Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

כימות של Cytosolic לעומת vacuolar Published: July 28, 2015 doi: 10.3791/52960
Automatic Translation
1, 1
1Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel

Abstract

חיידקים פתוגנים תאיים יכול לשכפל בcytosol או בvacuoles מיוחד המכיל הפתוגן (PCVs). כדי להגיע cytosol, חיידקים כמו Shigella flexneri וFrancisella novicida צריכים לגרום לקרע של phagosome. לעומת זאת, typhimurium סלמונלה משכפל בתא vacuolar, הידוע בשם vacuole סלמונלה המכיל (SCV). מוטציות עם זאת מסוימות של סלמונלה להיכשל כדי לשמור על שלמות SCV ומשתחררים כך לתוך cytosol. אחוז cytosolic לעומת חיידקי vacuolar על הרמה של חיידקים בודדים ניתן למדוד על ידי permeabilization ההפרש, הידוע גם בassay phagosome-ההגנה. הגישה עושה שימוש ברכוש של digitonin חומר הניקוי כדי לאגד כולסטרול באופן סלקטיבי. מאז קרום הפלזמה מכיל יותר כולסטרול מאשר קרומים תאיים אחרים, digitonin יכול לשמש כדי permeabilize סלקטיבי קרום הפלזמה תוך השארת קרומים תאייםבשלמותה. בזיהום קצר, הבא עם הפתוגן לבטא חלבון סמן פלואורסצנטי (למשל mCherry בין השאר), קרום הפלזמה של תאי מארח permeabilized עם דגירה קצרה בdigitonin מכילה מאגר. לאחר מכן תאים נשטפים וטופחו עם נוגדן ראשוני (מצמידים את fluorophore בחירה) המכוון נגד החיידק של בחירה (למשל אנטי סלמונלה -FITC) ושטפו שוב. אם חיידקים לא מסומנים משמשים, ניתן לעשות צעד נוסף, שבו כולם קרומי permeabilized וכל החיידקים מוכתמים עם נוגדן מקביל. בעקבות הצביעה, אחוז חיידקי vacuolar וcytosolic ניתן לכמת על ידי FACS או במיקרוסקופ על ידי ספירת אירועים חד או דו-חיוביים. כאן אנו מספקים פרטים ניסיוניים לשימוש בטכניקה זו עם typhimurium סלמונלה החיידק. היתרון של assay זה הוא כי, בניגוד לassay האחר, היא מספקת כימות ברמה של bacte אחתריה, ואם נותח על ידי מיקרוסקופ מספק את המספר המדויק של cytosolic וחיידקים vacuolar בתא נתון.

Introduction

חיידקים פתוגנים תאיים לשכפל באופן ישיר בcytosol התא המארח, או בתאי vacuolar מיוחדים 1. בשלב הראשוני של הזיהום ביותר פתוגנים לקבל הפנימו או על ידי phagocytosis על ידי תאים מיוחדים (כגון מקרופאגים) או על ידי פעיל בקידום הספיגה שלהם לתאים שאינם phagocytic. בתאי phagocytic, phagosome בדרך כלל משלב עם lysosomes כדי ליצור תא נגרע, שבו חלקיקי phagocytosed מתעכלים. חיידקי cytosolic מיוחדים, כגון Francisella novicida או Shigella flexneri, לברוח השפלה phagosomal ידי גרימת הקרע של phagosome ולאחר מכן לברוח ל2,3 cytosol. זה דורש מנגנון הקשורים ארסי כגון פתוגניות אי Francisella (FPI) או Shigella flexneri T3SS, שמזריק חלבוני מפעיל המקדמים קרע vacuolar 2-4. תכונות cytosol התא המארחמספר הקולטנים זיהוי תבניות נשמרים, כי בדרך כלל לזהות את הנוכחות של פתוגנים ולגרום לחיסון מולדים איתות 5. בנוסף, xenophagy, צורה אנטי-מיקרוביאלי של autophagy יכולה לבזות חיידקים שנכנסים cytosol. חיידקי cytosolic בדרך כלל גם מותאמים ללהקהות או לעקוף תגובות אלה באמצעות אסטרטגיות שונות. לדוגמא, Francisella משנה LPS כדי להימנע מהכרת המארח וShigella מונע גיוס autophagy באמצעות חלבונים מופרשים מפעיל 6,7.

