Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Utarbeidelse av Mica og Silicon Underlag for DNA Origami analyse og eksperimentering

doi: 10.3791/52972 Published: July 23, 2015

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Først introdusert i 2006, benytter DNA origami selv montering natur DNA-oligonukleotider å produsere utformbare og svært bestilte nanostrukturer. 1 En myriade av strukturer har blitt rapportert, alt fra smilefjes til låst 3-dimensjonale bokser. 2 DNA origami kan funksjon med ulike biomolekyler og nanostrukturer, noe som gir opphav til forskningssøknader i nanoelektronikk, medisin og quantum computing. 3 Men analysen og mange fremtidige programmer er ikke bare avhengig av strukturelle design, men også på vedheft av DNA origami nanostrukturer til overflater. Metodene som beskrives i dette manuskriptet gjelder for fremstillingen av DNA-origami prøver på to typer substrater: glimmer og funksjonaliseres silisiumoksid.

Glimmer er substratet grepet av DNA origami studier fordi det er atomisk flat, med en laghøyde på 0,37 nm ± 0,02 nm. 4 er det også easily rengjort, noe som gjør atomic force mikroskopi (AFM) studier prøveopparbeidelse og grei. Muskovitt glimmer inneholder en høy tetthet av kalium i hver spalting fly, men disse ioner diffunderer bort fra glimmer flaten når den er i vann. For å mediere binding av DNA origami til glimmer substratet, blir Mg 2+ brukes til å reversere den negative ladningen av glimmer og elektrostatisk binde DNA-fosfat-hovedkjeden til substratet (figur 1A). 5 Blandinger av hybridiserte DNA i nærvær av store overskudd av stapel- tråder gir høy dekningsgrad og gode bilder på glimmer på grunn av adhesjonen av DNA origami til Mg 2+ -terminated overflate er mye sterkere enn adhesjonen av enkelt-trådede oligonukleotider (stapel- tråder). Andre positivt ladede ioner, inkludert Ni 2+ 2+ Co og kan brukes til å kontrollere adhesjonen av DNA på glimmer. 6,7 Endring av konsentrasjonen av monovalente og divalente kationer i oppløsning kan mediere adhesjons og overflate diffusjonshastigheter av DNA origami. 8 imidlertid protokollen for fremstilling av glimmer substrater og avsette og skylle origami er ofte ikke eksplisitt er beskrevet i publiserte manuskripter. 9 Uten klar-protokollen, kan reproduserbare resultater være vanskelig å oppnå.

Glimmer er en isolator, slik at det ikke er egnet som substrat for enkelte applikasjoner i nanoelektronikk. Silicon passiv med et tynt innfødt oksid har attraktive elektroniske egenskaper, inkludert kompatibilitet med tidligere gratis Metal Oxide Semiconductor (CMOS) behandling for å lage input / output strukturer og topografiske egenskaper. Silisiumskiver som er lagret i luft er passivert med enten en tykk termisk oksyd eller tynn innfødt oksid film som er relativt skittent, med en høy partikkeltelling. Silisium-oksyd har en mye lavere tetthet enn overflateladning glimmer, og ladningstettheten er svært avhengig av oksyd forberedelse og historie. På magnesium ionekonsentrasjoner above 150 mM, god dekning (opp til 4 / um 2) med rektangulært DNA origami kan oppnås på oksygenplasma behandles silisiumsubstrater; Dette kan imidlertid konsentrasjonen og dekning endres avhengig av størrelsen og utformingen av nanostrukturer som brukes. 10 En alternativ protokoll for tuning overflaten kostnad er å feste en kationiske selv-montert monolayer av 3-aminopropyltrietoksysilan (APTES) (figur 1B) til oksydet. Det primære amin på APTES kan bli protonert ved pH-verdier under 9, modifisering av ladning og hydrofobisitet av underlaget. 11 For en fullstendig monolag av APTES å være vellykket avsettes, må silisium være hensiktsmessig renses ved hjelp av Radio Corporation of America (RCA) protokoller . Disse protokoller inkluderer behandlinger i ammoniumhydroksyd og hydrogenperoksydoppløsninger (RCA1) for å fjerne organiske rester og partikkel forurensninger. En kort etch i vandig flussyre-løsning, fjernes det naturlige oksydlag sammen mednoen ioniske forurensninger som holder seg til oksid. Til slutt, er prøvene utsatt for en saltsyre og hydrogen peroxide løsning (RCA2) for å fjerne metall og ioniske forurensninger og danner en tynn, jevn oksydlaget. 12 De fleste renrom har utpekt hetter for CMOS rengjøring protokoller, med strenge regler om hva som kan brukes i disse områdene. Et vanlig problem kommer i form av ioner slik som natrium, som kan forstyrre de elektroniske egenskaper av CMOS-strukturer ved å lage midbandgap feller. 13 Ioner som vanligvis anvendes i DNA origami forberedelse og deponering buffere kan forurense CMOS-bad og føre til problemer for andre forskere ved hjelp clean room. Av denne grunn, vår gruppe bruker en "skitne" CMOS rengjøring benk arrangert spesielt for de små prøver som brukes til DNA origami forskning. Denne prosessen er et godt alternativ til den tradisjonelle renrom oppsett og kan være egnet for laboratorier som ikke har tilgang til et renrom CMOS benk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Eksperimenter Planlegging og Material Forberedelse

