Abstract
Batteri patogeni intracellulari possono replicarsi nel citosol o in vacuoli-patogeni contenenti specializzati (PCV). Per raggiungere il citosol, batteri come Shigella flexneri e Francisella novicida devono indurre la rottura del phagosome. Al contrario, Salmonella typhimurium replica in un vano vacuolare, conosciuto come Salmonella vacuole -contenenti (SCV). Tuttavia alcuni mutanti di Salmonella non riescono a mantenere l'integrità SCV e sono quindi rilasciate nel citoplasma. La percentuale di citosolico contro batteri vacuolare a livello di singoli batteri può essere misurata permeabilizzazione differenziale, noto anche come test fagosoma protezione. L'approccio fa uso della proprietà di detersivo digitonina di legarsi selettivamente colesterolo. Poiché la membrana plasmatica contiene più colesterolo che altre membrane cellulari, digitonina può essere utilizzato per permeabilize selettivamente la membrana plasmatica lasciando membrane intracellulariintatto. In breve, dopo l'infezione con l'agente patogeno che esprimono una proteina marcatore fluorescente (es mCherry tra gli altri), la membrana plasmatica delle cellule ospiti è permeabilizzate con una breve incubazione in digitonina contenente tampone. Le cellule vengono quindi lavate ed incubate con un anticorpo primario (accoppiato ad un fluoroforo di scelta) diretto contro il batterio di scelta (ad esempio anti-Salmonella -FITC) e nuovamente lavati. Se si utilizzano i batteri non marcati, un passaggio aggiuntivo può essere fatto, in cui tutte le membrane vengono permeabilizzate e tutti i batteri colorate con un anticorpo corrispondente. Dopo la colorazione, la percentuale di vacuolari e citosolici batteri può essere quantificata mediante FACS o microscopia contando eventi singoli o doppi-positive. Qui forniamo dettagli sperimentali per l'uso di questa tecnica con il batterio Salmonella typhimurium. Il vantaggio di questo saggio è che, a differenza di altre analisi, fornisce una quantificazione del livello di singola bacteria, e se analizzata al microscopio fornisce il numero esatto di citosolico e batteri vacuolari in una data cellula.
Introduction
Batteri patogeni intracellulari replicano direttamente nel citoplasma della cellula ospite, o in scomparti vacuolari specializzati 1. Durante la fase iniziale dell'infezione maggior patogeni vengono internalizzati mediante fagocitosi da cellule specializzate (come macrofagi) o promuovendo attivamente il proprio assorbimento nelle cellule non fagocitiche. Nelle cellule fagocitiche, phagosome normalmente fonde con lisosomi per formare un vano degradativa, dove vengono digeriti particelle fagocitati. Batteri citosolici specializzati, come ad esempio Francisella novicida o Shigella flexneri, fuga degrado phagosomal inducendo la rottura del phagosome e successivamente fuga nel 2,3 citoplasma. Ciò richiede meccanismo di virulenza associata come la Francisella patogenicità Island (FPI) o la Shigella flexneri T3SS, che inietta le proteine effettrici che promuovono vacuolar rottura 2-4. Le caratteristiche citosol della cellula ospiteun numero di recettori pattern recognition conservati che normalmente riconoscono la presenza di agenti patogeni e inducono immunitaria innata segnalazione 5. Inoltre, xenophagy, una forma antimicrobica dell'autofagia può degradare batteri che entrano nel citosol. Batteri citosoliche sono normalmente ben adattati per smussare o aggirare queste risposte utilizzando diverse strategie. Ad esempio, Francisella modifica le sue LPS per non farsi riconoscere host e Shigella impedisce l'autofagia reclutamento utilizzando secrete proteine effettrici 6,7.
Un'altra strategia per sfuggire degradazione lisosomiale è impiegato dal modello vacuolare patogeno Salmonella enterica sierotipo Typhimurium, di seguito la Salmonella typhimurium. Salmonella utilizza un T3SS per iniettare effettori che rimodellano phagosome iniziale in sua nicchia intracellulare, la Salmonella -contenenti vacuolo (SCV) 8,9. Manipolazione continua di percorsi di accoglienza ènecessaria per mantenere questo vacuolo attraverso l'assunzione di lipidi e altre sostanze nutritive per il vacuolo. In effetti, un mutante Sifa di Salmonella non riesce a mantenere la stabilità vacuolar, ed entra nel citoplasma delle cellule ospiti poche ore dopo l'infezione, che si traduce nell'attivazione di percorsi immunitario innato e l'autofagia reclutamento 8. Fuga vacuolare di Salmonella varia a seconda del tipo di cellula che gli studi e numerose relazioni hanno dimostrato che nelle cellule epiteliali anche WT Salmonella può sfuggire la SCV e hyperreplicate nel citosol 10. Recenti rapporti indicano che la diagnosi immunitario innato di patogeni vacuolari dipende anche dalla capacità di accoglienza di riconoscere e destabilizzare vacuoli da organismi patogeni che contiene (PCV) 11-14.
Dato che sia l'host o batteri genotipo possono influenzare la distribuzione dei batteri intracellulari tra vacuolare e compartimento citosolico, è necessario quantificare il numero di vacuolare vs.batteri citosolici. Poiché, in configurazioni più sperimentali cellule ospiti sono infettate con più di un batterio, e successivamente può ospitare diversi batteri in differenti compartimenti subcellulari, è necessaria una tecnica che consente la quantificazione del livello di singoli batteri. Permeabilizzazione differenziale (noto anche come test di protezione phagosomal) fornisce la presente risoluzione 2,4,10,12. Il saggio si basa sulla permeabilizzazione selettiva della membrana plasmatica della cellula ospite con la digitonina detersivo, che lascia membrane vacuolare intatta e consente così la colorazione selettiva di batteri citosolici con anticorpi. Qui forniamo due protocolli per la quantificazione dei citosolica e vacuolare Salmonella typhimurium con permeabilizzazione differenziale. Il principio di questo metodo è descritto nella Figura 1: di midollo osseo macrofagi derivati (BMDMs) sono infettati con fase stazionaria mCherry esprimono Salmonella. Fase stazionaria Salmonella bisogno to essere utilizzato in quanto downregulate l'espressione della SPI-1 T3SS, la cui attività sarebbe altrimenti essere riconosciuto dal inflammasome NLRC4 e indurre la morte delle cellule rapido (pyroptosis) del BMDMs 15. Dopo l'infezione le cellule sono lavate e trattati con 50 ug / ml di digitonina per 1 minuto. Le cellule vengono nuovamente lavati immediatamente e incubate con anticorpi anti-Salmonella accoppiati a FITC marcare batteri con accesso al citosol. Dopo un ulteriore lavaggio cellule passo vengono lisate e la percentuale di batteri mCherry + (vacuolare) e FITC + / + mCherry (citosolica) è determinata da FACS. Riportiamo anche un adattamento di questo metodo che può essere utilizzato se non ceppi proteine esprimono fluorescenti sono disponibili (Figura 2). I passaggi aggiuntivi vengono introdotte dopo l'etichettatura FITC in cui le cellule sono fissi e completamente permeabilizzate. Successivamente tutti i batteri sono macchiati con anticorpi anti-Salmonella e anticorpi secondari corrispondenti. Detezione viene poi eseguita al microscopio invece di analisi FACS.
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Protocol
1. Digitonin Assay con mCherry esprimono Salmonella (FACS-based Analysis)
- Batteri Preparazione
Nota: Salmonella wild-type SL1344 (streptomicina resistente) che esprime mCherry da un plasmide (pFPV codifica mCherry sotto il promotore RPSM) viene utilizzato in questo test. Fagocitosi batterica e la proliferazione in cui non alterata dalla espressione costitutiva di mCherry (dati non riportati) 16.- Inoculare il ceppo 1 giorno prima della infezione in 3 ml di terreno LB addizionato con streptomicina (90 mg / ml) e ampicillina (100 ug / ml, mCherry esprimendo vettore) in un agitatore a 37 ° CO / N.
- Placcatura cellule per l'infezione.
- Seed wild-type BMDMs in un piatto ben 24 con una densità di 1,25 x 10 5 cellule / pozzetto in 1 ml di terreno macrofagi primaria (DMEM supplementato con 10% di siero fetale bovino (FCS, inattivato al calore, 56 ° C, 30 min ), 1% HEPES, 1% di aminoacidi non essenziali (NEAA), 1% di L-glutammina e il 10% L929 surnatante (medium condizionato da macrofagi fattore stimolante le colonie (M-CSF) che producono cellule L929). Pozzi seme secondo la tabella 1 per tenere conto di condizioni individuali. Aggiungere coprioggetto ai pozzetti utilizzati come controlli (Tabella 1).
- Incubare le cellule durante la notte in un incubatore a 37 ° C e 5% CO 2.
| Permeabilization | Colorazione | ||||||
| Vetrino di vetro | Salmonella | Digitonin | Saponina | anti-Salmonella | anti-calnexina | anti-PDI | |
| A1 (campione) | - / + * | + | + | + | |||
| A2 (campione) | - / + * | + + | + | ||||
| A3 (campione) | - / + * | + | + | + | |||
| A4 (nessun controllo permeabilizzazione) | - / + * | + | + | ||||
| A5 (controllo completo permeabilizzazione) | - / + * | + | + | + | |||
| B1 (colorate per calnexina) | + | + | |||||
| B2 (colorate per calnexina) | + | + | + | ||||
| B3 (colorate per calnexina) | + | + | + | ||||
| C1 (macchiatoper PDI) | + | + | |||||
| C2 (colorate per PDI) | + | + | + | ||||
| C3 (colorate per PDI) | + | + | + | ||||
Tabella 1: schema di placcatura per midollo osseo macrofagi derivati (BMDMs) in un formato a 24 pozzetti per la successiva infezione da Salmonella, permeabilizzazione, e la colorazione * A seconda se protocollo 1 o il protocollo 2 è fatto..
- Preparare i batteri per l'infezione.
- Il giorno successivo, determinare la concentrazione di Salmonella nella cultura overnight diluendo cultura 1:10 in PBS e misurando la OD 600 contro un unico controllo PBS. Questo assicura che la OD 600 è misurata nella lgamma inear dello spettrofotometro.
- Calcolare la concentrazione di Salmonella per ml. Un OD600 di 1 corrisponde a 1 x 10 9 batteri.
- Diluire i batteri in media macrofagi per raggiungere una concentrazione di Salmonella 1,25 x 10 6 cellule / ml.
- L'infezione di cellule con Salmonella.
- Rimuovere media da BMDMs. Aggiungere 1 ml di terreno macrofagi di pozzetti di controllo non infetti (B1-B3, C1-C3). Aggiungere 1 ml di sospensione Salmonella nei pozzetti A1 - A5 per raggiungere una molteplicità di infezione (moi) di 10 batteri per cellula.
- Centrifugare la piastra per 15 min a 300 xg a 37 ° C per sincronizzare l'infezione. Trasferire la lastra in un incubatore a 37 ° C e 5% CO 2.
- Uccidere Salmonella extracellulare con Gentamicina.
- A 1 ora dopo l'infezione, rimuovere la piastra da incubatore e aggiungere 0,1 ml di terreno macrofagi contenenti 0,1 mg / ml Gentamicinaper uccidere i batteri extracellulari. Aggiungere gentamicina a tutti i pozzetti, anche ai controlli non infetti, per garantire che tutte le cellule sono trattate nello stesso modo. Trasferire la lastra in un incubatore a 37 ° C e 5% CO 2.
- Lavare le cellule.
- A 2 ore dopo l'infezione, rimuovere piatto da incubatore e lavare tutti i pozzetti 2x con 1 ml di DMEM pianura (pre-riscaldato a 37 ° C) e sostituirlo con media macrofagi (pre-riscaldato a 37 ° C), contenente 10 mg / ml Gentamycin per prevenire la crescita di tutte le rimanenti batteri extracellulari. Trasferire la lastra in un incubatore a 37 ° C e 5% CO 2.
- Preparazione tamponi freschi con detergenti e anticorpi.
- Poco prima del punto di tempo desiderato di analisi, preparare una soluzione madre fresco digitonina a 1 mg / ml in KHM Buffer (acetato di potassio 110 mM, HEPES 20 mM, MgCl 2 2 mM, pH 7,3). Filtrare il brodo e diluire in KHM tampone a una concentrazione di lavorodi 50 mg / ml di digitonina. Inoltre, preparare una soluzione di 0,1% in saponina KHM Buffer, anti-anticorpo Salmonella accoppiato al FITC (CSA-1-FITC) a 1/500, anti-calnexin a 1/100 o anti-PDI a 1/100 in KHM Buffer integrato con 3% BSA.
- Permeabilizzazione cellulare.
- Rimuovere la piastra da incubatore e lavare i pozzetti 3x con 0,5 ml di KHM Buffer (pre-riscaldato a 37 ° C). Rimuovere KHM Buffer e aggiungere 0,25 ml pianura KHM tampone ai pozzetti A4 e B1 / C1, KHM tampone con digitonina nei pozzetti A1 - A3 e B2 / C2 o KHM tampone con saponina di pozzi A5 e B3 / C3 (secondo la tabella 1). Incubare per esattamente 1 minuti a temperatura ambiente e immediatamente lavare tutti i pozzetti 3x con 0,5 ml di KHM Buffer (pre-riscaldato a 37 ° C).
- Colorazione anticorpo primario.
- Rimuovere il tampone KHM e aggiungere le soluzioni di anticorpo primario (capra anti- Salmonella -FITC, 250 microlitri / bene, 0.1 mg / ml) per i pozzetti (Figura 1 Tabella 1). Incubare la piastra per 15 minuti in un incubatore a 37 ° C e 5% CO 2.
- Lavare le cellule 1x con 1 ml di PBS.
- Cellule infettate (pozzi A1 - A5): analisi FACS
- Lavare le cellule 3x con PBS e aggiungere 0,5 ml di ghiacciata PBS contenente 0,1% Triton. Trasferire in una provetta 5 ml FACS con tappo colino cella per rompere aggregati di cellule. I campioni in ghiaccio.
- Analizzare i campioni di un FACS. Utilizzando i controlli completamente permeabilizzate, impostare la porta per i batteri totali basati su avanti e scatter laterale (FSC / SSC) in primo luogo, e il segnale mCherry (610 nm ± 20 nm filtro).
- Avanti, analizzare il segnale FITC nella popolazione batterica totale utilizzando i controlli permeabilizzate completamente permeabilizzate e non per impostare le porte per i batteri citosoliche (FITC +, mCherry +) e batteri vacuolari (FITC, mCherry +) (Figura 3).
- Con impostare le porte, analizzare i campioni e determinare la percentuale di rispetto citosolicobatteri vacuolari utilizzando il software FlowJo secondo il protocollo del produttore.
- Controlli permeabilizzazione non infette (pozzi B1 - B3, C1 - C3): microscopia
- Fissazione
- Rimuovere PBS e aggiungere 250 ml di PFA 4% in PBS. Incubare per 10 minuti a 37 ° C.
- Lavare i pozzetti 2x con 1 ml di PBS e aggiungere 250 ml di 0,1 M glicina in PBS per 10 minuti per placare il fissativo. Lavare i pozzetti 2x con 1 ml di PBS.
- Colorazione anticorpo secondario.
- Controlli permeabilizzazione colorare per 1 ora a RT con appropriati anticorpi secondari accoppiati a fluorofori in PBS integrato con 0,1% saponina e 3% BSA a cellule completamente permeabilize.
- Lavare coprioggetto 3x con 1 ml di PBS e montare le lamelle per analisi a mezzo di montaggio con DAPI (1,5 mg / ml).
- Analisi Microscopia.
- Analizzare i coprioggetti con i controlli a 63X di ingrandimento 40X o utilizzando un fluo confocaleMicroscopio rescence. Se la permeabilizzazione ha funzionato, non ci dovrebbe essere alcuna colorazione per le cellule non-permeabilizzate, calnexina colorazione per entrambe le celle digitonin- e saponina-permeabilizzate e PDI colorazione solo per le celle saponina permeabilizzate (Figura 4).
- Fissazione
2. Digitonin Assay con Unlabeled Salmonella (Analisi basata Microscopia-)
- Preparazione batteri per O / N culture.
- Seminare senza etichetta Salmonella wild-type SL1344 (streptomicina resistente) 1 giorno prima della infezione in 3 ml di terreno LB addizionato con streptomicina (90 mg / ml) in un agitatore a 37 ° CO / N.
- Placcatura cellule per l'infezione.
- BMDMs seme in un piatto ben 24 contenente vetrini sterili ad una densità di 1,25 x 10 5 cellule / pozzetto in 1 ml di terreno macrofagi (DMEM integrato con il 10% di siero fetale bovino (FCS, de-integrato, 56 ° C,30 min), 1% HEPES, 1% acidi L-non-essenziale amino (NEAA), 1% L-glutammina e il 10% L929 surnatante). Pozzi seme secondo la tabella 1 per tenere conto di condizioni individuali.
- Incubare le cellule O / N in un incubatore a 37 ° C e 5% CO 2.
- Preparare i batteri per l'infezione.
- Il giorno dopo, a determinare la concentrazione di Salmonella nella / cultura O N diluendo la cultura 1:10 in PBS e misurando l'OD 600 nei confronti di un solo controllo PBS. Questo assicura che la OD 600 è misurato nel range lineare dello spettrofotometro.
- Determinare la concentrazione di Salmonella per millilitro. Un OD 600 di 1 corrisponde a 1 x 10 9 batteri.
- Diluire i batteri in media macrofagi per raggiungere una concentrazione di Salmonella 1,25 x 10 6 cellule / ml.
- L'infezione di cellule con Salmonella.
- Centrifugare la piastra per 15 min a 300 xg a 37 ° C per sincronizzare l'infezione. Trasferire la lastra in un incubatore a 37 ° C e 5% CO 2.
- Uccidere Salmonella extracellulare con Gentamicina.
- A 1 ora dopo l'infezione, rimuovere la piastra da incubatore e aggiungere 0,1 ml di terreno macrofagi contenenti 1 mg / ml di gentamicina per uccidere i batteri extracellulari tutti i pozzetti. Trasferire la lastra in un incubatore a 37 ° C e 5% CO 2.
- Lavare le cellule.
- A 2 ore dopo l'infezione, rimuovere la piastra da incubatore e lavare i pozzetti 3x con 1 ml di mezzo fresco macrofagi contenente 10 mg / ml Gentamycin evitarela crescita di tutte le rimanenti batteri extracellulari. Trasferire la lastra in un incubatore a 37 ° C e 5% CO 2.
- Preparazione tamponi freschi con detergenti e anticorpi.
- Poco prima del punto di tempo desiderato di analisi, preparare una soluzione madre fresco digitonina a 1 mg / ml in KHM Buffer (acetato di potassio 110 mM, HEPES 20 mM, MgCl 2 2 mM, pH 7,3). Filtrare il brodo e diluire in KHM tampone a una concentrazione di lavoro di 50 mg / ml di digitonina.
- Inoltre, preparare una soluzione di 0,1% in saponina KHM Buffer, anti- Salmonella -FITC (CSA-1, 0,1 mg / ml), anti-calnexin a 1/100 o anti-PDI a 1/100 in KHM Buffer integrato con 3% di BSA (vedi tabella materiali per la concentrazione di anticorpi).
- Permeabilizzazione cellulare.
- Rimuovere la piastra da incubatore e lavare i pozzetti 3x con 0,5 ml di KHM Buffer (pre-riscaldato a 37 ° C). Rimuovere KHM Buffer e aggiungere 0,25 ml pianura KHM Bufferper pozzi A4 e B1 / C1, KHM Buffer con digitonina nei pozzetti A1 - A3 e B2 / C2 o KHM tampone con saponina di pozzi A5 e B3 / C3 (secondo la tabella 1). Incubare per esattamente 1 minuti a temperatura ambiente e immediatamente lavare tutti i pozzetti 3x con 0,5 ml di KHM Buffer (pre-riscaldato a 37 ° C).
- Colorazione anticorpo primario.
- Rimuovere il tampone KHM e aggiungere le soluzioni di anticorpo primario (capra anti- Salmonella CSA1-FITC, 250 microlitri / bene, 0.1 mg / ml) per i pozzetti (Figura 2, Tabella 1). Incubare la piastra per 15 minuti in un incubatore a 37 ° C e 5% CO 2. Lavare 3x con 1 ml di PBS.
- Fissazione.
- Rimuovere PBS e aggiungere 250 ml di PFA 4% in PBS. Incubare per 10 minuti a 37 ° C.
- Lavare i pozzetti 2x con 1 ml di PBS e aggiungere 250 ml di 0,1 M glicina in PBS per 10 minuti per placare il fissativo. Lavare i pozzetti 2x con 1 ml di PBS.
- TotaleSalmonella colorazione dei campioni infetti.
- Lavare 3x coprioggetto con PBS con 0,1% saponina / 3% BSA e incubare i campioni con un anticorpo anti-CSA1 (capra anti-CSA1, 0,1 mg / ml, topo anti-LPS funziona pure, 0,1 mg / ml) per 1 ora a RT in PBS con 0,1% saponina / 3% BSA.
- Lavare 3x in PBS con 0,1% saponina / 3% BSA. Incubare i campioni con un anticorpo anti-capra secondario accoppiato al fluoroforo di scelta in PBS con 0,1% saponina / 3% BSA per 30 minuti a RT al buio.
- Lavare coprioggetto 3x con 1 ml di PBS e montare le lamelle per analisi a mezzo di montaggio con DAPI (1,5 mg / ml).
- Analisi Microscopia.
- Acquisire dati con un microscopio confocale contando Salmonella citosolica (anti-Salmonella -FITC positivo) e totale Salmonella (doppia positivo) (Figura 5). Controlli permeabilizzazione dovrebbe mostrare: nessuna colorazione per le cellule non-permeabilizzate, calnexina scontenente per le cellule permeabilizzate con digitonina e PDI colorazione per le celle saponina permeabilizzate (Figura 4). Wells A4 e A5 serviranno controlli interni per la colorazione Salmonella.
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Representative Results
Figura 1 e Figura 2 mostra gli schemi del test digitonina descritti nel protocollo 1 e 2 del protocollo che illustrano le fasi critiche del protocollo e dei risultati ottenuti. La figura 3 mostra tipici FACS risultati. I controlli positivi e negativi vengono utilizzati per impostare le porte per mCherry + / batteri FITC (vacuolar Salmonella) e mCherry + / FITC + batteri (citosolico Salmonella). Sulla base di queste porte la percentuale di batteri citosolici e vacuolari può essere determinata nei campioni sperimentali. In questo esempio abbiamo confrontato wild-type e ΔsifA Salmonella. La figura 3 mostra i dati rappresentativi ottenuti con mCherry + Salmonella typhimurium wild-type e mutante ΔsifA in midollo osseo macrofagi murini. Figura 4 mostra la solita calnexina (A) e PDI (B) colorazione che si ottiene in permeabilizzazione controlli treated con digitonina o saponina. Poiché calnexina è una proteina di membrana ER, calnexina colorazione può essere visto in tutto il citoplasma e attorno al nucleo in entrambe le celle digitonin- e saponina permeabilizzate. In digitonina controlli permeabilizzate alcuna colorazione PDI (ER lumen) è visibile, mentre la colorazione può essere osservato in cellule di saponina permeabilizzate. Figura 5A mostra Salmonella anti- risultato colorazione in cellule che sono state permeabilizzate con digitonina. Totale batteri sono in rosso, mentre i batteri citosolici sono in verde (colorato con anti- Salmonella -FITC). La popolazione FITC-positivi sono Salmonella con accesso al citosol, mentre la popolazione FITC-negativi sono batteri che risiedevano in un Salmonella intatto -contenenti vacuoli (SCV) e sono quindi protetti da etichettatura Salmonella -FITC. Abbiamo anche confrontato wild-type di Salmonella di un ceppo mutante ΔsifA. Poiché SIFA è necessario per mantenere la Salmonella SIntegrità CV un aumento della percentuale di Salmonella è citosolico. In Figura 5B mostriamo un controllo, in cui le cellule non sono state Digitonin permeabilizzate prima di aggiungere anti- Salmonella -FITC. Di conseguenza, nessun batteri FITC-positivi può essere visto.
Figura 1. Rappresentazione schematica di protocollo 1. Le cellule infettate contenenti Salmonella mCherry positivo sia in vacuoli intatte o citoplasma sono differenziale permeabilizzate con digitonina. Citosolico Salmonella sono macchiati con anti- Salmonella accoppiato al FITC. Le cellule sono lavate e lisate con Triton X-100 per l'analisi FACS. Cellule di controllo negativi non sono permeabilizzate, mentre le cellule di controllo positivo sono completamente permeabilizzate prima colorazione anticorpale.
Figura 2. Rappresentazione schematica di protocollo 2. cellule infette contenenti Salmonella non marcato sia in vacuoli intatte o citoplasma sono differenziale permeabilizzate con digitonina. Citosolico Salmonella sono macchiati con anti- Salmonella accoppiato al FITC. Le cellule vengono lavate e fissate con 4% PFA. Le cellule sono completamente permeabilzed e colorate con anticorpi anti-Salmonella, seguita dalla colorazione con anticorpi secondari accoppiati a Alexa 568. Microscopia viene utilizzato per contare FITC + / Alexa568 + Salmonella (citosolica) e Alexa568 + Salmonella (vacuolare).
Figura 3. FACS analisi completamente permeabilizzate, campioni permeabilizzate unpermeabilized o modo differenziale infettato per 6 ore con mCherry + wild-type o & #916; SIFA Salmonella per 6 ore.
Figura 4. Anti-calnexina (A) e anti-PDI (B) colorazione di BMDMs non infetti permeabilizzate con digitonina o saponina. Barre di scala 10 micron.
Figura 5. Immagini rappresentative di permeabilizzazione test differenziale con Salmonella typhimurium wild-type e il ceppo mutante ΔsifA a 6 ore dopo l'infezione. Citosolico Salmonella e Salmonella totale sono indicati. Le cellule erano o digitonina permeabilizzate (A) o sinistro unpermeabilized (B) prima di colorazione con anti-Salmonella -FITC per Salmonella citosolico. Dopo questa fase di colorazione, cells state permeabilizzate con saponina e totale Salmonella sono state colorate con anticorpi anti-Salmonella seguita da colorazione anticorpo secondario (rosso). Scala bar 10 micron.
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Discussion
Permeabilizzazione differenziale è un metodo facile e robusto per analizzare e quantificare la distribuzione subcellulare di batteri patogeni tra compartimenti vacuolari e citoplasma. Lo stesso test è stato utilizzato con successo con batteri come Francisella novicida 2,4 e Shigella flexneri 12. Tuttavia, dal momento che molti patogeni intracellulari alterare o modificare le strutture endomembrane ospitanti, la robustezza della permeabilizzazione digitonina dovrà essere determinata su base individuale. Messa a punto del test rispetto alla linea patogeno o cellulare utilizzato potrebbe essere necessaria. Il dosaggio non è solo limitato alla biologia infezione, ma può essere utilizzato anche per altre applicazioni cellulare biologico che, come segnalazione morte cellulare 17,18.
La chiave di questo saggio è che la membrana plasmatica e membrana intracellulare hanno una diversa composizione lipidica, in particolare membrane intracellulari contengono meno cholesterol. Digitonin può colesterolo complessa e porta così ad differenziale permeabilizzazione, l'efficienza e la selettività che dipende dalla durata del trattamento digitonina e la concentrazione del detergente. Per controllare per questo è importante controllare le cellule permeabilizzate mediante colorazione per proteine marker con localizzazione intracellulare definiti, come ad esempio la coda citoplasmatica di calnexina o PDI ER proteina del lume.
Mentre permeabilizzazione differenziale non è nuovo, questo protocollo permette inoltre una quantificazione rapida e oggettiva di batteri citosolici e vacuolari basato su FACS. Per l'analisi FACS è importante includere due controlli, che sono cellule non permeabilizzate e completamente permeabilizzate. Sulla base di questi campioni di controllo saranno impostati i cancelli per senza macchia e completamente tinto cioè vacuolar e batteri citosoliche.
Un passaggio fondamentale del protocollo è la permeabilizzazione e le fasi di lavaggio successive. Frsoluzioni tampone e detergenti eshly preparati devono essere utilizzati. Tutte le soluzioni dovrebbero essere preparare al momento dell'uso. Un altro punto critico è il momento della permeabilizzazione. Qui 1 min a una concentrazione di 50 digitonina mg / ml ha dimostrato di funzionare bene per midollo osseo macrofagi derivati. Quando si utilizzano linee cellulari diverse, la concentrazione di lavoro potrebbe aver bisogno di essere determinati empiricamente. Alte concentrazioni di digitonina o incubazione volte oltre 1 minuto può portare a permeabilizzazione delle membrane interne e risultati falsi positivi. Le soluzioni digitonina sono stabili solo per 1-2 ore. Preparare una soluzione fresca di digitonina poco prima è assolutamente fondamentale. Anche la capacità di digitonina per permeabilze membrane possono variare da lotto a lotto e tra i diversi fornitori.
Quindi se molti campioni devono essere trattati, è consigliabile suddividere questi in gruppi più piccoli che possono essere trattati in modo semplice e rapido. Infine, tutte le fasi di lavaggio dopo il permbisogno eabilization essere fatto con molta attenzione poiché il trattamento digitonina indebolisce membrane cellulari. Aggiunta di tampone e l'aspirazione deve essere fatto con delicatezza a lato del pozzo e non nel mezzo del pozzo.
Come sottolineato, altre tecniche per analizzare la distribuzione subcellulare di batteri tra citosol e compartimenti vacuolari esistere, come ad esempio l'uso della scissione b-lattamasi FRET giornalista CCF4-AM 19. Mentre il metodo CCF4-AM offrono il vantaggio di misurare rottura vacuolar in tempo reale, manca la risoluzione a livello batterio singolo e può fornire solo informazioni sul livello di singola cellula ospite. Così una combinazione di entrambi i test è ideale per ottenere informazioni sui livelli delle cellule batteri / host singolo nel tempo. È importante sottolineare che entrambi i saggi possono essere utilizzati non solo nel contesto di infezioni batteriche, ma anche nel contesto di altri studi biologici cellulari che mirano a determinare la localizzazione sub-cellulare di destinazione proteins 18.
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Acknowledgments
Vorremmo riconoscere Mathias S. Dick, Roland F. Dreier e Sebastian Rühl per la discussione. Questo lavoro è stato supportato da un FNS Professorship PP00P3_139120 / 1 e Università di Basilea concessione progetto ID2153162 a PB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digitonin | Sigma | D5628 | 50 μg/ml |
| PFA | mpbio | 219998380 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630 | |
| Potassium Acetate | Sigma | 791733 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| anti-Salmonella CSA-1-FITC | KPL | 01-91-99-MG | 1/500 |
| anti-Salmonella CSA-1 | KPL | 02-91-99-MG | 1/500 |
| anti-Calnexin | Enzo Lifesciences | SPA-860D | 1/100 |
| anti-PDI | Enzo Lifesciences | SPA-890 | 1/100 |
| Saponin | Sigma | 47036 | |
| Vectashield mounting medium | Vectorlabs | H-1200 | |
| Anti Rabbit antibody-488 | Molecular Probes | A-11070 | 1/500 |
| Glycine | Sigma | G8898 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15710-49 | 100 μg/ml and 10 μg/ml |
| Triton X-100 | Promega | H5141 | |
| PBS | Gibco | 20012-019 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| NEAA | Amimed | 5-13K00-H | |
| LSM700 Confocal microscope | Zeiss | imaging done at 63X | |
| FACS Fortessa | BD technologies | detection mCherry 610 nm | |
| FACS Fortessa | BD technologies | detection FITC 530 nm |
References
- Kumar, Y., Valdivia, R. H. Leading a sheltered life: intracellular pathogens and maintenance of vacuolar compartments. Cell Host Microbe. 5, 593-601 (2009).
- Chong, A., et al. The early phagosomal stage of Francisella tularensis determines optimal phagosomal escape and Francisella pathogenicity island protein expression. Infect Immun. 76, 5488-5499 (2008).
- Mellouk, N., et al. Shigella subverts the host recycling compartment to rupture its vacuole. Cell Host Microbe. 16, 517-530 (2014).
- Checroun, C., Wehrly, T. D., Fischer, E. R., Hayes, S. F., Celli, J. Autophagy-mediated reentry of Francisella tularensis into the endocytic compartment after cytoplasmic replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 14578-14583 (2006).
- Broz, P., Monack, D. M. Newly described pattern recognition receptors team up against intracellular pathogens. Nat Rev Immunol. 13, 551-565 (2013).
- Hagar, J. A., Powell, D. A., Aachoui, Y., Ernst, R. K., Miao, E. A. Cytoplasmic LPS activates caspase-11: implications in TLR4-independent endotoxic shock. Science. 341, 1250-1253 (2013).
- Ogawa, M., et al. Escape of intracellular Shigella from autophagy. Science. 307, 727-731 (2005).
- Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. Salmonellae interplay with host cells. Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).
- Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole. J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).
- Malik-Kale, P., Winfree, S., Steele-Mortimer, O. The bimodal lifestyle of intracellular Salmonella in epithelial cells: replication in the cytosol obscures defects in vacuolar replication. PLoS One. 7, e38732 (2012).
- Zhao, Y. O., Khaminets, A., Hunn, J. P., Howard, J. C. Disruption of the Toxoplasma gondii parasitophorous vacuole by IFNgamma-inducible immunity-related GTPases (IRG proteins) triggers necrotic cell death. PLoS Pathog. 5, e1000288 (2009).
- Meunier, E., et al. Caspase-11 activation requires lysis of pathogen-containing vacuoles by IFN-induced GTPases. Nature. 509, 366-370 (2014).
- Yamamoto, M., et al. A cluster of interferon-gamma-inducible p65 GTPases plays a critical role in host defense against Toxoplasma gondii. Immunity. 37, 302-313 (2012).
- Degrandi, D., et al. Murine guanylate binding protein 2 (mGBP2) controls Toxoplasma gondii replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 294-299 (2013).
- Mariathasan, S., et al. Differential activation of the inflammasome by caspase-1 adaptors ASC and Ipaf. Nature. 430, 213-218 (2004).
- Knodler, L. A., Nair, V., Steele-Mortimer, O. Quantitative assessment of cytosolic Salmonella in epithelial cells. PLoS One. 9, e84681 (2014).
- Ng, H., Smith, D. J., Nagley, P. Application of flow cytometry to determine differential redistribution of cytochrome c and Smac/DIABLO from mitochondria during cell death signaling. PLoS One. 7, e42298 (2012).
- Krawczyk, E., Suprynowicz, F. A., Sudarshan, S. R., Schlegel, R. Membrane orientation of the human papillomavirus type 16 E5 oncoprotein. J Virol. 84, 1696-1703 (2010).
- Keller, C., et al. Single cell measurements of vacuolar rupture caused by intracellular pathogens. J Vis Exp. , e50116 (2013).
