제어하려면 그러한 calnexin의 세포질 꼬리 또는 응급실 내강 단백질 PDI로 정의 세포 내 현지화와 마커 단백질에 대한 염색하여 투과성이 세포를 확인하는 것이 중요합니다.
차동 투과성으로 새로운 것은 아니지만,이 프로토콜은 추가 FACS를 기반으로 세포질과 액포 세균의 신속하고 객관적인 정량화 할 수 있습니다. FACS 분석을 위해 그것은 비 투과성이 완전히 세포 투과성이 두 제어를 포함하는 것이 중요하다. 흠 완전히 스테인드 즉 액포 및 세포질 박테리아 게이트가 설정됩니다 이러한 제어 샘플을 기준으로합니다.
프로토콜의 중요한 단계는 투과성으로하고 후속 세척 단계이다. FReshly 준비된 버퍼 세제 용액이 사용되어야한다. 모든 솔루션은 사용하기 전에 준비해야한다. 또 다른 중요한 점은 투과성으로의 타이밍이다. 여기에 / ml의 골수 유래 대 식세포 잘 작동하는 50 μg의의 디기 토닌의 농도에서 1 분을 입증했다. 상이한 세포주를 사용하는 경우, 작업 농도는 실험적으로 결정되어야 할 필요가있을 수 있습니다. 1 분 이상 디기 토닌 또는 배양 배의 높은 농도는 내부 막, 거짓 긍정적 인 결과 투과성으로 이어질 수 있습니다. 2 시간 - 디기 토닌 솔루션은 1 만 안정적이다. 직전 디기 토닌의 새로운 솔루션을 준비하는 것은 절대적으로 중요합니다. 또한 디기 토닌의 용량은 막을 배치에서 배치 및 다른 공급 업체에 따라 다를 수 있습니다 permeabilze합니다.
많은 샘플을 처리해야하는 경우에 따라서는 쉽고 빠르게 처리 할 수있는 작은 그룹으로 이들를 분할하는 것이 좋습니다. 파마 후 마지막으로, 모든 세척 단계디기 토닌 치료가 세포막을 약화 때문에 eabilization는 매우 신중하게 할 필요가있다. 완충액의 첨가는 흡인 웰의 중앙에 부드럽게 웰의 측면이 아닌 수행되어야한다.
지적한 바와 같이, 다른 기술은 기자 CCF4 - 오전 19 FRET 세포질 및 B-lactamase를 절단의 사용으로 액포 구획 존재 사이의 박테리아의 세포 내 분포를 분석합니다. CCF4-AM 방식이 실시간으로 액포 파열을 측정하는 장점을 제공하지만, 그것은 하나의 박테리아 수준의 해상도가 부족하고 단지 하나의 숙주 세포 수준에 대한 정보를 제공 할 수있다. 따라서 둘의 결합 검정법은 시간이 지남에 따라 단일 박테리아 / 숙주 세포의 수준에 대한 정보를 얻기 위해 이상적이다. 중요한 두 분석은 세균 감염의 맥락에서뿐만 아니라, 대상 (P)의 서브 셀룰러 현지화를 결정하는 것을 목표로 다른 세포 생물학 연구의 맥락에서뿐만 아니라 사용될 수있다18 roteins.
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Acknowledgments
우리는 토론 마티아스 S. 딕, 롤랜드 F. DREIER과 세바스찬 RUHL을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 SNSF 교수 PP00P3_139120 / 1 PB에 대학 바젤의 프로젝트 보조금 ID2153162에 의해 지원되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digitonin | Sigma | D5628 | 50 μg/ml |
| PFA | mpbio | 219998380 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630 | |
| Potassium Acetate | Sigma | 791733 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| anti-Salmonella CSA-1-FITC | KPL | 01-91-99-MG | 1/500 |
| anti-Salmonella CSA-1 | KPL | 02-91-99-MG | 1/500 |
| anti-Calnexin | Enzo Lifesciences | SPA-860D | 1/100 |
| anti-PDI | Enzo Lifesciences | SPA-890 | 1/100 |
| Saponin | Sigma | 47036 | |
| Vectashield mounting medium | Vectorlabs | H-1200 | |
| Anti Rabbit antibody-488 | Molecular Probes | A-11070 | 1/500 |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15710-49 | 100 μg/ml and 10 μg/ml |
| Triton X-100 | Promega | H5141 | |
| PBS | Gibco | 20012-019 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| NEAA | Amimed | 5-13K00-H | |
| LSM700 Confocal microscope | Zeiss | imaging done at 63X | |
| FACS Fortessa | BD technologies | detection mCherry 610 nm | |
| FACS Fortessa | BD technologies | detection FITC 530 nm |
References
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