  1. Bestem utforming, konsentrasjon, og funksjonaliteten av DNA origami som vil bli anvendt i eksperimentene. 14-16 Her anvendes en DNA origami rektangel utforming fremstilt i 1 x TAE / Mg2 +-oppløsning (40 mM Tris-base, 20 mM eddiksyre, 2 mM EDTA og 12 mM magnesium-acetat, pH 8,0). 17
  2. Autoklav alle tips, rør og containere som skal brukes. Disse materialene må alle være autoklav kompatible.
  3. Forberede en tilførsel av sterilt vann for å skylle. Fylle et sterilt glass med ca. 500 ml 18 Megohm x cm vann, sted på en kokeplate, koke i 5 minutter med hetten, og ta glasset ut av kokeplaten og la avkjøles med lokket plassert på beholderen, men ikke strammet . Oppbevar i kjøleskapet og forberede en ny forsyning hver måned eller når det er nødvendig.

2. Klargjøring av Mica substrat

  1. Cut underlag til riktig størrelse (1 cm x 1 cm firkanter) med saks. Glimmer er tynn og skjør. Alternativt kjøpe glimmer i platen form som ikke krever klipping.
  2. Spalter glimmer med dobbeltsidig tape. Glimmer er sammensatt av lag av mineraler adskilt av interkalere ioner, kan hvert lag skrelles av ved holdt dobbeltsidig tape. 18
    1. Plasser glimmer rutene på dobbeltsidig tape fortsatt i tapedispenser, noe som gjør at det blir overholdt fast til tapen. Skyv pinsett mellom glimmer og tape, vil det øverste lag fjernes og forbli på båndet. Umiddelbart etter fjerning, vil glimmer torget ha sin rene siden vendt nedover. Sørg for å snu glimmer over før lagring i en container.
    2. Gjenta dette 3-4 ganger for å sikre fullstendig fjernelse av det øverste laget og tilfredsstillende rengjøring.
  3. Alternativt, holder seg glimmeret til en beholder eller bord med et stykke dobbeltsidig tape og bruke en andre stykke til skryss til og skrelle av den øverste glimmer lag. Glimmer vil bli skikkelig rengjort i begge tilfeller, selv om den alternative metoden gjør avsetning av DNA og skylling og tørking av prøven vanskelig på grunn av det andre adhesjon til bæreren.

3. Å sette inn DNA Origami på Mica

  1. Kort fortalt, bland hetteglasset med DNA origami ved hjelp av en virvelblander for å sikre enda spredning av nanostrukturer i oppløsning.
  2. Pipetter 4 mL av løsningen på glimmer, som sikrer at pipettespissen ikke berører underlaget. La DNA origami på glimmer i ca. 10 minutter for å sikre tilstrekkelig dekning. Avsetningstiden vil variere avhengig av konsentrasjonen av DNA origami brukes så vel som den ønskede dekning (figur 2 og 3).
    1. Skyll DNA origami løsning av av glimmer underlaget med 100 mL sterilt vann over en vask eller annen væske beholder. Plukk opp glimmer bruker pinsett. Pipetter vann påsubstrat, med strømmen av dråpen mot tuppen av en pinsett. Rist glimmer med en skarp bevegelse nedover for å fjerne overflødig vann. Hold pinsetten oppreist slik at vannet vil strømme mot pinsett for å unngå forurensning av prøven.
  3. Tørk substratet med en jevn strøm av nitrogen (N2) i 1 min. Sørg for at overflødig vann er fjernet. Gjenta skyll med ytterligere 100 mL sterilt vann. Tørk substratet med N2 i ytterligere 3 min. Et helt tørt substrat er nødvendig for vellykket atomkraftmikroskopi (AFM) analyse (figur 4).
  4. Analysere underlaget med AFM eller oppbevar i en lukket beholder.