אסטרטגיה נוספת לברוח השפלה lysosomal מועסקת על ידי Typhimurium serovar enterica הפתוגן vacuolar המודל סלמונלה, התייחס לאחר מכן כלtyphimurium סלמונלה. סלמונלה משתמשת T3SS להזריק effectors שלשפץ phagosome הראשוני לנישה תאית שלה, סלמונלה המכיל vacuole (SCV) 8,9. מניפולציה מתמשכת של מסלולי מארח היאנחוץ כדי לשמור על vacuole זאת על ידי גיוס שומנים וחומרים מזינים אחרים לvacuole. ואכן, מוטציה SIFA של סלמונלה לא מצליחה לשמור על יציבות vacuolar, ונכנסה cytosol של תאי מארח בתוך שעות לאחר הדבקה, וכתוצאה מכך ההפעלה של מסלולי חיסון מולדים וגיוס autophagy 8. בריחת vacuolar של סלמונלה משתנה בהתאם לסוג התא שהוא לימודים, וכמה מחקרים הראו כי בתאי אפיתל אפילו WT סלמונלה יכולה לברוח SCV וhyperreplicate בcytosol 10. הדיווחים אחרונים מראים כי זיהוי חיסון מולדים של פתוגנים vacuolar גם תלוי ביכולת של המארח להכיר ולערער vacuoles המכיל הפתוגן (PCVs) 11-14.

בהתחשב בכך ששניהם המארח או חיידקי גנוטיפ יכול להשפיע על ההפצה של חיידקים תאיים בין vacuolar ותא cytosolic, יש צורך לכמת את מספר לעומת vacuolarחיידקי cytosolic. מאז, בהגדרות ניסיוניות רוב תאי מארח נגועים בחיידק אחד או יותר, ולאחר מכן יכולים נמל כמה חיידקים בתאי subcellular שונים, יש צורך בטכניקה המאפשרת כימות ברמה של חיידקים בודדים. permeabilization ההפרש (הידוע גם בassay הגנת phagosomal) מספק רזולוציה זו 2,4,10,12. Assay מבוסס על permeabilization סלקטיבית של קרום הפלזמה התא המארח עם digitonin חומר הניקוי, מה שמשאיר את קרומי vacuolar שלמים ובכך מאפשר צביעה סלקטיבית של חיידקי cytosolic עם נוגדנים. כאן אנו מספקים שני פרוטוקולים לכימות של cytosolic וvacuolar typhimurium סלמונלה באמצעות permeabilization ההפרש. העיקרון של שיטה זו מתואר באיור 1: מקרופאגים מח העצם נגזרים (BMDMs) נגועים בשלב נייח mCherry להביע סלמונלה. השלב נייח סלמונלה צריכה to לשמש כי הם downregulate הביטוי של T3SS SPI-1, שפעילותם אמורה היה להיות מוכרת על ידי inflammasome NLRC4 ולגרום למוות מהיר של תאים (pyroptosis) של 15 BMDMs. בעקבות זיהום תאים נשטפים וטופלו עם 50 / מיליליטר מיקרוגרם של digitonin דקה 1. תאים נשטפים שוב מייד וטופחו עם נוגדנים נגד סלמונלה מצמידים את FITC לסמן חיידקים עם גישה לcytosol. לאחר שטיפה נוספת תאי צעד הם lysed ואחוז mCherry + (vacuolar) וFITC + / mCherry + (cytosolic) החיידקים נקבע על ידי FACS. כמו כן, אנו מדווחים על הסתגלות של שיטה זו, שניתן להשתמש אם אין זנים להביע חלבון פלואורסצנטי זמינים (איור 2). צעדים נוספים שהוכנסו לאחר תיוג FITC שבו תאים הם קבועים וpermeabilized לחלוטין. לאחר מכן כל חיידקי מגואלות נוגדנים נגד סלמונלה ונוגדנים משני המתאימים. Detשיקוף מכן על ידי מיקרוסקופ במקום ניתוח FACS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. digitonin Assay עם mCherry להביע סלמונלה (FACS מבוסס ניתוח)

  1. חיידקי הכנה
    הערה: SL1344 פראי הסוג סלמונלה (סטרפטומיצין עמיד) להביע mCherry מפלסמיד (pFPV קידוד mCherry תחת אמרגן rpsM) משמש בassay זה. phagocytosis החיידקים והתרבות שבו לא שונתה על ידי הביטוי המכונן של mCherry (מידע לא מוצגים) 16.
    1. לחסן יום מתח 1 לפני הזיהום ב 3 מיליליטר של מדיום LB בתוספת סטרפטומיצין (90 מיקרוגרם / מיליליטר) ואמפיצילין (100 מיקרוגרם / מיליליטר, וקטור להביע mCherry) שבייקר ב 37 מעלות CO / N.
  2. תאי ציפוי לזיהום.
    1. BMDMs זרע בר-סוג בצלחת גם 24 בצפיפות של 1.25 x 10 5 תאים / גם ב 1 מיליליטר של מדיום העיקרי מקרופאג (DMEM בתוספת 10% עגל סרום עוברי (FCS, חום מומת, 56 ° C, 30 דקות ),, חומצות אמינו לא חיוני 1% HEPES 1% (רח"ל), 1% L-גלוטמין ו -10% L929 supernatant (בינוני מותנה מגורם גירוי-מושבה (M-CSF מקרופאג) הפקת L929 תאים). בארות זרע לפי טבלת 1 כדי להסביר את התנאים הבודדים. להוסיף coverslips לבארות המשמשות כקבוצת ביקורת (טבלת 1).
    2. דגירה תאי הלילה בחממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
Permeabilization מכתים
coverslip הזכוכית סלמונלה Digitonin Saponin אנטי-סלמונלה אנטי-Calnexin אנטי-PDI
A1 (לדוגמא) - / + * + + +
A2 (לדוגמא) - / + * + + +
A3 (לדוגמא) - / + * + + +
A4 (אין שליטת permeabilization) - / + * + +
A5 (שליטת permeabilization מלאה) - / + * + + +
B1 (מוכתם לcalnexin) + +
B2 (מוכתם לcalnexin) + + +
B3 (מוכתם לcalnexin) + + +
C1 (מוכתםלPDI) + +
C2 (מוכתם לPDI) + + +
C3 (מוכתם לPDI) + + +

טבלת 1: ערכת ציפוי למקרופאגים מח עצם נגזרים (BMDMs) בפורמט 24 גם לזיהום לאחר מכן עם סלמונלה, permeabilization, ומכתים * תלוי אם פרוטוקול פרוטוקול 1 או 2 נעשה..

  1. הכנת החיידקים לזיהום.
    1. למחרת, לקבוע את הריכוז של סלמונלה בתרבות הלילה על ידי דילול תרבות 1:10 ב PBS ומדידת OD 600 נגד שליטה רק PBS. הדבר מבטיח כי OD 600 נמדד בlמגוון באוזנו של ספקטרופוטומטר.
    2. חשב את הריכוז של סלמונלה לכל מיליליטר. OD600 של 1 מתאים ל1 x 10 9 חיידקים.
    3. לדלל את החיידקים במדיום מקרופאג להגיע ריכוז סלמונלה של 1.25 x 10 6 תאים / מיליליטר.
  2. זיהום של תאים עם סלמונלה.
    1. הסר בינוני מBMDMs. הוסף 1 מיליליטר של מדיום מקרופאג לבארות נגוע שליטה (B1-B3, C1-C3). הוסף 1 מיליליטר של ההשעיה סלמונלה לA1 בארות - A5 להגיע ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 10 חיידקים לכל תא.
    2. צנטריפוגה הצלחת במשך 15 דקות ב 300 XG ב 37 ° C כדי לסנכרן את הזיהום. העבר את הצלחת בחממה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  3. הריגת סלמונלה תאית עם גנטמיצין.
    1. בזיהום שלאחר שעה 1, להסיר את הצלחת מהחממה ולהוסיף 0.1 מיליליטר של מדיום מקרופאג מכיל 0.1 מ"ג / מיליליטר גנטמיציןכדי להרוג חיידקים תאיים. להוסיף גנטמיצין לכל הבארות, אפילו לבקרות נגוע, כדי להבטיח שהם התייחסו לכל התאים באותו אופן. העבר את הצלחת בחממה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  4. שטיפת התאים.
    1. בשעת 2 ​​לאחר זיהום שעות, להסיר את הצלחת מחממה ולשטוף את כל בארות 2x עם 1 מיליליטר של DMEM רגיל (מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס) ולהחליף אותו עם מדיום מקרופאג (מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס) המכיל 10 מיקרוגרם / מיליליטר   Gentamycin כדי למנוע צמיחה של כל חיידקים תאיים שנותרו. העבר את הצלחת בחממה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  5. הכנת מאגרים טריים עם חומרי ניקוי ונוגדנים.
    1. רגע לפני נקודת הזמן הרצויה של ניתוח, להכין פתרון מניות טרי של digitonin ב1 מ"ג / מיליליטר בKHM הצפת (אצטט אשלגן 110 מ"מ, 20 מ"מ HEPES, 2 מ"מ MgCl 2, pH 7.3). סנן את המניה ולדלל בKHM חיץ לריכוז עבודה50 / מיליליטר מיקרוגרם של digitonin. בנוסף, להכין פתרון של 0.1% סאפונין בKHM מאגר, נוגדן אנטי סלמונלה מצמידים את FITC (CSA-1-FITC) ב1/500, אנטי-calnexin ב1/100 או אנטי-PDI ב1/100 בKHM המאגר השלים עם BSA 3%.
  6. תא permeabilization.
    1. בארות הסר את הצלחת מן החממה ולשטוף 3x עם 0.5 מיליליטר של KHM הצפת (מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס). הסר KHM מאגר ולהוסיף 0.25 מיליליטר רגיל KHM מאגר לבארות A4 וB1 / C1, KHM הצפת עם digitonin לA1 בארות - A3 ו- B2 / C2 או KHM הצפת עם saponin לA5 בארות וB3 / C3 (לפי טבלת 1). דגירה בדיוק 1 דקות ב RT ומייד לשטוף את כל בארות 3x עם 0.5 מיליליטר של KHM הצפת (מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס).
  7. צביעת נוגדן ראשונית.
    1. הסר את מאגר KHM ולהוסיף פתרונות נוגדן הראשוניים (עיזים אנטי סלמונלה -FITC, 250 μl / טוב, 0.1 מיקרוגרם / מיליליטר) לבארות המתאימות (איור 1 טבלת 1). דגירה את הצלחת במשך 15 דקות בחממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
    2. לשטוף את תאי 1x עם 1 מ"ל PBS.
  8. תאים נגועים (A1 בארות - A5): ניתוח FACS
    1. לשטוף את תאי 3x עם PBS ולהוסיף 0.5 מ"ל של PBS קר כקרח המכיל 0.1% טריטון. מעבירים צינור 5 מ"ל FACS עם כובע מסננת תא כדי לשבור את אגרגטים תא. שמור על דגימות קרח.
    2. ניתוח הדגימות של FACS. שימוש בפקדי permeabilized מלאה, להגדיר את השער לחיידקים כולל המבוססים על קדימה וצד פיזור (FSC / SSC) ראשון, ואת אות mCherry (610 ננומטר ± 20 ננומטר מסנן).
    3. בשלב הבא, לנתח את אות FITC באוכלוסיית החיידקים הכוללת שימוש בפקדי permeabilized באופן מלא ולא permeabilized כדי להגדיר את השערים לחיידקים cytosolic (FITC +, mCherry +) וחיידקים vacuolar (FITC-, mCherry +) (איור 3).
    4. עם השערים להגדיר, לנתח הדגימות ולקבוע את אחוז לעומת cytosolicחיידקי vacuolar באמצעות תוכנת FlowJo פי הפרוטוקול של היצרן.
  9. בקרות permeabilization נגוע (B1 בארות - B3, C1 - C3): מיקרוסקופיה
    1. קיבוע
      1. הסר PBS ולהוסיף 250 μl של 4% PFA בPBS. דגירה של 10 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
      2. לשטוף בארות 2x עם 1 מיליליטר של PBS ולהוסיף 250 μl של 0.1 מ 'גליצין ב PBS במשך 10 דקות כדי להרוות את מקבע. בארות לשטוף 2X עם 1 מיליליטר של PBS.
    2. צביעת נוגדנים משני.
      1. בקרות permeabilization כתם במשך שעה 1 ב RT עם נוגדנים משני מתאימים מצמידים fluorophores בPBS בתוספת 0.1% סאפונין ו -3 BSA% לתאי Permeabilize מלא.
      2. לשטוף coverslips 3x עם 1 מיליליטר של PBS והר coverslips לניתוח בהרכבה בינוני עם DAPI (1.5 מיקרוגרם / מיליליטר).
    3. ניתוח מיקרוסקופית.
      1. לנתח את coverslips עם הפקדים בהגדלה 63X 40X או באמצעות fluo confocalמיקרוסקופ rescence. אם permeabilization עבד, לא צריך להיות שום צביעה לתאים-permeabilized עישון, צביעת Calnexin לשני תאי digitonin- וpermeabilized-Saponin וPDI מכתים רק לתאים-permeabilized saponin (איור 4).

2. digitonin Assay עם סלמונלה ללא תווית (ניתוח מבוסס מיקרוסקופית)

  1. הכנת חיידקים לO תרבויות N /.
    1. לחסן SL1344 wild-type ללא תווית סלמונלה (סטרפטומיצין עמיד) 1 יום לפני הזיהום ב 3 מיליליטר של מדיום LB בתוספת סטרפטומיצין (90 מיקרוגרם / מיליליטר) שבייקר ב 37 מעלות CO / N.
    2. תאי ציפוי לזיהום.
      1. BMDMs זרע בצלחת גם 24 המכילה coverslips זכוכית סטרילית בצפיפות של 1.25 x 10 5 תאים / גם ב 1 מיליליטר של מדיום מקרופאג (DMEM בתוספת 10% עגל סרום עוברי (FCS,-השלים דה, 56 ° C,חומצות 30 דקות), 1% HEPES, 1% L-ללא-אמינו חיוני (NEAA), L-גלוטמין 1% ו- 10% supernatant L929). בארות זרע לפי טבלת 1 כדי להסביר את התנאים הבודדים.
      2. דגירה התאים O / N בחממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
    3. הכנת החיידקים לזיהום.
      1. למחרת, לקבוע את הריכוז של סלמונלה בO / תרבות N על ידי דילול תרבות 1:10 ב PBS ומדידת OD 600 נגד שליטה רק PBS. הדבר מבטיח כי OD 600 נמדד בטווח ליניארי של ספקטרופוטומטר.
      2. קבע את הריכוז של סלמונלה למיליליטר. OD 600 של 1 מתאים ל1 x 10 9 חיידקים.
      3. לדלל את החיידקים במדיום מקרופאג להגיע ריכוז סלמונלה של 1.25 x 10 6 תאים / מיליליטר.
    4. זיהום של תאים עם סלמונלה. הסר בינוני מכל הבארות. הוסף 1 מיליליטר של מדיום מקרופאג רגיל לבארות שליטה נגוע (B1 - B3, C1 - C3). הוסף 1 מיליליטר של ההשעיה סלמונלה לA1 בארות - A5 להגיע ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 10 חיידקים לכל תא.
    5. צנטריפוגה הצלחת במשך 15 דקות ב 300 XG ב 37 ° C כדי לסנכרן את הזיהום. העבר את הצלחת בחממה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  2. הריגת סלמונלה תאית עם gentamycin.
    1. בזיהום שלאחר שעה 1, להסיר את הצלחת מהחממה ולהוסיף 0.1 מיליליטר של מדיום מקרופאג המכיל 1 מ"ג / מיליליטר gentamycin כדי להרוג חיידקים תאיים לכל הבארות. העבר את הצלחת בחממה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  3. שטיפת התאים.
    1. בזיהום שלאחר 2 שעות, להסיר את הצלחת מחממה ולשטוף היטב 3x כל אחד עם 1 מיליליטר של מדיום מקרופאג טרי המכיל 10 מיקרוגרם / מיליליטר Gentamycin כדי למנועצמיחה של כל חיידקים תאיים שנותרו. העבר את הצלחת בחממה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  4. הכנת מאגרים טריים עם חומרי ניקוי ונוגדנים.
    1. רגע לפני נקודת הזמן הרצויה של ניתוח, להכין פתרון מניות טרי של digitonin ב1 מ"ג / מיליליטר בKHM הצפת (אצטט אשלגן 110 מ"מ, 20 מ"מ HEPES, 2 מ"מ MgCl 2, pH 7.3). סנן את המניה ולדלל בKHM מאגר לריכוז עבודה של 50 מיקרוגרם / מיליליטר של digitonin.
    2. בנוסף, להכין פתרון של 0.1% סאפונין בKHM מאגר, אנטי סלמונלה -FITC (CSA-1, 0.1 מיקרוגרם / מיליליטר), אנטי-calnexin ב1/100 או אנטי-PDI ב1/100 בKHM הצפת בתוספת BSA 3% (ראה טבלת חומרים לריכוז נוגדנים).
  5. תא permeabilization.
    1. בארות הסר את הצלחת מן החממה ולשטוף 3x עם 0.5 מיליליטר של KHM הצפת (מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס). הסר KHM מאגר ולהוסיף 0.25 מיליליטר רגיל KHM מאגרלבארות A4 וB1 / C1, KHM הצפת עם digitonin לA1 בארות - A3 ו- B2 / C2 או KHM הצפת עם saponin לA5 בארות וB3 / C3 (לפי טבלת 1). דגירה בדיוק 1 דקות ב RT ומייד לשטוף את כל בארות 3x עם 0.5 מיליליטר של KHM הצפת (מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס).
  6. צביעת נוגדן ראשונית.
    1. הסר את מאגר KHM ולהוסיף פתרונות נוגדן הראשוניים (עיזים אנטי סלמונלה CSA1-FITC, 250 μl / טוב, 0.1 מיקרוגרם / מיליליטר) לבארות המתאימות (איור 2, לוח 1). דגירה את הצלחת במשך 15 דקות בחממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. 3x לשטוף עם 1 מיליליטר PBS.
  7. קיבעון.
    1. הסר PBS ולהוסיף 250 μl של 4% PFA בPBS. דגירה של 10 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
    2. לשטוף בארות 2x עם 1 מיליליטר של PBS ולהוסיף 250 μl של 0.1 מ 'גליצין ב PBS במשך 10 דקות כדי להרוות את מקבע. בארות לשטוף 2X עם 1 מיליליטר של PBS.
  8. סה"כצביעת סלמונלה של דגימות נגועות.
    1. לשטוף coverslips 3x עם PBS עם 0.1% BSA / 3% סאפונין דגירה הדגימות עם נוגדן אנטי CSA1 (אנטי-CSA1 עיזים, 0.1 מיקרוגרם / מיליליטר, העכבר אנטי-LPS עובד כמו גם, 0.1 מיקרוגרם / מיליליטר) במשך שעה 1 ב RT בPBS עם 0.1% BSA / 3% סאפונין.
    2. 3x לשטוף ב- PBS עם 0.1% BSA / 3% סאפונין. דגירה הדגימות שלך עם נוגדן אנטי עיזים משניים מצמידים את fluorophore של בחירה בPBS עם 0.1% BSA / 3% סאפונין למשך 30 דקות ב RT בחושך.
    3. לשטוף coverslips 3x עם 1 מיליליטר של PBS והר coverslips לניתוח בהרכבה בינוני עם DAPI (1.5 מיקרוגרם / מיליליטר).
  9. ניתוח מיקרוסקופית.
    1. רוכשים את הנתונים עם מיקרוסקופ confocal על ידי ספירת סלמונלה cytosolic (אנטי סלמונלה -FITC החיובי) וסלמונלה הכוללת (כפול חיובי) (איור 5). בקרות permeabilization צריכים להראות: לא מכתימה עבור תאים-permeabilized עישון, Calnexin שלtaining לתאים-permeabilized digitonin וצביעת PDI לתאים-permeabilized saponin (איור 4). ולס A4 ו- A5 ישמשו בקרות פנימיות כמו להכתמת סלמונלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 ואיור 2 מציגים את השרטוטים של assay digitonin המתוארים בפרוטוקול 1 ופרוטוקול 2 ממחישים את השלבים הקריטיים בפרוטוקול ותוצאות שהתקבלו. איור 3 מראה תוצאות FACS טיפוסיות. בקרות חיוביות ושליליות משמשות כדי להגדיר את השערים לחיידקים mCherry + / FITC- (vacuolar סלמונלה) וmCherry + / FITC + חיידקים (cytosolic סלמונלה). בהתבסס על השערים האלה אחוז חיידקי cytosolic וvacuolar ניתן לקבוע בדגימות הניסוי. בדוגמא זו יש לנו בהשוואה wild-type וΔsifA סלמונלה. איור 3 מראה נתונים שהושגו עם נציג typhimurium mCherry + סלמונלה wild-type ומוטצית ΔsifA במקרופאגים עכברי-נגזר מח העצם. איור 4 מראה את Calnexin הרגיל () וPDI כתמים שמתקבלים בt בקרות permeabilization (ב)reated עם digitonin או saponin. מאז Calnexin הוא חלבון קרום ER, מכתים Calnexin ניתן לראות ברחבי cytosol וסביב הגרעין בשני תאי digitonin- ו- permeabilized saponin. בdigitonin permeabilized פקדים לא מכתים PDI (ER לומן) הוא גלוי, תוך הכתמת ניתן להבחין בתאים-permeabilized saponin. איור 5 א 'מציג תוצאת צביעת סלמונלה אנטי בתאים שכבר permeabilized עם digitonin. סה"כ חיידקים נמצאים באדום, ואילו חיידקי cytosolic נמצאים בירוק (מוכתם אנטי סלמונלה -FITC). אוכלוסיית FITC החיובי הם סלמונלה עם גישה לcytosol, בעוד שהאוכלוסייה FITC השלילית הן חיידקים ששהו בסלמונלה שלמה המכיל vacuole (SCV) ולכן היו מוגן מתיוג סלמונלה -FITC. יש לנו גם בהשוואה wild-type סלמונלה לזן מוטציה ΔsifA. מאז SIFA הוא הכרחי לסלמונלה לשמור Sשלמות קורות חיים אחוז מוגבר של סלמונלה הוא cytosolic. באיור 5 אנו מראים שליטה, שבו התאים לא digitonin permeabilized לפני הוספה אנטי סלמונלה -FITC. בהתאם לכך, ניתן לראות לא חיידקי FITC חיובי.

איור 1
איור 1. ייצוג סכמטי של פרוטוקול 1. תאים נגועים המכילים סלמונלה mCherry-חיובית או בvacuoles שלם או cytosol הם permeabilized דיפרנציאלי עם digitonin. Cytosolic סלמונלה מגואלות נגד סלמונלה מצמידים את FITC. תאים נשטפים וlysed עם טריטון X-100 לניתוח FACS. תאי בקרה שליליים אינם permeabilized, בעוד תאי שליטה חיוביים permeabilized לחלוטין לפני מכתים נוגדן.

"איור איור 2. ייצוג סכמטי של פרוטוקול 2. תאים נגועים המכילים סלמונלה ללא תווית או בvacuoles שלם או cytosol הם permeabilized דיפרנציאלי עם digitonin. Cytosolic סלמונלה מגואלות נגד סלמונלה מצמידים את FITC. תאים נשטפים וקבועים עם PFA 4%. תאי permeabilzed לחלוטין ומוכתמים עם נוגדנים נגד סלמונלה, ואחרי צביעה עם נוגדנים משני מצמידים את Alexa 568. מיקרוסקופית משמש כדי לספור FITC + / Alexa568 + סלמונלה (cytosolic) וAlexa568 + סלמונלה (vacuolar).

איור 3
ניתוח 3. FACS איור של דגימות permeabilized מלאה, unpermeabilized או באופן דיפרנציאלי permeabilized נגועה לשעה 6 בmCherry + פרא-סוג או & #916; SIFA סלמונלה עבור 6 שעות.

איור 4
איור 4. אנטי-Calnexin () וPDI אנטי-מכתים (B) של BMDMs נגוע permeabilized עם digitonin או saponin. ברים סולם 10 מיקרומטר.

איור 5
איור 5. נציגי תמונות של assay permeabilization ההפרש עם typhimurium סלמונלה wild-type וזן המוטציה ΔsifA ב6 שעות לאחר הדבקה. Cytosolic סלמונלה וסלמונלה הכוללת מצוינות. תאים היו או digitonin permeabilized () או שמאלה unpermeabilized (ב ') לפני הצביעה עם אנטי סלמונלה -FITC לסלמונלה cytosolic. לאחר שלב צביעה, ג זואמות היו permeabilized עם Saponin וסלמונלה הכוללת הוכתמו אנטי נוגדני סלמונלה ואחריו מכתים המשני נוגדן (אדום). בקנה מידה מונעת 10 מיקרומטר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

permeabilization ההפרש הוא שיטה קלה וחזקה כדי לנתח ולכמת את הפצת subcellular של חיידקים פתוגנים בין תאי vacuolar וcytosol. אותו assay שמש בהצלחה עם חיידקים כגון Francisella novicida 2,4 וShigella flexneri 12. עם זאת, מאחר שרבי הפתוגן תאיים לשנות או לשנות את מבני endomembrane מארח, על חוסנו של permeabilization digitonin יצטרך להיקבע על בסיס פרטני. כוונון עדין של assay בביחס לקו הפתוגן או תא משמש ייתכן שיהיה צורך. Assay אינו מוגבל רק לביולוגיה זיהום, אך יכול לשמש גם ליישום ביולוגי תא אחר ש, כמו מוות של תאי איתות 17,18.

המפתח לassay זה הוא שיש לי קרום הפלזמה והקרום תאיים הרכב שומנים שונה, בקרומים תאיים מסוימים מכילים פחות צ'וlesterol. Digitonin יכולים כולסטרול מורכב ובכך מביא לדיפרנציאלי permeabilization, היעילות והסלקטיביות שלה תלוי באורך של טיפול digitonin והריכוז של חומר הניקוי. כדי לשלוט על זה, חשוב לבדוק תאי permeabilized על ידי צביעה לחלבונים סמן עם לוקליזציה תאית מוגדרת, כגון זנב cytosolic של calnexin או PDI חלבון luminal ER.

בעוד permeabilization ההפרש הוא לא חדש, פרוטוקול זה מאפשר בנוסף כימות מהיר ואובייקטיבי של חיידקי cytosolic וvacuolar מבוססים על FACS. לניתוח FACS זה חשוב לכלול שני פקדים, שהם תאים-permeabilized אינה וpermeabilized מלאה. בהתבסס על דגימות בקרה אלה השערים לvacuolar כלומר בלא כתם ומוכתם באופן מלא וחיידקים cytosolic ייקבעו.

שלב קריטי של הפרוטוקול הוא permeabilization ושלבי כביסה שלאחר מכן. Frפתרונות חיץ וחומר ניקוי מוכנים eshly צריכים לשמש. כל הפתרונות צריכים להיות להכין רק לפני השימוש. עוד נקודה קריטית היא העיתוי של permeabilization. כאן 1 דקות בריכוז digitonin של 50 מיקרוגרם / מיליליטר הוכיח לעבוד היטב למקרופאגים נגזרו מח עצם. בעת שימוש בשורות תאים שונות, ריכוז העבודה ייתכן שיהיה הצורך לקבוע באופן אמפירי. ריכוזים גבוהים של פעמים digitonin או דגירה על 1 דקות יכולים להוביל לpermeabilization של ממברנות הפנימיות, ותוצאות חיוביות שגויות. פתרונות digitonin יציבים רק עבור 1-2 שעות. הכנת פתרון חדש של digitonin רק לפני היא קריטי. גם היכולת של digitonin לpermeabilze קרומים יכולים להשתנות מתצוו אצווה ובין ספקים שונים.

לכן אם דגימות רבות צריכים להיות מטופלים מומלץ לפצל אלה לקבוצות קטנות יותר שיכול להיות מעובד בקלות ובמהירות. לבסוף, כל צעדי הכביסה לאחר הסלסולeabilization צריך להיעשות בזהירות רבה מאז טיפול digitonin מחליש קרומים תאיים. תוספת של חיץ ושאיפה צריך להיעשות בעדינות בצד השני של הבאר ולא באמצע גם.

כפי שציין, בטכניקות אחרות כדי לנתח את חלוקת subcellular של חיידקים בין cytosol ותאי vacuolar קיימים, כגון שימוש במחשוף ב-lactamase סריג הכתב CCF4-AM 19. בעוד שיטת CCF4-AM מציעה את היתרון של מדידת קרע vacuolar בזמן אמת, היא חסרה את הרזולוציה ברמת החיידק הבודד ורק יכולה לספק מידע ברמת התא הבודד מארח. כך שילוב של שניהם מבחני הוא אידיאלי כדי לקבל מידע על הרמות של תאי חיידקים / מארח אחד לאורך זמן. חשוב לציין, ניתן להשתמש בשני מבחני לא רק בהקשר של זיהומים חיידקיים, אלא גם בהקשר של מחקרים ביולוגיים תא אחרים שמטרתם לקבוע את לוקליזציה המשנה הסלולר של p היעדroteins 18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

ברצוננו להודות מתיאס ס דיק, רולנד פ Dreier וסבסטיאן רול לדיון. עבודה זו נתמכה על ידי קתדרת PP00P3_139120 SNSF / 1 וID2153162 פרויקט מענק אוניברסיטת באזל לPB

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Digitonin Sigma D5628 50 μg/ml
PFA mpbio 219998380
HEPES Life Technologies 15630
Potassium Acetate Sigma 791733
MgCl2 Sigma M8266
BSA Sigma A2153
anti-Salmonella CSA-1-FITC KPL 01-91-99-MG 1/500
anti-Salmonella CSA-1 KPL 02-91-99-MG 1/500
anti-Calnexin Enzo Lifesciences SPA-860D 1/100
anti-PDI Enzo Lifesciences SPA-890 1/100
Saponin Sigma 47036
Vectashield mounting medium Vectorlabs H-1200
Anti Rabbit antibody-488 Molecular Probes A-11070 1/500
Glycine Sigma G8898
Gentamicin Life Technologies 15710-49 100 μg/ml and 10 μg/ml
Triton X-100 Promega H5141
PBS Gibco 20012-019
DMEM Sigma D6429
NEAA Amimed 5-13K00-H
LSM700 Confocal microscope Zeiss imaging done at 63X
FACS Fortessa BD technologies detection mCherry 610 nm
FACS Fortessa BD technologies detection FITC 530 nm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kumar, Y., Valdivia, R. H. Leading a sheltered life: intracellular pathogens and maintenance of vacuolar compartments. Cell Host Microbe. 5, 593-601 (2009).
  2. Chong, A., et al. The early phagosomal stage of Francisella tularensis determines optimal phagosomal escape and Francisella pathogenicity island protein expression. Infect Immun. 76, 5488-5499 (2008).
  3. Mellouk, N., et al. Shigella subverts the host recycling compartment to rupture its vacuole. Cell Host Microbe. 16, 517-530 (2014).
  4. Checroun, C., Wehrly, T. D., Fischer, E. R., Hayes, S. F., Celli, J. Autophagy-mediated reentry of Francisella tularensis into the endocytic compartment after cytoplasmic replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 14578-14583 (2006).
  5. Broz, P., Monack, D. M. Newly described pattern recognition receptors team up against intracellular pathogens. Nat Rev Immunol. 13, 551-565 (2013).
  6. Hagar, J. A., Powell, D. A., Aachoui, Y., Ernst, R. K., Miao, E. A. Cytoplasmic LPS activates caspase-11: implications in TLR4-independent endotoxic shock. Science. 341, 1250-1253 (2013).
  7. Ogawa, M., et al. Escape of intracellular Shigella from autophagy. Science. 307, 727-731 (2005).
  8. Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. Salmonellae interplay with host cells. Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).
  9. Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole. J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).
  10. Malik-Kale, P., Winfree, S., Steele-Mortimer, O. The bimodal lifestyle of intracellular Salmonella in epithelial cells: replication in the cytosol obscures defects in vacuolar replication. PLoS One. 7, e38732 (2012).
  11. Zhao, Y. O., Khaminets, A., Hunn, J. P., Howard, J. C. Disruption of the Toxoplasma gondii parasitophorous vacuole by IFNgamma-inducible immunity-related GTPases (IRG proteins) triggers necrotic cell death. PLoS Pathog. 5, e1000288 (2009).
  12. Meunier, E., et al. Caspase-11 activation requires lysis of pathogen-containing vacuoles by IFN-induced GTPases. Nature. 509, 366-370 (2014).
  13. Yamamoto, M., et al. A cluster of interferon-gamma-inducible p65 GTPases plays a critical role in host defense against Toxoplasma gondii. Immunity. 37, 302-313 (2012).
  14. Degrandi, D., et al. Murine guanylate binding protein 2 (mGBP2) controls Toxoplasma gondii replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 294-299 (2013).
  15. Mariathasan, S., et al. Differential activation of the inflammasome by caspase-1 adaptors ASC and Ipaf. Nature. 430, 213-218 (2004).
  16. Knodler, L. A., Nair, V., Steele-Mortimer, O. Quantitative assessment of cytosolic Salmonella in epithelial cells. PLoS One. 9, e84681 (2014).
  17. Ng, H., Smith, D. J., Nagley, P. Application of flow cytometry to determine differential redistribution of cytochrome c and Smac/DIABLO from mitochondria during cell death signaling. PLoS One. 7, e42298 (2012).
  18. Krawczyk, E., Suprynowicz, F. A., Sudarshan, S. R., Schlegel, R. Membrane orientation of the human papillomavirus type 16 E5 oncoprotein. J Virol. 84, 1696-1703 (2010).
  19. Keller, C., et al. Single cell measurements of vacuolar rupture caused by intracellular pathogens. J Vis Exp. , e50116 (2013).

Tags

אימונולוגיה גיליון 101, זיהום חסינות מיקרוביולוגיה חיידקים קרע vacuolar מיקרוסקופיה פתוגנים ביולוגיה מולקולרית vacuoles המכיל פתוגן, מקרופאגים
כימות של Cytosolic לעומת vacuolar<em&gt; סלמונלה</em&gt; ביסודי המקרופאגים על ידי דיפרנציאל permeabilization
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Meunier, E., Broz, P. Quantification … More

Meunier, E., Broz, P. Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization. J. Vis. Exp. (101), e52960, doi:10.3791/52960 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter