Abstract
Bactéries pathogènes intracellulaires peuvent se répliquer dans le cytosol ou dans les vacuoles contenant des agents pathogènes spécialisés (PCV). Pour atteindre le cytosol, des bactéries telles que Shigella flexneri et Francisella novicida besoin pour induire la rupture du phagosome. En revanche, Salmonella typhimurium se réplique dans un compartiment vacuolaire, connu sous le nom de Salmonella vacuole contenant (SCV). Cependant certains mutants de Salmonella ne parviennent pas à maintenir l'intégrité SCV et sont ainsi libérés dans le cytosol. Le pourcentage de bactéries par rapport cytosolique vacuolaires sur le niveau de bactéries individuelles peut être mesurée par perméabilisation différentiel, également connu comme dosage phagosome-protection. L'approche fait usage de la propriété de détergent digitonine à se lier sélectivement cholestérol. Étant donné que la membrane plasmique contient plus de cholestérol que les autres membranes cellulaires, la digitonine peut être utilisé pour perméabiliser sélectivement la membrane plasmique tout en laissant les membranes intracellulairesintact. En bref, suivant l'infection par l'agent pathogène exprimant une protéine marqueur fluorescent (par exemple mCherry entre autres), la membrane plasmique des cellules hôtes est perméabilisées par une courte incubation dans un tampon contenant de la digitonine. Les cellules sont ensuite lavées et incubées avec un anticorps primaire (couplé à un fluorophore voulue) dirigé contre la bactérie de choix (par exemple FITC anti- Salmonella) et lavées de nouveau. Si les bactéries non marquées sont utilisées, une étape supplémentaire peut être effectuée, dans lequel toutes les membranes sont perméabilisées et toutes les bactéries colorées avec un anticorps correspondant. Suite à la coloration, le pourcentage de bactéries vacuolaires cytosoliques et peut être quantifiée par FACS ou par microscopie compter les événements simples ou doubles-positives. Ici, nous fournissons des détails expérimentaux pour l'utilisation de cette technique par la bactérie Salmonella typhimurium. L'avantage de ce test est que, contrairement à l'autre dosage, il fournit une quantification du niveau de seul bacteria, et si analysée par microscopie fournit le nombre exact de bactéries cytosolique et vacuolaires dans une cellule donnée.
Introduction
Les bactéries pathogènes intracellulaires se répliquent soit directement dans le cytosol de la cellule hôte, ou dans des compartiments spécialisés vacuolaires 1. Durant la phase initiale de l'infection la plupart des pathogènes se internalisés soit par phagocytose par des cellules spécialisées (telles que les macrophages) ou par la promotion active de leur propre absorption dans des cellules non-phagocytaires. Dans les cellules phagocytaires, le phagosome fusionne généralement avec les lysosomes pour former un compartiment de dégradation, où les particules phagocytées sont digérés. Cytosoliques bactéries spécialisées, telles que Francisella novicida ou Shigella flexneri, échapper à la dégradation du phagosome en induisant la rupture du phagosome et d'échapper par la suite dans le cytosol 2,3. Cela nécessite mécanisme de virulence associés tels que l'île Francisella pathogénicité (FPI) ou Shigella flexneri SST3, qui injecte des protéines effectrices qui favorisent vacuolaire rupture 2-4. Les caractéristiques de cytosol de la cellule hôteun certain nombre de récepteurs conservés de reconnaissance des formes qui reconnaissent normalement la présence de pathogènes et induisent immunitaire inné signalisation 5. En outre, xenophagy, une forme anti-microbienne de l'autophagie peut dégrader les bactéries qui pénètrent dans le cytosol. Cytosoliques bactéries sont normalement bien adaptés à émousser ou de contourner ces réponses en utilisant différentes stratégies. Par exemple, Francisella modifie ses LPS pour éviter la reconnaissance de l'hôte et Shigella empêche le recrutement de l'autophagie en utilisant des protéines effectrices sécrétées 6,7.
Une autre stratégie pour échapper à la dégradation lysosomale est employé par le modèle vacuolaire pathogène Salmonella enterica sérotype Typhimurium, par la suite dénommée Salmonella typhimurium. Salmonella utilise un SST3 d'injecter effecteurs qui remodèlent le phagosome initiale dans sa niche intracellulaire, la Salmonella contenant vacuole (SCV) 8,9. La manipulation continue des voies d'accueil estnécessaire pour maintenir cette vacuole en recrutant des lipides et autres nutriments vers la vacuole. En effet, un mutant de Salmonella SIFA ne parvient pas à maintenir la stabilité vacuolaire, et pénètre dans le cytosol des cellules hôtes en quelques heures après l'infection, ce qui conduit à l'activation des voies immunitaires innées et le recrutement de autophagie 8. Évasion Vacuolar de Salmonella varie en fonction du type de cellule qui est des études, et plusieurs rapports ont montré que dans les cellules épithéliales même WT Salmonella peut échapper à la SCV et hyperreplicate dans le cytosol 10. Des rapports récents montrent que la détection immunitaire innée des pathogènes vacuolaires dépend aussi de la capacité de l'hôte à reconnaître et à déstabiliser vacuoles contenant pathogènes (PCV) 11-14.
Étant donné que l'hôte ou des bactéries génotype peuvent affecter la distribution des bactéries intracellulaires entre le vacuolaire et le compartiment cytosolique, il est nécessaire de quantifier le nombre de vacuolaire vs.bactéries cytosoliques. Etant donné que, dans la plupart des configurations expérimentales cellules hôtes sont infectées avec plus d'une bactérie, et par la suite peuvent abriter plusieurs bactéries dans différents compartiments sous-cellulaires, une technique est nécessaire qui permet la quantification de la teneur en bactéries simples. Perméabilisation sélective (également connu sous le nom d'essai de protection phagosome) fournit cette résolution 2,4,10,12. Le dosage est basé sur la perméabilisation sélective de la membrane plasmique de la cellule hôte avec le détergent digitonine, ce qui laisse les membranes vacuolaires intact et permet ainsi la coloration sélective de bactéries avec des anticorps cytosoliques. Ici, nous fournissons deux protocoles de quantification des cytosolique et vacuolaire Salmonella typhimurium en utilisant perméabilisation différentiel. Le principe de cette méthode est décrite dans la figure 1: les macrophages de moelle osseuse dérivés (BMDMs) sont infectées avec phase stationnaire mCherry exprimant Salmonella. Phase stationnaire Salmonella besoin to être utilisés car ils régulent à la baisse l'expression de la SPI-1 SST3, dont l'activité serait autrement reconnu par l'inflammasome NLRC4 et induire la mort cellulaire rapide (pyroptosis) de la BMDMs 15. Suite à l'infection des cellules sont lavées et traitées avec 50 pg / ml de digitonine pendant 1 minute. Les cellules sont lavées de nouveau et immédiatement incubées avec des anticorps anti-Salmonella couplés au FITC pour marquer des bactéries avec accès au cytosol. Après un lavage supplémentaire cellules sont lysées de pas et le pourcentage de mCherry + (vacuolaire) et FITC + / + mCherry (cytosolique) de bactéries est déterminée par FACS. Nous présentons également une adaptation de ce procédé qui peut être utilisé en l'absence de souches exprimant des protéines fluorescentes sont disponibles (Figure 2). Des étapes supplémentaires sont introduites après l'étiquetage FITC dans lequel les cellules sont fixées et complètement perméabilisées. Par la suite, toutes les bactéries sont colorées avec des anticorps anti-Salmonella et des anticorps secondaires correspondantes. Detection se fait alors par microscopie à la place de l'analyse FACS.
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Protocol
1. Digitonine Assay avec mCherry exprimant Salmonella (FACS-base Analyse)
- Préparation des bactéries
Remarque: Salmonella de type sauvage SL1344 (Résistance à la streptomycine) exprimant mCherry partir d'un plasmide (pFPV codant mCherry sous le promoteur de RPSM) est utilisé dans cet essai. Phagocytose bactérienne et la prolifération où pas modifiée par l'expression constitutive de mCherry (données non présentées) 16.- Inoculer la souche 1 jour avant l'infection dans 3 ml de milieu LB additionné de streptomycine (90 ug / ml) et de l'ampicilline (100 ug / ml, vecteur exprimant mCherry) dans un agitateur à 37 ° CO / N.
- Étalement des cellules de l'infection.
- BMDMs de type sauvage de semences dans une plaque à 24 puits à une densité de 1,25 x 10 5 cellules / puits dans 1 ml de milieu de macrophages primaire (DMEM supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal (FCS, inactivé à la chaleur, 56 ° C, 30 min ), 1% HEPES, 1% d'acides aminés non essentiels (AENA), 1% de L-glutamine et 10% L929 surnageant (milieu conditionné à partir de facteur de stimulation des colonies (M-CSF des macrophages) produisant des cellules L929). puits de semences conformément au tableau 1 pour tenir compte des conditions individuelles. Ajouter des lamelles dans les puits utilisés comme témoins (Tableau 1).
- Incuber les cellules pendant une nuit dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2.
| Perméabilisation | Tachant | ||||||
| Lamelle de verre | Salmonella | Digitonine | Saponine | anti-Salmonella | anti-Calnexin | anti-PDI | |
| A1 (échantillon) | - / + * | + | + | + | |||
| A2 (échantillon) | - / + * | + + | + | ||||
| A3 (échantillon) | - / + * | + | + | + | |||
| A4 (pas de contrôle de perméabilisation) | - / + * | + | + | ||||
| A5 (contrôle complet de perméabilisation) | - / + * | + | + | + | |||
| B1 (colorées pour la calnexine) | + | + | |||||
| B2 (colorées pour la calnexine) | + | + | + | ||||
| B3 (colorées pour la calnexine) | + | + | + | ||||
| C1 (coloréespour PDI) | + | + | |||||
| C2 (colorées pour PDI) | + | + | + | ||||
| C3 (colorées pour PDI) | + | + | + | ||||
Tableau 1: Schéma de placage pour les macrophages dérivés de moelle osseuse (BMDMs) dans un format de 24 puits pour une infection ultérieure par la bactérie Salmonella, perméabilisation, et la coloration * Selon que le protocole 1 ou 2 du protocole est fait..
- Préparer les bactéries de l'infection.
- Le jour suivant, déterminer la concentration de Salmonella dans la culture d'une nuit en diluant la culture 1:10 dans du PBS et mesure de la DO 600 contre seulement un témoin PBS. Cela garantit que la DO 600 est mesuré dans le lgamme inear du spectrophotomètre.
- Calculer la concentration de Salmonella par ml. Une DO600 de 1 correspond à 1 x 10 9 bactéries.
- Diluer les bactéries dans un milieu macrophage pour atteindre une concentration de Salmonella de 1,25 x 10 6 cellules / ml.
- L'infection des cellules avec Salmonella.
- Éliminer le milieu de BMDMs. Ajouter 1 ml de milieu de macrophages dans les puits témoins non infectées (B1-B3, C1-C3). Ajouter 1 ml de suspension de Salmonella godets A1 - A5 pour accéder à une multiplicité d'infection (moi) de 10 bactéries par cellule.
- Centrifuger la plaque pendant 15 minutes à 300 xg à 37 ° C pour synchroniser l'infection. Transférer la plaque dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Tuer Salmonella extracellulaire avec la gentamicine.
- À 1 h post-infection, enlever la plaque de l'incubateur et ajouter 0,1 ml de milieu macrophage contenant 0,1 mg / ml de gentamicinepour tuer les bactéries extracellulaires. Ajouter gentamicine à tous les puits, même à des témoins non infectés, afin de garantir que toutes les cellules sont traitées de la même manière. Transférer la plaque dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Lavage des cellules.
- A 2 heures après l'infection, retirez la plaque de l'incubateur et laver tous les puits 2x avec 1 ml de DMEM brut (préchauffé à 37 ° C) et le remplacer par milieu macrophage (préchauffé à 37 ° C) contenant 10 pg / ml Gentamycine pour empêcher la croissance de toutes les bactéries extracellulaires restantes. Transférer la plaque dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Préparation des tampons fraîches avec des détergents et des anticorps.
- Juste avant le point de temps désiré de l'analyse, préparer une solution de pâte fraîche de digitonine à 1 mg / ml dans le tampon KHM (110 mM acétate de potassium, HEPES 20 mM, MgCl2 2 mM, pH 7,3). Filtrer le bouillon et diluer dans KHM tampon à une concentration de travailde 50 pg / ml de digitonine. En outre, préparer une solution à 0,1% de saponine dans du tampon KHM, un anticorps anti-Salmonella couplé au FITC (CSA-1-FITC) à 1/500, anti-calnexine à 1/100 ou anti-PDI à 1/100 dans KHM Tampon complété par 3% de BSA.
- Perméabilisation cellulaire.
- Retirer la plaque de l'incubateur et laver les puits 3x avec 0,5 ml de tampon KHM (préchauffé à 37 ° C). Retirer KHM tampon et ajouter 0,25 ml de tampon plaine KHM aux puits A4 et B1 / C1, KHM tampon avec de la digitonine aux puits A1 - A3 et B2 / C2 ou KHM tampon avec de la saponine à godets A5 et B3 / C3 (selon le tableau 1). Incuber pendant exactement 1 min à température ambiante et laver immédiatement tous les puits 3x avec 0,5 ml de tampon KHM (pré-chauffé à 37 ° C).
- Coloration d'anticorps primaire.
- Retirez le tampon KHM et ajouter les solutions d'anticorps primaires (de chèvre anti Salmonella -FITC, 250 pl / puits, 0,1 pg / ml) dans les puits appropriés (Figure 1 tableau 1). Incuber la plaque pendant 15 min dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Laver les cellules 1x avec 1 ml de PBS.
- Les cellules infectées (puits de A1 - A5): analyse de FACS
- Laver les cellules 3x avec PBS et ajouter 0,5 ml de PBS glacé contenant 0,1% de Triton. Transfert à un tube de 5 ml FACS avec bouchon de crépine de cellules pour briser des agrégats de cellules. Garder les échantillons sur la glace.
- Analyser les échantillons d'un FACS. Utilisation des commandes entièrement perméabilisées, réglez la porte pour le total des bactéries basée sur l'avant et la dispersion latérale (FSC / SSC) en premier, et le signal mCherry (610 nm ± 20 nm de filtre).
- Ensuite, analyser le signal FITC dans la population bactérienne totale en utilisant les contrôles perméabilisées entièrement perméabilisées et non pour régler les portes pour les bactéries cytosoliques (FITC +, mCherry +) et les bactéries vacuolaires (FITC, mCherry +) (Figure 3).
- Avec les portes définies, analyser les échantillons et déterminer le pourcentage de vs cytosoliquevacuolaires bactéries en utilisant le logiciel FlowJo selon le protocole du fabricant.
- Contrôles de perméabilisation non infectées (puits B1 - B3, C1 - C3): microscopie
- Fixation
- Retirer du PBS et ajouter 250 microlitres de PFA 4% dans du PBS. Incuber pendant 10 min à 37 ° C.
- Laver les puits avec 2x 1 ml de PBS et on ajoute 250 ul de 0,1 M de glycine dans du PBS pendant 10 min à étancher le fixateur. Laver les puits avec 2x 1 ml de PBS.
- Coloration d'anticorps secondaire.
- Contrôle de perméabilisation tache pendant une heure à température ambiante avec des anticorps secondaires couplés à des fluorophores appropriés dans du PBS supplémenté avec 0,1% de saponine et 3% de BSA à perméabiliser les cellules pleinement.
- Laver lamelles de 3x avec 1 ml de PBS et le montage des lamelles couvre-objet pour l'analyse dans un milieu de montage avec du DAPI (1,5 ug / ml).
- analyse par microscopie.
- Analyser les lamelles avec les contrôles à un grossissement de 63X 40X ou en utilisant un confocal fluomicroscope rescence. Si la perméabilisation a travaillé, il devrait y avoir aucune coloration pour des cellules non perméabilisées, Calnexin coloration pour les deux cellules et digitonin- saponine perméabilisées et PDI coloration uniquement pour les cellules de saponine perméabilisées (figure 4).
- Fixation
2. Digitonine Assay avec Unlabeled Salmonella (analyse basée Microscopie-)
- Préparation des bactéries pour O / N cultures.
- Inoculer non marqué Salmonella de type sauvage SL1344 (Résistance à la streptomycine) 1 jour avant l'infection dans 3 ml de milieu LB additionné de streptomycine (90 pg / ml) dans un shaker à 37 ° CO / N.
- Étalement des cellules de l'infection.
- BMDMs de semences dans une plaque à 24 puits contenant des lamelles de verre stériles à une densité de 1,25 x 10 5 cellules / puits dans 1 ml de milieu macrophage (DMEM complété avec 10% de sérum de veau foetal (FCS, de-complétés, 56 ° C,30 min), 1% HEPES, 1% des acides aminés L-non-essentiels (NEAA), 1% de L-glutamine et 10% L929 surnageant). puits de semences conformément au tableau 1 pour tenir compte des conditions individuelles.
- Incuber les cellules S / N, dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Préparer les bactéries de l'infection.
- Le jour suivant, déterminer la concentration de Salmonella dans la culture O / N par dilution de la culture 1:10 dans du PBS et mesure de la DO 600 contre seulement un témoin PBS. Cela garantit que la DO 600 est mesurée dans la plage linéaire du spectrophotomètre.
- Déterminer la concentration de Salmonella par millilitre. Une DO 600 de 1 correspond à 1 x 10 9 bactéries.
- Diluer les bactéries dans un milieu macrophage pour atteindre une concentration de Salmonella de 1,25 x 10 6 cellules / ml.
- L'infection des cellules avec Salmonella.
- Centrifuger la plaque pendant 15 minutes à 300 xg à 37 ° C pour synchroniser l'infection. Transférer la plaque dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Tuer Salmonella extracellulaire avec Gentamycin.
- À 1 h post-infection, enlever la plaque de l'incubateur et ajouter 0,1 ml de milieu macrophage contenant 1 mg / ml Gentamycin pour tuer les bactéries extracellulaires à tous les puits. Transférer la plaque dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Lavage des cellules.
- À 2 heures post-infection, enlever la plaque de l'incubateur et laver chaque puits 3x avec 1 ml de milieu macrophage frais contenant 10 pg / ml Pour empêcher la gentamycinela croissance de toutes les bactéries extracellulaires restantes. Transférer la plaque dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Préparation des tampons fraîches avec des détergents et des anticorps.
- Juste avant le point de temps désiré de l'analyse, préparer une solution de pâte fraîche de digitonine à 1 mg / ml dans le tampon KHM (110 mM acétate de potassium, HEPES 20 mM, MgCl2 2 mM, pH 7,3). Filtrer le bouillon et diluer dans KHM tampon à une concentration de travail de 50 pg / ml de digitonine.
- En outre, à préparer une solution de 0,1% de saponine dans du tampon KHM, FITC anti- Salmonella (CSA-1, 0,1 ug / ml), anti-calnexine à 1/100 ou anti-PDI au 1/100 dans du tampon additionné de KHM 3% de BSA (voir le tableau des matériaux pour la concentration d'anticorps).
- Perméabilisation cellulaire.
- Retirer la plaque de l'incubateur et laver les puits 3x avec 0,5 ml de tampon KHM (préchauffé à 37 ° C). Retirer KHM tampon et ajouter 0,25 ml de tampon plaine KHMles puits A4 et B1 / C1, KHM tampon avec de la digitonine à godets A1 - A3 et B2 / C2 ou KHM tampon avec de la saponine à puits A5 et B3 / C3 (selon le tableau 1). Incuber pendant exactement 1 min à température ambiante et laver immédiatement tous les puits 3x avec 0,5 ml de tampon KHM (pré-chauffé à 37 ° C).
- Coloration d'anticorps primaire.
- Retirer le tampon KHM et ajouter les solutions d'anticorps primaire (anticorps de chèvre anti-FITC Salmonella CSA1, 250 ul / puits, 0,1 ug / ml) dans les puits appropriés (figure 2, tableau 1). Incuber la plaque pendant 15 min dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. Laver 3x avec 1 ml de PBS.
- Fixation.
- Retirer du PBS et ajouter 250 microlitres de PFA 4% dans du PBS. Incuber pendant 10 min à 37 ° C.
- Laver les puits avec 2x 1 ml de PBS et on ajoute 250 ul de 0,1 M de glycine dans du PBS pendant 10 min à étancher le fixateur. Laver les puits avec 2x 1 ml de PBS.
- TotalSalmonella coloration des échantillons infectés.
- Laver lamelles de 3x avec PBS avec 0,1% de saponine / 3% de SAB et les échantillons incuber avec un anticorps anti-CSA1 (chèvre anti-CSA1, 0,1 ug / ml, souris anti-LPS fonctionne aussi bien, 0,1 ug / ml) pendant 1 heure à température ambiante dans du PBS avec 0,1% de saponine / 3% de SAB.
- Laver 3x dans PBS avec 0,1% de saponine / 3% de BSA. Incuber vos échantillons avec un anticorps secondaire anti-chèvre couplé à un fluorophore de choix dans de la PBS avec 0,1% de saponine / 3% de SAB pendant 30 minutes à température ambiante dans l'obscurité.
- Laver lamelles de 3x avec 1 ml de PBS et le montage des lamelles couvre-objet pour l'analyse dans un milieu de montage avec du DAPI (1,5 ug / ml).
- analyse par microscopie.
- Acquérir des données avec un microscope confocal en comptant Salmonella cytosolique (anti-Salmonella -FITC positif) et le total Salmonella (positive double) (Figure 5). contrôles de perméabilisation devraient montrer: pas de coloration pour les cellules non perméabilisées, Calnexin scontenant des cellules perméabilisées digitonine-PDI et la coloration pour des cellules de saponine perméabilisées (figure 4). Wells A4 et A5 se servir de témoins internes pour la coloration Salmonella.
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Representative Results
Figure 1 et la Figure 2 montrent les schémas de l'essai de digitonine décrites dans le protocole 1 et 2 du protocole illustrant les étapes critiques dans le protocole et les résultats obtenus. La figure 3 montre des résultats typiques FACS. Les contrôles positifs et négatifs sont utilisés pour définir les portes pour mCherry + / bactéries (FITC vacuolaire Salmonella) et mCherry + / FITC + bactéries Salmonella (cytosolique). Sur la base de ces portes, le pourcentage de bactéries cytosoliques et vacuolaires peut être déterminée dans les échantillons expérimentaux. Dans cet exemple, nous avons comparé de type sauvage et ΔsifA Salmonella. La figure 3 montre des données représentatives obtenues avec mCherry + Salmonella typhimurium de type sauvage et un mutant ΔsifA en os macrophages murins dérivées de la moelle. La figure 4 montre l'Calnexin habituel (A) et le PDI (B) la coloration que l'on obtient dans les contrôles perméabilisation tréé avec de la digitonine ou la saponine. Depuis Calnexin est une protéine de membrane du RE, Calnexin coloration peut être vu à travers le cytosol et dans le noyau dans les deux cellules et digitonin- saponine perméabilisées. Dans les contrôles perméabilisées digitonine aucune coloration de PDI (ER lumen) est visible, tandis que la coloration peut être observée dans les cellules de saponine perméabilisées. La figure 5A représente résultat de la coloration anti-Salmonella dans les cellules qui ont été perméabilisées avec de la digitonine. Nombre de bactéries sont en rouge, tandis que les bactéries cytosoliques sont en vert (colorées avec anti-Salmonella FITC). La population FITC-positifs sont Salmonella avec un accès vers le cytosol, tandis que la population FITC-négative sont des bactéries qui résidaient en Salmonella intacte contenant vacuole (SCV) et ont donc été protégés de l'étiquetage Salmonella -FITC. Nous avons également comparé type sauvage Salmonella à une souche mutante ΔsifA. Depuis SIFA est nécessaire pour Salmonella pour maintenir SL'intégrité CV un pourcentage accru de Salmonella est cytosolique. Sur la figure 5B on montre un contrôle, dans lequel les cellules ont été perméabilisées digitonine pas avant d'ajouter FITC anti- Salmonella. Par conséquent, aucune bactérie de FITC-positifs peuvent être vus.
Figure 1. Représentation schématique du protocole 1. Les cellules infectées contenant Salmonella mCherry positif soit dans les vacuoles intactes ou le cytosol sont différemment perméabilisée avec de la digitonine. Cytosolique Salmonella sont colorées avec anti-Salmonella couplé à FITC. Les cellules sont lavées et lysées avec du Triton X-100 pour l'analyse FACS. Cellules témoins négatives ne sont pas perméabilisées, tandis que les cellules témoins positifs sont complètement perméabilisées avant la coloration des anticorps.
Figure 2. Représentation schématique du protocole 2. Les cellules infectées contenant Salmonella non marquée soit dans les vacuoles intactes ou le cytosol sont différemment perméabilisée avec de la digitonine. Cytosolique Salmonella sont colorées avec anti-Salmonella couplé à FITC. Les cellules sont lavées et fixées avec 4% de PFA. Les cellules sont complètement permeabilzed et colorées avec des anticorps anti-Salmonella, suivie par coloration avec des anticorps secondaires couplés à Alexa 568. Microscopie est utilisé pour compter FITC + / Alexa568 + Salmonella (cytosolique) et Alexa568 + Salmonella (vacuolaire).
Figure 3. FACS analyse des échantillons entièrement perméabilisées, perméabilisées unpermeabilized ou différentielles infecté pendant 6 heures avec mCherry + de type sauvage ou & #916; SIFA Salmonella pendant 6 heures.
Figure 4. Anti-Calnexin (A) et anti-PDI (B) de coloration non infectées BMDMs perméabilisées avec de la digitonine ou la saponine. Barres d'échelle 10 um.
Figure 5. Des images représentatives d'une perméabilisation dosage différentiel avec Salmonella typhimurium de type sauvage et la souche mutante ΔsifA à 6 heures post-infection. Cytosolique Salmonella et Salmonella totale sont indiqués. Les cellules ont été perméabilisées digitonine soit (A) ou unpermeabilized gauche (B) avant coloration avec du FITC anti-Salmonella Salmonella pour cytosolique. Après cette étape de coloration, caunes ont été perméabilisées avec de la saponine et totale Salmonella ont été colorées avec des anticorps anti-Salmonella suivie d'une coloration d'anticorps secondaire (rouge). Échelle barres 10 um.
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Discussion
Perméabilisation différentiel est une méthode simple et robuste pour analyser et de quantifier la distribution subcellulaire des bactéries pathogènes entre les compartiments vacuolaires et le cytosol. Le même essai a été utilisé avec succès par des bactéries telles que Francisella novicida 2,4 et 12 Shigella flexneri. Cependant, étant donné que beaucoup pathogène intracellulaire altérer ou modifier les structures endomembranaires d'accueil, la robustesse de la perméabilisation de digitonine devra être déterminée sur une base individuelle. Fine-tuning de l'essai par rapport à la ligne de l'agent pathogène ou de la cellule utilisée pourrait être nécessaire. Le test ne se limite pas à l'infection de la biologie, mais peut également être utilisé pour d'autres applications biologiques cellule qui, comme la signalisation apoptotique 17,18.
La clé de ce test est que la membrane plasmique et une membrane intracellulaire ont une composition lipidique différente, en particulier les membranes intracellulaires contiennent moins choLESTEROL. Digitonine cholestérol peut donc complexe et conduit à une différence de perméabilisation, l'efficacité et la sélectivité de ce qui dépend de la durée de traitement la digitonine et la concentration du détergent. Pour contrôler cela, il est important de vérifier les cellules perméabilisées par coloration pour les protéines marqueurs avec localisation intracellulaire définis, tels que la queue cytosolique de calnexine ou le PDI ER protéine luminale.
Alors que perméabilisation différentiel est pas nouveau, ce protocole permet en outre une quantification rapide et objectif de bactéries cytosoliques et vacuolaires basé sur FACS. Pour l'analyse FACS, il est important d'inclure deux commandes, qui sont des cellules non-perméabilisées et entièrement perméabilisées. Basé sur ces échantillons de contrôle des portes pour tache et entièrement teinté dire vacuolaire et les bactéries cytosoliques seront fixés.
Une étape cruciale de la perméabilisation est le protocole et les étapes de lavage ultérieures. Frdes solutions tampons et de détergents eshly préparées doivent être utilisées. Toutes les solutions doivent être préparer juste avant l'utilisation. Un autre point critique est le moment de la perméabilisation. Voici 1 min à une concentration de digitonine de 50 pg / ml a donné de bons résultats pour la moelle osseuse macrophages dérivés. Lors de l'utilisation des lignées cellulaires différentes, la concentration de travail pourrait avoir besoin d'être déterminée de manière empirique. Des concentrations élevées de digitonine ou incubation fois plus de 1 min peuvent conduire à la perméabilisation des membranes internes, et des résultats faussement positifs. Digitonine solutions ne sont stables pour les 1 - 2 h. Préparer une solution fraîche de digitonine juste avant est absolument essentiel. En outre la capacité de la digitonine à permeabilze membranes peuvent varier d'un lot à l'autre et entre les différents fournisseurs.
Par conséquent, si de nombreux échantillons doivent être traités, il est conseillé de diviser ceux-ci en petits groupes qui peuvent être traités rapidement et facilement. Enfin, toutes les étapes de lavage après la permeabilization besoin d'être fait très soigneusement car le traitement digitonine affaiblit les membranes cellulaires. L'addition d'un tampon et de l'aspiration doit être effectuée doucement sur le côté du puits et non au milieu du puits.
Comme l'a souligné, d'autres techniques pour analyser la distribution subcellulaire de bactéries entre le cytosol et compartiments vacuolaires existent, comme l'utilisation du clivage b-lactamase FRET journaliste CCF4-AM 19. Bien que la méthode CCF4-AM offrent l'avantage de mesurer la rupture vacuolaire en temps réel, il lui manque la résolution au niveau de la bactérie unique et ne peut fournir des informations sur le niveau de la cellule hôte unique. Ainsi, une combinaison des deux tests est idéal pour obtenir des informations sur les niveaux de cellules de bactéries / d'accueil célibataires de plus de temps. Fait important, les dosages peuvent être utilisés non seulement dans le contexte des infections bactériennes, mais aussi dans le contexte d'autres études biologiques cellulaires qui visent à déterminer la localisation sub-cellulaire de la cible proteins 18.
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Acknowledgments
Nous tenons à remercier Mathias S. Dick, Roland F. Dreier et Sebastian Rühl de discussion. Ce travail a été soutenu par un professeur FNS PP00P3_139120 / 1 et une Université de Bâle subvention de projet ID2153162 à PB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digitonin | Sigma | D5628 | 50 μg/ml |
| PFA | mpbio | 219998380 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630 | |
| Potassium Acetate | Sigma | 791733 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| anti-Salmonella CSA-1-FITC | KPL | 01-91-99-MG | 1/500 |
| anti-Salmonella CSA-1 | KPL | 02-91-99-MG | 1/500 |
| anti-Calnexin | Enzo Lifesciences | SPA-860D | 1/100 |
| anti-PDI | Enzo Lifesciences | SPA-890 | 1/100 |
| Saponin | Sigma | 47036 | |
| Vectashield mounting medium | Vectorlabs | H-1200 | |
| Anti Rabbit antibody-488 | Molecular Probes | A-11070 | 1/500 |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15710-49 | 100 μg/ml and 10 μg/ml |
| Triton X-100 | Promega | H5141 | |
| PBS | Gibco | 20012-019 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| NEAA | Amimed | 5-13K00-H | |
| LSM700 Confocal microscope | Zeiss | imaging done at 63X | |
| FACS Fortessa | BD technologies | detection mCherry 610 nm | |
| FACS Fortessa | BD technologies | detection FITC 530 nm |
References
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