4. CMOS / Silicon Rens Set-up

  1. FORSIKTIG: Når du bruker CMOS set-up, bruke personlig verneutstyr til alle tider. Reagensene inkluderer sterke syrer, sterke baser, flussyre (HF), og sterke oksidasjonsmidler som can reagere med avfall løsemidler hvis reagenser ikke avhendes på riktig måte. Holde følgende sikkerhetsregler:
    1. Huset CMOS benk i en kjemisk hette med ingen andre prosesser eller set-ups.
    2. Bruke nitrilhansker, lab frakk, vernebriller, store industri nitril hansker, et spill forkle, og et ansikt skjold til enhver tid når du bruker CMOS benken.
    3. Bruk plastkar som sekundær forurensning når løsninger er forberedt.
    4. Bruk en inert fluorpolymermålebeger for håndtering av konsentrert HF.
    5. Gjør kalsiumglukonat salve tilgjengelig som førstehjelp for alle hud eksponering.
    6. Bare tillate fagpersonell til å utføre prosessen.
    7. Pass alltid på et annet medlem av lab er tilstede i nødstilfeller.
    8. Hold SDB informasjon for alle kjemikalier nær panseret.
    9. Bli kjent med institusjonens eller bedriftens kjemiske utslipp og eksponering politikk.
      Merk: HF lett gjennomsyrer hudenog er en kalsium åtseldyr, som påvirker bein og skadelige nerver hvis eksponeringen skjer. Dermal eksponering til noen få ml konsentrert flussyre kan være farlig og med dødelig. Etablere nødvendige forholdsregler for å sikre eksponering forekommer ikke.
  2. Utfør RCA1 og RCA2 i et eget 250 ml begerglass på separate kokeplater. Hvert beger bør inneholde en rørepinne. Overvåke temperaturen i oppløsningen ved hjelp av termometere fastklemt, slik at rørestav ikke banke inn i pæren. Dekk begrene ved hjelp av et urglass for å minske effekten av fordampning.
  3. RCA1 Forberedelse
    1. Plassere 50 ml av 18 Megohm x cm vann i den angitte RCA1 beger med målebeger.
    2. Tilsett 15 ml konsentrert ammoniumhydroksyd (NH4OH) til begerglasset. Skyll målebeger med 25 ml vann og tilsett skyllevannet til RCA1 beger.
    3. Slå på varmen og rører på varmeplaten og bringe RCA1 bath til 70 ° C. Tilsett 15 ml av 30% hydrogenperoksid (H 2 O 2) mot RCA1 beger. Bruk RCA1 oppløsning i løpet av 1 time etter at H 2 O 2 har blitt lagt til. Badekaret kan benyttes flere ganger innenfor utstrekningen av tre dager hvis 15 ml peroksyd tilsettes til badet hver gang.
    4. Skyll målebegeret grundig med vann og kast skylle på en hensiktsmessig RCA1 avfallsflasken.
  4. RCA2 Forberedelse
    1. Legg 70 ml av 18 Megohm x cm vann til det angitte RCA2 begeret bruker skylles grundig målebeger.
    2. Tilsett 15 ml konsentrert saltsyre (HCl). Skyll målebeger med 20 ml vann og legge den til i RCA2 beger.
    3. Øke varmen og rør hastigheten på varmeplaten til løsningen når 70 ° C.
    4. Tilsett 15 ml 30% H 2 O 2. Som RCA1 bath, bruker denne løsningen innen 1 time fra når H 2 O 2 er lagt; I tillegg, badekaretkan brukes om igjen flere ganger i løpet av tidsrommet av tre dager hvis 15 ml H 2 O 2 tilsettes før hver bruk.
  5. HF Løsning Forberedelse
    1. Plasser 50 ml vann i et inert fluorinert polymer beger.
    2. Mål 4 ml konsentrert flussyre (49%) i plast målebeger og legge den til i inert fluorpolymer beger.
    3. Skyll ut plast målebeger med et total av 50 ml vann, tilsetning av skyllevannet for HF-beger. Skyll målebegeret grundig med vann og kast de vasker i et utpekt HF avfallsbeholder.

5. Forberede og rengjøring silikonsubstratet

  1. Cutting silisiumskiver til chips
    1. Identifiser de vinkelrette og parallelle gitter retninger på den flate polerte overflaten av silikonplaten. Disse retningene er brukt for å gjøre spalte firkanter enklere. Følgende instruksjoner gjelder for cleaving silisium <110> og kan ikke være egnet for andre krystallorienteringer.
    2. Plasser silikonplaten polert side opp på et mykt underlag, for eksempel en serviett. Ved hjelp av den med diamantspiss spiss penn, forsiktig nick bunnen av skiven langs den primære flate kanten. Plasser en liten ledning, for eksempel en binders, under nick og anvende forsiktig trykk til skiven ved å plassere fingrene eller pinsett på hver side av den nick og skyve ned. Å gjøre dette vil skille wafer i to halvdeler langs krystallgitteret linjen i naturlige Cleave retning.
    3. På en annen serviett, med en blyant og linjal, måle ut den ønskede bredde av rutene ved å merke prikker på både toppen og bunnen av bindet. Koble disse prikkene med rette linjer. Dette vil fungere som en rettesnor for enda firkantede former.
    4. Plasser en av wafer halverer siden først mellom de målte linjene på serviett spyles mot linjen og gjenta i trinn 5.1.2 Ferskt brutt vinkel pieces bør nå være bredden av det spaltede rutene. Snu wafer horisontalt på serviett. Plasser den mellom loddrette linjer og gjenta prosessen i trinn 5.1.2.
    5. Oppbevar fersk spaltede wafer chips i en ren hetteglass fylt med DI vann for å unngå riper. De silisiumbrikker kan lagres på ubestemt tid, men må renses før forsøkene.
  2. CMOS Rengjøring av Silicon
    1. Når RCA1 løsningen har nådd riktig temperatur, senk åtte til ti 1 cm x 1 cm silisiumbrikker i løsningen ved hjelp av en inert fluorerte polymer kurv med en 2 "diameter. Bobler av oksygen vil danne på chips og beaker vegger. Hvis ingen bobler oppstår, H 2 O 2 er degradert. La brikkene i løsningen i 10 til 20 minutter, propaganderte kurven opp og ned med noen minutter for å holde chips ikke henger sammen.
    2. Løft kurven inneholder silisium brikker opp og renne godt. Flytt kurv over to avfallet beger og skyll grundig med 18 Megohm x cm vann. Fordyp i vask beger og jiggle opp og ned i 20 sekunder. Tømme kurven og skyll grundig med vann over avfallet beger. Tømme avfallet begeret til en utpekt RCA1 avfallsflaske og fyll på med vann.
    3. Etter RCA1 rengjøring er ferdig, plasserer kurven inn i 01:50 HF beger for 10 til 20 sek. Bruk en mild opp og ned for å blande chips og HF. Løft dunk bøtte slik at HF ​​å renne helt bort.
      Merk: chip overflater bør være hydrofobe; vann vil ikke fukte chip, men i stedet danne dråper med høye kontaktvinkler. Dette tyder på at silisiumoksydet er blitt etset bort, og brikken blir nå avsluttes av Si-H-bindinger.
    4. Plasser vaske beger og skyll beger i en plast kar, flytte kurven over skylle beger og skyll med 18 Megohm x cm vann. Senk kurven inn i vaske beger og agitere for 20 sek.
    5. Fullfør et sekund avløp og Rinse syklus med 18 Megohm x cm vann. Dumpe vaskevannet i skylle beger og fylle vaske beger med vann. Hell alt avfall til en utpekt plast HF avfallsflasken.
    6. Når RCA2 oppløsningen har nådd riktig temperatur, senk silisiumbrikker i løsningene ved hjelp av kurven. La i løsningen i 10 til 20 min. Brikken vil nå være hydrofile på grunn av vekst av en tynn (1-2 nm) oksydfilm.
    7. Fjern etter riktig mengde tid og følger de samme skylle prosedyrer som for RCA1. Avhende avfallet i riktig RCA2 avfallsbeholder. Fjern hver chip fra kurven med plast pinsett, skyll med vann, og føn med nitrogen.
    8. Oppbevar chips i en plast wafer boks eller i et hetteglass med 18 Megohm x cm vann. Silisium vil forbli ren da lagret i vann i ca tre dager etter rengjøring. Pass på at arbeidsområdet er skikkelig ryddet opp og på utsiden av CMOS-hanskene har blitt vasket. La CMOS hansker i panseret for å tørke.

6. Å sette inn DNA Origami på APTES-funksjon Silicon

  1. Self-montert med ett lag Formation på Silicon
    1. Varme APTES til RT før åpning. Hvis flasken er for kaldt, kan det oppstå kondensering forårsaker hydrolyse av de APTES under lagring. Legg 1,980 mL av 18 Megohm x cm vann og 20 pl APTES til en ren scintillasjonsflaske og virvel å blande. Bruk denne løsningen umiddelbart.
    2. Plasser en renset silisium chip reflekterende side opp i scintillasjonsglass, lokket den, og la sitte i 20 min. Fjern brikken ved hjelp av pinsetter og skyll med 200 pl vann og tørk i 1 minutt med en strøm av N2.
  2. Deponering DNA origami på APTES funksjon Silicon
    Merk: Trinnene for deponering DNA origami på funksjon silisium er analoge med dem for å deponere på glimmer.
    1. I korthet blande DNA origami hetteglass og pipette 4 mL av løsningenpå silikonsubstratet. Hvis det er nødvendig, øker volumet av DNA origami løsning som brukes for å dekke hele underlaget som den funksjon silisium er mer hydrofob enn glimmer substratet. Bruk et glass dekkglass å trykke på deponering løsning ned og hindre fordamping under lange forklaringer.
    2. La løsningen stå for den tid som er nødvendig for konsentrasjonen som brukes, og den ønskede dekning (se figurene 2 og 3 for virkningen av tid og konsentrasjon av overflatedekning). Skyll underlaget med 100 ul steril 18 Megohm x cm vann og tørk med N 2 for 1 min.
    3. Gjenta skylling med ytterligere 100 ul sterilt vann og tørke substratet med N2 i 3 min.
    4. Oppbevar prøven i en ren beholder inntil videre eksperimenter eller bildebehandling kan utføres. Prøvene begynner å vise partikkel akkumulering etter ca en til to uker lagringsplass avhengig av hvor much de håndteres.

7. AFM Imaging og bildeanalyse av DNA Origami Samples

  1. Bruk AFM i Tapping modus i luften for bildebehandling formål. Tapping modus sikrer at makt vil bli brukt på den skjøre nanostrukturer, i forhold til kontakt modus.
    Merk: bildeparametre vil være avhengig av instrumentet. Alle bildene som presenteres ble tatt med en Multimode Nanoscope IIIa.
  2. Velg AFM prober for ikke-kontakt / tappemodus i luften, med gull reflekterende belegg, en resonansfrekvens (nominell) på ~ 300 kHz, tvinge konstant på 40 N / m, og tips radius <10 nm.
  3. Bearbeide og analysere de AFM bilder ved hjelp NanoScope Analysis Software. Utføre beregninger dekning ved hjelp ImageJ. 19

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

To variabler diktere dekning av DNA origami på substratet: Løsning konsentrasjon og eksponeringstid. Absorpsjons egenskapene DNA origami på glimmer og APTES funksjonalisert silisiumoksyd er tidligere blitt rapportert. 13 Forholdet mellom konsentrasjonen av DNA origami i avsetningsoppløsningen og de ​​endelige dekning på glimmer er oppsummert i tabell 1 og figur 2, og viser økende konsentrasjon resultatene i økt dekning. Den tidsavhengighet av binding er sett i figur 3. Overflatedekning ble tidligere studert for å kvantifisere binding oppførselen av DNA origami på glimmer og modifiserte silisium oksid overflater. DNA origami i 12 mM magnesium i 1 x TAE buffer er 83,3% ± 3,1% dekning på glimmer etter 30 minutter absorpsjonstid på overflaten. Maksimal dekning på silisiumoksyd modifisert med APTES Sams observeres etter 60 minutter, som er mindre enn den maksimale dekning på glimmer. Alengre avsetningstiden er nødvendig hvis en høy overflatedekning er nødvendig på APTES funksjon silisiumoksid.

Det er flere variabler som kan føre til dårlig prøveopparbeidelse. Det mest problematiske er utilstrekkelig skylling og tørking. Dersom bufferoppløsningen ikke renses skikkelig, store aggregater dannes på substratet (figur 4A). 'DNA origami øyenes observeres når nanostrukturer følge oppdateringer av magnesiumsalter på overflaten (Figur 4B). Til slutt, med høy dekningsgrad prøver, er det mulig å ha overskudd av bufferkomponenter bygge bro mellom individuelle DNA origami (figur 4C), som gjør det vanskelig å skille nanostrukturer ved hjelp av AFM. Disse resultatene kan unngås ved å følge en grundig skylling og tørking protokoll for både glimmer og silisiumsubstrater.

Dannelse av APTES filmer på silisium oksid underlag kan utgjøre problemer også. Silisiumskiver har engrov silisiumoxydsjiktet som må fjernes og en jevnere, tynnere silisiumoxydsjiktet reformert før den kan funksjonaliseres. En riktig renset silisium substrat er illustrert i figur 5A. Under rengjøring av silikonplaten, er det viktig å sørge for at antallet av silisiumbrikker ikke er for høy, da det er mulig for to chips til å bli sittende fast til hverandre, blokkerer eksponering overfor reagensene (figur 5B). Hvis renset silisium har vært lagret i 18 Megohm x cm vann i mer enn én uke, vil forurensningen lag reformere og Rengjør på nytt er nødvendig. Den APTES forsyningen kan også føre til problemer med prøveopparbeidelse. APTES lett polymeriserer ved hydrolyse, som er grunnlaget for den monolaget formasjonen. 20 Graden av denne polymeriseringen er avhengig av konsentrasjonen av vann som den APTES er utsatt for. Over tid og ved gjentatt bruk, er det mulig for vann å kondensere inne i APTES flasken og forurenseforsyning. Den resulterende polymerisasjon produserer store aggregater som fester seg til underlaget (figur 5C). Den økte råhet og tilstedeværelse av aggregater gjør identifisere DNA-nanostrukturer ved hjelp av AFM vanskelig. Det er god praksis å lagre APTES flasken i en plastpose i kjøleskapet, og la APTES flaske varm til romtemperatur før åpning for å unngå kondens.

Figur 1
Figur 1. En skjematisk sammenligning av bindingsmekanismen for DNA origami på (A) glimmer og (B) APTES funksjonalisert silisiumdioksyd (ikke i målestokk). Binding med glimmer er mediert av tilstedeværelsen av divalente kationer, vanligvis Mg2 +. Et monolag av det protonerte amin-terminerte 3-aminopropyltriethoxysilan brukes til å fremme adhesjon på silisiumoksid substratet.

<img alt = "Figur 2" src = "/ files / ftp_upload / 52972 / 52972fig2highres.jpg" width = "700" />
Figur 2. AFM bilder som illustrerer variabel dekning etter 10 min avsetninger av (A) 2 nM, (B) 4 nM, og (C) 6 nM på glimmer. Høyden skala for alle bildene er 5 nm.

Figur 3
Figur 3. Trender i overflatedekning for to nM DNA origami i 1x TAE buffer, 12 mM Mg 2+. MICA = lilla linje og sirkel markører, APTES = gule linjer og trekant markører. N = 3 i bestemmelse av standard feil.

Figur 4
Figur 4. Dårlig skylling og tørking kan føre til (A) oppløsning aggregering på substratet (b) DNA origami øyer, og (C) brodannelse av nanostrukturer påhøy dekning prøvene i nærvær av overflødig buffer salter. Høyden skala for alle bildene er 5 nm.

Figur 5
Figur 5. (A) Rent silisium bør ha RMS ruhet mindre enn 0,5 A over en firkant micron. En komplett APTES SAM avsatt på en god innfødt oksid bør ha en RMS ruhet mindre enn en A over en firkant micron. (B) APTES film dannet på en ufullstendig renset silisium oksid med RMS grovheten på 2,29 nm over 1 kvadrat micron. . Merk hullene og råhet i APTES film (C) APTES overflaten dannet fra et utvalg av APTES forurenset med kondensert avfall; hydrolyse i APTES flaskeformer store partikler. Høyden skala for alle bildene er 5 nm.

Tabell 1. prosent dekning målinger for glimmer substrater med variasjong DNA origami oppløsningskonsentrasjoner. Alle deponering ganger er 10 min.

DNA Origami Solution % Dekning på Mica Substrat
2 nM 8,49 ± 2,67 (N = 5)
4 nM 55.89 ± 5.65 (N = 3)
6 nM 77,44 ± 1,89 (N = 4)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Det er flere tiltak som må vektlegges for å oppnå konsistente og ideelle resultater. For glimmer prøver, etter en streng og grundig skylling og tørking regime, som i trinn 3.3 og 3.4, vil sørge for at bilder av høy kvalitet av individuelle DNA origami kan oppnås ved hjelp av AFM uten de ulike problemene skissert i representative resultater delen. Av særlig betydning for silisium prøvene er renslighet av underlaget. Etter rengjøring prosedyrene beskrevet i trinn 5.2 grundig og omhyggelig vil sikre at en hensiktsmessig renset silisium oksid overflaten vil bli nådd. I tillegg, å overvåke kvaliteten og effektiviteten av kjemikalier, for eksempel hydrogenperoksyd, flussyre, og APTES, vil sikre at prosedyren går jevnt.

De teknikker som er beskrevet er ikke begrenset til bare vandige oppløsninger av APTES. En blandet monolag av APTES og trimethylaminopropyltrimethoxysilyl klorid (TMAC) kan være ossed å tune silisium overflateladning og fremme variabel DNA origami vedheft. 11 TMAC inneholder en permanent ladet terminal kvartær amin N (CH 3) 3 +, sammenlignet med pH-avhengig kostnad på APTES. Fordi løsningen miljøet ikke påvirker protonering staten eller ansvar for TMAC, varierende løsningen konsentrasjon av TMAC kan tune overflaten ansvaret for blandet monolaget og påvirker samspillet mellom underlaget og DNA origami. Optimal DNA origami binding ble observert for monosjikt med en overflateladning på 0,75 til 1,5 avgifter / NM 2, som tilsvarer Sams inneholdende 100% til 40% TMAC-konsentrasjon. Dette optimal overflateladning bedt om DNA origami dekning på ca 110 origami / mikrometer to på APTES Sams og 120 origami / mikrometer 2 på TMAC Sams.

En fordel med silisium er kompatibilitet med litografiske mønstrings prosesser. Høy magnesiumkonsentrasjoner kan brukes sammen med plasmabehandlede silisiumoksyder å fremme selektiv binding av DNA origami til silisium. Hensyn må tas ved fjerning av prøven fra avsetningsoppløsningen for å unngå å skylle bort magnesiumionene og deformasjon av DNA origami. 21,22 De APTES behandle skjemaer kovalent bundet kationer på overflaten silisiumoksyd, slik vasking eller skylling med buffer eller vann gjør ikke skade den vedlagte DNA origami. The 'molekylære oppskytning' metode er en annen mulig rute for mønstring silisium underlag og fremme DNA origami vedheft. Silisiumsubstratet blir mønstret ved hjelp av elektronstrålelitografi og APTES avsettes på det avdekkede. Etter liftoff av fotoresist, kan DNA origami avsettes på mønstret overflate, fortrinnsvis til å binde til APTES. 23

Samspillet av DNA origami med et substrat endrer sin stabilitet, åpne nye muligheter for forskning og applikasjoner. DNA origamJeg overholdt glimmer kan varmes opp til 150 ° C uten synlig endring av nanostrukturen dimensjoner og minimale kjemiske forandringer. 24 Dette står i sterk kontrast til den skjørheten DNA origami i oppløsning, hvor nanostrukturer er komplett dehybridized over 70 ° C. 25, 26 Denne stabilitet opprettholdes på oppvarmede silisium oksid substrater. 27 Selv i forskjellige løsningsmiddelsystemer, slik som heksan, toluen og etanol, formen og dekning av nanostrukturer opprettholdes. Den overraskende stabilitet av DNA origami indikerer at programmene som tidligere var antatt uforenlige, som for eksempel plasma forbedret dampavsetning, bruk av vanlige fotoresister og løsemidler, og unik kjemisk avsetningsmiljøer, kan anvendes i forbindelse med DNA origami. Men om det DNA origami opprettholde sin funksjonalitet er fortsatt ukjent og kan begrense mulige anvendelser.

Selv om stabiliteten av DNA origami ved forhøyet temperaturs og i et begrenset antall av løsemiddelsystemer er fastsatt, er den langsiktige stabiliteten av DNA origami på underlag fortsatt ukjent. Er bruk av sterile teknikker som er nødvendige for å unngå mulig forurensning, men dette kan ikke unngås når overflaten deponering. Bildebehandling og analysen må fylles ut nesten umiddelbart etter prøveopparbeidelse; hvis prøven er lagret for lenge (større enn en uke) ulike eksempler på prøven nedbrytning er ofte identifisert, inkludert partikkel akkumulering og ødelagte DNA-nanostrukturer. Mulige forsknings avenyene i nanoelektronikk, biosensing, og andre substrat basert DNA origami applikasjoner kan begrenses av tidsavhengige destabilisering av DNA. Identifisere begrensningene i disse teknikkene for applikasjoner som krever stabilitet for lengre perioder av gangen krever videre undersøkelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Eppendorf epT.I.P.S. Reloads, capacity 2-200 μl VWR International, LLC 22491733 10 reload tray of 96 tips
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene VWR International, LLC 87003-290 0.65 ml, natural
Research Plus Pippete - Single Channel - 20-200 μl A. Daigger & Company, Inc. EF8960F-3120000054 EACH Adjustable Volume
Research Plus Pippete - Single Channel - 2-20 μl A. Daigger & Company, Inc. EF8960D-3120000038 EACH Adjustable Volume
Scotch 237 Permanent Double-Sided Tape Office Depot, Inc. 602710 3/4" x 300", Pack of 2
Vortex Mixer Thermo Scientific M37610-33Q
Wafer container single, 2" (50 mm), 60 mm x 11 mm Electron Microscopy Sciences 64917-2 6 per pack
6" Wafer, P-type, <100> orientation, w/ primary flat Nova Electronic Materials, Ltd. GC49266
Powder-Free Nitrile Examination Gloves VWR International, LLC 82062-428 Catalog number is for size large
High Accuracy Noncontact probes with Au reflective coating K-Tek Nanotechnology, Inc. HA_NC/15
Autoclave Pan A. Daigger & Company, Inc. NAL692-5000 EF25341C
Sol-Vex II Aggressive Gloves, Size: 9-9.5; 15 mil, 13 inch - 1 dz Spectrum Chemical Mfg. Corp. 106-15055 Before use, rinse with water and scrub together until no bubbles form on the gloves.
Tweezers PTFE 200 mm Square Dynalon Corp. 316504-0002
Muscovite Mica Sheets V-5 Quality Electron Microscopy Sciences 71850-01 10 per pack
Mica Disc, 10 mm Ted Pella, Inc 50 Mica discs are optional
Scriber Diamon Pen for Glassware VWR International, LLC 52865-005
Scintillation Vials, Borosilicate Glass, with Screw Cap - 20 ml VWR International, LLC 66022-060 Case of 500, with attached polypropylene cap and pulp foil liner
4 x 5 Inch Top PC-200 Hot Plate, 120 V/60 Hz Dot Scientific, Inc. 6759-200
Straight-Sided Glass Jars, Wide Mouth VWR International, LLC 89043-554 Case of 254, caps with pulp/vinyl liner attached
Standar-Grade Glass Beaker, 250 ml Capacity VWR International, LLC 173506
Beakers, PTFE VWR International, LLC 89026-022 For use with HF
Shallow form watch glass, 3" VWR International, LLC 66112-107 Case of 12
Plastic Storage Container VWR International, LLC 470195-354 For secondary container
General-Purpose Liquid-In-Glass Thermometers VWR International, LLC 89095-564
High precision and ultra fine tweezers Electron Microscopy Sciences 78310-0
Polycarbonate Faceshield Fisher Scientific, Inc. 18-999-4542
Neoprene Apron Fisher Scientific, Inc. 19-810-609
Calcium Gluconate, Calgonate W.W Grainger, Inc. 13W861 Tube, 25 g
Hydrogen Peroxide 30% CR ACS 500 ml Fisher Scientific, Inc. H325 500 HARMFUL, TOXIC
3-Aminopropyltriethoxysilane Gelest Inc. SIA0610.0-25GM Let warm to room temperature before use.
Ammonium hydroxide, 2.5 L Fisher Scientific, Inc. A669-212 HARMFUL, TOXIC
Hydrochloric acid Fisher Scientific, Inc. A144-212 HARMFUL, TOXIC
Hydrofluoric acid Fisher Scientific, Inc. A147-1LB HARMFUL, TOXIC
MultiMode Nanoscope IIIa Veeco Instruments, Inc. Any AFM capable of tapping mode is suitable for analysis
Dunk basket Made in lab Made in lab The dunk basket was made using the bottom of a PTFE bottle with holes drilled in, PTFE handle, and all PTFE screws.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440, 297-302 (2006).
  2. Anderson, E. S., et al. Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid. Nature. 459, 73-77 (2009).
  3. Wang, Z., Ding, B. Engineering DNA Self-Assemblies as Templates for Functional Nanostructures. Acc. Chem. Res. 47, 1654-1662 (2014).
  4. Xu, K., et al. Graphene Visualizes the First Water Adlayers on Mica at Ambient Conditions. Science. 329, 1188-1191 (2010).
  5. Bustamante, C., et al. Circular DNA-molecules imaged in air by scanning force microscopy. Biochemistry. 31, 22-26 (1992).
  6. Hsueh, C., et al. Localized Nanoscopic Surface Measurements of Nickel-Modified Mica for Single-Molecule DNA Sequence Sampling. ACS Appl Mater. Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).
  7. Pastre, D., et al. Anionic polyelectrolyte adsorption on mica mediated by multivalent cations: A solution to DNA imaging by atomic force microscopy under high ionic strengths. Langmuir. 22, 6651-6660 (2006).
  8. Woo, S., et al. Self-assembly of two-dimensional DNA origami lattices using cation-controlled surface diffusion. Nature Communications. 5, 4889 (2014).
  9. Vesenka, J., et al. Substrate preparation for reliable imaging of DNA molecules with the scanning force microscope. Ultramicroscopy. 42-44, 1243-1249 (1992).
  10. Adsorption studies of DNA origami on silicon dioxide. Albrechts, B., et al. 21st Micromechanics and Micro Systems Europe Workshop 2010, (2010).
  11. Sarveswaran, K., et al. Adhesion of DNA Nanostructures and DNA Origami to lithographically patterned self-assembled monolayers in Si[100]. Proc. of SPIE-Soc. Opt. Eng. 7637, 76370M-1 (2010).
  12. Kern, W., Puotien, D. A. Cleaning solutions based on hydrogen peroxide for use in silicon semiconductor technology. RCA Rev. 31, 187-206 (1970).
  13. Pillers, M., Goss, V., Lieberman, M. Electron-Beam Lithography and Molecular Liftoff for Directed Attachment of DNA Nanostructures on Silicon: Top-down Meets Bottom-up. Acc. Chem. Res. 47, 1759-1767 (2014).
  14. Saccá, B., Niemery, C. M. DNA Origami: The Art of Folding DNA. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 58-66 (2012).
  15. Douglas, S. M., et al. Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno. Nucleic Acids Res. 37, 5001-5006 (2009).
  16. Ben-Ishay, E., et al. Designing a Bio-responsive Robot from DNA. Origami. J. Vis. Exp. (77), e50268 (2013).
  17. Woo, S., et al. Programmable molecular recognition based on the geometry of DNA nanostructures. Nature Chemistry. 3, 620-627 (2011).
  18. Schlegel, M. L., et al. Cation sorption on the muscovite (001) surface in chloride solutions using high-resolution X-ray reflectivity. Geochim. Cosmochim. Acta. 70, 3549-3565 (2006).
  19. Rasband, W. S., Howarter, J. A., et al. National Institutes of Health. Langmuir. 22, Bethesda, Maryland, USA. 11142-11147 (2006).
  20. Kershner, R. J., et al. Placement and orientation of individual DNA shapes on lithographically patterned surfaces. Nature Nanotechnology. 4, 557-561 (2009).
  21. Hung, A. M., et al. Large-area spatially ordered arrays of gold nanoparticles directed by lithographically confined DNA origami. Nature Nanotechnology. 5, 121-126 (2010).
  22. Sarveswaran, K., et al. et al.Adhesion of DNA nanostructure and DNA origami to lithographically patterned self-assembled monolayers on Si[100. Proc. SPIE-Int. Soc. Opt. Eng. 7637, 76370M (2010).
  23. Pillers, M. A., Lieberman, M. Thermal stability of DNA origami on mica. J. Vac. Sci. Technol. B. 32, 040602 (2014).
  24. Song, J., et al. Direct Visualization of Transient Thermal Response of a DNA. Origami. J. Am. Chem. Soc. 134, 9844 (2012).
  25. Wei, X., et al. Mapping the thermal behavior of DNA origami nanostructures. J. Am. Chem. Soc. 135, (16), 6165-6176 (2013).
  26. Hyojeong Kim,, et al. Stability of DNA Origami Nanostructures under Diverse Chemical Environments. Chem. Mater. 26, 5265-5273 (2014).
Utarbeidelse av Mica og Silicon Underlag for DNA Origami analyse og eksperimentering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pillers, M. A., Shute, R., Farchone, A., Linder, K. P., Doerfler, R., Gavin, C., Goss, V., Lieberman, M. Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation. J. Vis. Exp. (101), e52972, doi:10.3791/52972 (2015).More

Pillers, M. A., Shute, R., Farchone, A., Linder, K. P., Doerfler, R., Gavin, C., Goss, V., Lieberman, M. Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation. J. Vis. Exp. (101), e52972, doi:10.3791/52972 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter