Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

DNA Origami Analiz ve Deney için Mika ve Silikon Yüzeyler Hazırlanması

doi: 10.3791/52972 Published: July 23, 2015

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ilk olarak 2006 yılında tanıtılan, DNA origami DNA oligonükleotid kendinden montaj doğa designable ve son derece düzenli nano üretmek için kullanır. Yapılarının bir sayısız rapor edilmiştir 1, gülen 3 boyutlu kutuları kilitlenmiş karşı karşıya uzanan. 2 DNA origami Fonksiyonlu edilebilir Çeşitli biyomoleküllerin ve Nano ile nanoelektronik, tıp ve kuantum bilgisayar araştırma uygulamalarına sebebiyet veren. 3 Bununla birlikte, analiz ve birçok gelecek uygulamalar sadece yapısal tasarımı bağlı değil, aynı zamanda yüzeylere DNA origami nanoyapıların yapışma vardır. mika ve işlevselleştirilmiş silikon oksit: Bu yazıda tarif edilen yöntemler, alt-tabakaların iki tip DNA origami örneklerinin hazırlanması ile ilgilidir.

0.02 nm ± nm 0.37 tabakası yüksekliği ile, atomik düz olduğundan Mika, DNA origami çalışmaları için tercih substrat olduğunu. 4 Ayrıca EAS olduğunuily numune hazırlama ve atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) çalışmaları anlaşılır hale temizlenmelidir. Muskovit mika, her bölme düzlemi içinde bir potasyum yüksek yoğunluklu içerir, ancak zaman suda bu iyonlar mika yüzeyinden uzaklaşacak şekilde yayılan. Mika alt-tabaka DNA origami bağlanma aracılık etmek için, Mg2 + mika negatif yük ters elektrostatik alt-tabaka (Şekil 1A), DNA fosfat omurgası bağlamak için kullanılır. Tavlanmış DNA 5 karışımlar büyük varlığında Mg 2+ -terminated yüzeye DNA origami yapışması tek sarmallı oligonükleotitlere (elyaf iplikler) yapışma çok daha güçlüdür, çünkü elyaf şeritlerinin aşırılıkları mika yüksek kapsama alanı ve iyi görüntüler verir. Ni2 + ve Co2 + dahil olmak üzere diğer pozitif yüklü iyonlar, mika DNA yapışmayı kontrol etmek için de kullanılabilir. 6,7 Adhe aracılık edebilen çözelti içinde tek-değerli ve çift değerli katyonlarının konsantrasyonu değiştirmeDNA origami sion ve yüzey difüzyon oranları. 8 Ancak, mika substratları hazırlamak ve yatırma ve origami durulama için protokol genellikle açıkça net bir protokole olmadan yayınlanan yazılarda. 9'da tarif edilmez, tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek zor olabilir.

Mika bir izolatör, bu yüzden nanoelektronik bazı uygulamalar için, bir alt-tabaka olarak uygun değildir. Ince yerli oksit ile pasifize Silikon giriş / çıkış yapıları ve topografik özellikleri oluşturmak için önce ücretsiz metal oksit yarı iletken (CMOS) işleme ile uyumluluk da dahil olmak üzere arzu edilen elektronik özelliklere sahiptir. Havada depolanan Silikon gofret kalın termal oksit veya yüksek partikül sayımı ile nispeten kirli ince yerli oksit filmi ile ya pasifize edilmiştir. Silikon oksit, mika çok daha düşük bir yüzey yük yoğunluğuna sahiptir ve yük yoğunluğu oksit hazırlama ve tarihi hakkında oldukça bağlıdır. Magnezyum ° C'de iyon konsantrasyonu Abo150 mM A.Ş., iyi teminatlar (en fazla 4 / um 2) dikdörtgen DNA origami oksijen plazma tedavi silikon yüzeyler elde edilebilir; Bununla birlikte, bu konsantrasyon, ve kapsama kullanılan boyut ve nano-tasarımına bağlı olarak değişebilir. 10 alternatif bir protokol yüzey yükü ayarlama için 3-aminopropiltrietoksisilan (aptes) (Şekil 1B) bir katyonik kendi kendini monte tek tabaka iliştirmektir oksittir. APTES birincil amin substratının şarjının ve hidrofobisitesinin değiştirerek, 9'un altında pH değerlerinde protonlanabilir edilebilir. APTES tam bir tek tabaka için 11 başarılı bir şekilde yatırılır, silisyum uygun Amerika Radyo Corporation (RCA) protokoller kullanılarak temizlenmelidir . Bu protokoller, organik kısmı ve parçacık kirleri çıkarmak için amonyum hidroksit ve hidrojen peroksit çözeltileri (RCA1) tedavileri içerir. Sulu hidroflorik asit çözeltisi içinde kısa bir aşındırma ile birlikte doğal bir oksit tabakası kaldırıroksit bağlı herhangi bir iyonik kirleticiler. Son olarak, numune, bir ince, düzgün bir oksit tabakası metal ve iyonik kirlilikleri uzaklaştırmak ve oluşturulması için bir hidroklorik asit ve hidrojen peroksit çözeltisi (rca2) maruz bırakılır. 12 En çok temiz oda kullanılabilir ne katı kurallara CMOS temizleme protokolleri için davlumbaz belirlemiş Bu alanlarda. Yaygın bir sorun midbandgap tuzaklar oluşturarak CMOS yapıların elektronik özelliklerini bozabilir sodyum gibi iyonları, şeklinde geliyor. 13 İyonlar genellikle kullanan diğer araştırmacılar sorunlara CMOS banyoları kirletebilir ve neden olabilir DNA origami hazırlama ve çökelme tamponlar kullanılmaktadır temiz oda. Bu nedenle, bizim grup bir tezgah temizlik 'kirli' CMOS DNA origami araştırma için kullanılan küçük örnekler için özel olarak düzenlenmiş kullanır. Bu süreç, geleneksel temiz oda set-up için iyi bir alternatif olduğunu ve bir temiz oda CMOS tezgaha erişiminiz yoksa laboratuvarlar için uygun olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Deney Planlaması ve Materyal Hazırlama

  1. Deneylerde kullanılan edilecek olan DNA origami tasarımı, konsantrasyon ve özelliğe belirler. 14-16 Burada / Mg2 + çözeltisi (40 mM Tris-bazlı, 20 mM 1x TAE hazırlanan bir DNA origami dikdörtgen tasarım kullanmak asetik asit, 2 mM EDTA ve 12 mM magnezyum asetat, pH 8.0). 17
  2. Tüm ipuçları, tüpler ve kapları Otoklav kullanılacak. Bu malzemeler tüm uyumlu otoklav olmalıdır.
  3. Durulama için steril su, bir tedarik hazırlayın. 18 M x ​​cm su yaklaşık 500 ml steril kavanoza doldurun, bir ocak yeri, kapalı kapaklı 5 dakika kaynatın ve ocak gözünün kapalı kavanoz almak ve kap yerleştirilir ancak sıkılır değil kapaklı soğumaya bırakın . Buzdolabında saklayın ve yeni bir tedarik her ay ya da gerektiğinde hazırlamak.

2. Mika Substrat hazırlanması

  1. Uygun büyüklükte kesim yüzeyler (Makasla 1 cm x 1 cm kareler). Mika ince ve kırılgandır. Seçenek olarak ise, kesme gerektirmez disk şeklinde mika satın.
  2. Çift taraflı bant kullanarak mika parçalamak. Çift taraflı bant yapıştırılır zaman Mika iyonları intercalating ayrılmış minerallerin katmanlardan oluşur, her bir katman soyulmuş olabilir. 18
    1. Emin bant sıkıca yapıştırılır yapma, şerit dispanser hala çift taraflı bant üzerinde mika kareler yerleştirin. Dikkatle mika ve bant arasındaki cımbız slayt, en üst tabaka kaldırılır ve bant kalır edilecektir. Hemen çıkarılmasından sonra, mika kare onun temiz tarafı aşağı bakacak şekilde olacaktır. Bir kap içinde saklamadan önce mika çevirmek için emin olun.
    2. En üst tabaka, yeterli temizlik tam olarak çıkarılmasının sağlanması için bu 3-4 kez tekrarlayın.
  3. Alternatif olarak, çift taraflı bant parçası ile bir kap veya masa üstüne mika uymak ve ikinci parça s kullanmakiçin kene ve en üst tabakası mika soyulabilir. Alternatif bir yöntem, DNA biriktirilmesi ve durulama nedeniyle destek ikinci yapışma zor bir numuneyi kurutmak yapsa da mika doğru, her iki durumda da temizlenir.

Mica 3. yatırmak DNA Origami

  1. Kısaca, çözelti içinde nano dağılımı garanti edilmesi için bir vorteks mikser kullanılarak DNA origami şişe karıştırın.
  2. Pipet pipet substrat temas etmediğinden sağlamak mika üzerine çözeltinin 4 ul. Yeterli kapsama sağlamak için yaklaşık 10 dakika boyunca mika DNA origami bırakın. depozisyon süresi istenen içerisinde hem de kullanılan DNA origami konsantrasyonu (Şekiller 2 ve 3) bağlı olarak değişecektir.
    1. Bir lavabo ya da diğer sıvı priz üzerinden steril su 100 ul kullanarak mika substrat kapalı DNA origami çözüm durulayın. Cımbız kullanarak mika Pick up. Su PipetAlt tabaka, cımbız ucuna doğru damla akışı ile. Fazla suyu çıkarmak için keskin bir hareket aşağıya doğru mika çalkalayın. Su numunesi kirlenmesini önlemek için cımbız doğru akacak şekilde dik cımbız tutun.
  3. 1 dakika boyunca, sabit bir nitrojen akışı (N2) ile alt-tabakanın kurutun. Herhangi bir aşırı su kaldırılır emin olun. Steril su ilave 100 ul ile durulama tekrar edin. Ilave bir 3 dakika boyunca N2 ile alt-tabakanın kurutun. Tamamen kuru substrat başarılı atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) analizi (Şekil 4) için gereklidir.
  4. Kapalı bir kapta AFM veya mağaza kullanarak alt tabakayı analiz edin.

/ Silicon Temizlik Seti-up 4. CMOS

  1. DİKKAT: CMOS set-up kullanırken, her zaman kişisel koruyucu donanım kullanın. reaktifler, güçlü asitler, güçlü bazlar, hidrofluorik asit (HF) ve ca güçlü oksitleyici maddeler,reaktifler düzgün atılmazsa değilse n atık solventler ile reaksiyona. Aşağıdaki güvenlik önlemlerine uyun:
    1. Hiçbir diğer süreçler veya set-up ile kimyasal bir kaput Ev CMOS tezgah.
    2. CMOS tezgah kullanırken nitril eldiven, laboratuvar önlüğü, güvenlik gözlükleri, büyük sanayi nitril eldiven, bir dökülme önlük ve her zaman bir yüz maskesi takın.
    3. Çözümler hazırlanır ikincil çevreleme olarak plastik küvetleri kullanın.
    4. Konsantre HF kullanım için inert bir fluorinatlı bir polimer ölçüm kabı kullanın.
    5. Herhangi bir cilt maruz kalma ilk yardım olarak kalsiyum glukonat merhem kullanılabilir olun.
    6. Sadece düzgün eğitimli personel işlemini gerçekleştirmek için izin verir.
    7. Daima laboratuar başka üyesi acil durumda mevcut olduğundan emin olun.
    8. Kaput yakınındaki bütün kimyasallar için MSDS bilgi tutun.
    9. Kurumun ya da şirketin kimyasal sızıntısı ve maruziyet politikaları aşina olun.
      Not: HF kolayca cilde nüfuzve maruziyet oluşursa kemikleri ve zararlı sinirleri etkileyen, bir kalsiyum çöpçü olduğunu. Konsantre hidroflorik asit bir kaç mililitre dermal maruz tehlikeli ve hatta ölümcül olabilir. Oluşmaz pozlama sağlamak için gerekli tedbirleri oluşturulması.
  2. Ayrı bir ocak üzerinde ayrı bir 250 ml cam kap içinde RCA1 ve rca2 gerçekleştirin. Her bir deney şişesi, bir karıştırma çubuğu içermelidir. Karıştırma çubuğu ampul içine patlama değil bu yüzden kenetlenmiş termometre kullanılarak çözeltinin sıcaklığını izlemek. Buharlaşma etkisini azaltmak için bir saat camını kullanarak beher örtün.
  3. RCA1 hazırlanması
    1. Ölçme kabı kullanılarak belirlenen RCA1 behere 18 M x ​​cm 50 ml su koyun.
    2. Behere konsantre amonyum hidroksit 15 ml (NH4OH) ekleyin. 25 ml su ile ölçü kabı yıkayın ve RCA1 behere durulama suyunu ekleyin.
    3. Ocak ısı ve çalkalayıcıyı çalıştırın ve 70 ° C banyo RCA1 getir. RCA1 behere% 30 hidrojen peroksit (O 2H 2) 15 ml ilave edilir. H2O sonra 2 1 saat içinde RCA1 solüsyonu kullanın eklendi. peroksit 15 mi banyosu her zaman ilave edilir, eğer banyosu üç gün aralığı içinde birkaç kez kullanılabilir.
    4. Su ile iyice durulayın ve ölçüm beher uygun RCA1 atık şişe durulama atın.
  4. Rca2 hazırlanması
    1. Iyice durulandı ölçüm kabı kullanılarak belirlenen rca2 behere 18 M x ​​cm su 70 ml ilave edilir.
    2. Konsantre edilmiş hidroklorik asit (HCI) 15 ml ilave edilir. 20 ml su ile ölçü kabı yıkayın ve rca2 behere ekleyin.
    3. Isı artışı ve çözüm 70 ° C'yi ulaşana kadar ocak hızını karıştırın.
    4. % 30 H 2 O 2 15 ml ekleyin. RCA1 banyosu gibi, H 2 O 2 ilave edildiğinde 1 saat içinde bu çözümü kullanmak; Buna ek olarak, küvetH2O 2 15 mi, her kullanımdan önce ilave edilir, eğer üç gün aralığı içinde birkaç kez tekrar edilebilir.
  5. HF Çözüm Hazırlığı
    1. Bir atıl, fluorinatlı bir polimer beher 50 ml su koyun.
    2. Ölçü 4 plastik ölçüm kabı içinde konsantre hidroflorik asit (% 49) ml içinde ve durağan bir fluorinatlı polimer behere ekleyin.
    3. HF behere durulama su ilave, 50 ml su ile toplam kabı ölçüm plastik durulayın. Su ile iyice ölçüm beher yıkayın ve belirlenmiş bir HF çöp bidonuna yıkamalarda atın.

5. hazırlanması ve Silikon Substrat Temizlik

  1. Cips içine silikon gofret Kesme
    1. Silikon gofret düz cilalı yüzey üzerinde dik ve paralel kafes yön belirleyin. Bu yönde yarılması kareler kolaylaştırmak yardımcı olmak için kullanılır. Aşağıdaki yönergeler klivaj ilgilendirmeyensilikon <110> ing ve diğer kristal yönler için uygun olmayabilir.
    2. Böyle bir peçete gibi yumuşak bir yüzeye silikon gofret cilalı tarafı-up, yerleştirin. Elmas uçlu kalem kâtip, primer düz kenarı boyunca gofretin nazikçe nick altını kullanma. Nick altında böyle bir ataş olarak, küçük bir tel yerleştirin ve yavaşça nick iki tarafındaki parmak veya cımbız yerleştirerek ve aşağı iterek gofret baskı uygulamak. Bunu yaparsanız, doğal cleave yönünde kristal kafes hattı boyunca ikiye gofret ayıracaktır.
    3. Başka peçete, bir kalem ve cetvel ile, üst ve peçetenin alt hem noktalar işaretleyerek kareler istenilen genişlik ölçmek. Düz çizgiler ile bu noktalar bağlayın. Bu bile kare şekiller için bir rehber olarak hizmet verecek.
    4. Yerleştirin gofret bir satır karşı boşaltılan peçete ölçülen çizgiler arasındaki kenar ilk yarıya ve adım 5.1.2 taze piec dik kırık tekrares şimdi bölünmüş kareler genişlikte olmalıdır. Peçetenin yatay gofret açın. Dik çizgiler arasına yerleştirin ve adım 5.1.2 işlemini tekrarlamanız.
    5. Çizilmemesi için DI su dolu temiz bir şişeye taze bölünmüş gofret cips saklayın. silikon yongaları süresiz muhafaza edilebilir, ancak deneyler başlamadan önce temizlenmelidir.
  2. Silikon CMOS Temizleme
    1. RCA1 çözeltisi uygun sıcaklığa ulaştığı zaman,. Oksijen kabarcıkları yongaları ve beher duvarlarda oluşturacaktır. 2 "çapında bir atıl, fluorinatlı bir polimer sepeti kullanılarak çözelti içinde on 1 cm x 1 cm silikon yongaları sekiz daldırın Hayır ise köpüren 2 O 2 bozulmuş H oluşur. birbirine yapışmasını cips tutmak için aşağı her birkaç dakikada bir, 10 ila 20 dakika süreyle çözelti içinde fiş bırakın sepetini yukarı ajitasyon ve.
    2. Yukarı silikon yongaları içeren sepet kaldırın ve iyice süzün. T üzerinde sepeti getirinve atık beher o 18 M x ​​cm su ile iyice durulayın. Yıkama beher daldırın ve hafifçe aşağı yukarı sallayın 20 sn. Sepet boşaltın ve atık beher üzerinde su ile iyice durulayın. Belirlenmiş bir RCA1 atık şişe içine atık beher boşaltın ve su ile doldurun.
    3. RCA1 temizleme işlemi tamamlandıktan sonra, 10-20 saniye süre ile 1:50 HF behere sepeti yerleştirin. Cips ve HF karıştırmak için nazik bir yukarı ve aşağı hareket kullanın. HF tamamen uzak boşalmasını sağlamak için dunk kova kaldırın.
      Not: çip yüzeyleri hidrofobik olmalıdır; Su çip ıslak, ancak bunun yerine, yüksek temas açıları olan damlacıklar meydana olmaz. Bu silikon oksit uzaklıkta kazınmış ve çip artık içeriğinde Si-H bağları ile sona olduğunu gösterir.
    4. Yıkama behere koyun ve bir plastik küvet beher durulayın, durulama beher üzerine sepet taşımak ve 18 M x ​​cm su ile durulayın. Yıkama beher içine sepeti Batmak ve 20 saniye boyunca ajitasyon.
    5. İkinci drenaj ve rins tamamlayın18 M x ​​cm su ile e çevrimi. Durulama behere yıkama suyunu Dökümü ve su ile yıkama beher doldurun. Belirlenmiş bir plastik HF atık şişe içine tüm atıkları dökün.
    6. Rca2 çözümü uygun sıcaklığa ulaştığında, sepet kullanarak çözümler silikon çipleri daldırın. 10-20 dakika süre ile çözelti içinde bırakın. çip şimdi nedeniyle ince (1-2 nm) oksit filmin büyüme hidrofilik olacaktır.
    7. Zaman uygun miktarda sonra çıkarın ve RCA1 aynı durulama prosedürlerini izleyin. Uygun rca2 çöp bidonuna atık bertaraf edin. Plastik cımbız ile sepet her çipini çıkarın su ile durulayın ve azot ile kuru darbe.
    8. Plastik gofret kutusunda veya 18 M x ​​cm su cam şişede saklayın cips. temizlendikten sonra yaklaşık üç gün süreyle su içinde saklandığı zaman silikon temiz kalacaktır. Çalışma alanı düzgün temizlenir ve CMOS eldiven dış yıkanmış emin olun. CM bırakınKaputun OS eldiven kurumaya.

Aptes işlevselleştirilmiş silikon 6. yatırma DNA Origami

  1. Silikon Self-monte Monolayer Oluşumu
    1. Açmadan önce oda sıcaklığına kadar sıcak aptes. Şişe çok soğuksa, yoğunlaşma depolama sırasında APTES hidrolizini neden oluşabilir. 18 M x ​​cm su 1.980 ul ve karıştırmak için temiz bir sintilasyon şişesine ve girdap için APTES 20 ul ekleyin. Hemen bu çözümü kullanın.
    2. , Sintilasyon flakon temizlenmiş silikon çip yansıtıcı tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin kap ve 20 dakika bekletin. Cımbız kullanarak çip çıkarın ve su 'yun 200 ul ve N2 akımı ile 1 dakika boyunca, kuru ile durulayın.
  2. Aptes Fonksiyonlu silikon DNA origami yatırmak
    Not: işlevselleştirilmiş silikon DNA origami biriktirilmesi için gereken adımlar mika üzerine biriktirilmesi için olanlara benzer olan.
    1. Kısaca DNA origami şişesini ve pipet çözüm 4 ul mixSilikon substrat üzerine. Gerekirse, işlevselleştirilmiş silikon mika alt-tabaka daha fazla hidrofobik olduğu için, tüm alt-tabakanın karşılamak için kullanılan DNA origami çözeltisinin hacmi artar. Aşağı biriktirme çözümü basın ve uzun yeminli sırasında buharlaşmayı önlemek için bir cam kapak kayma kullanın.
    2. Çözelti kullanılan konsantrasyon için gerekli süreyi ve istenen kapsama standı (yüzey kapsama zaman ve konsantrasyon etkisi Şekiller 2 ve 3 bakınız) olsun. Steril 18 M x cm suyun 100 ul substrat durulayın ve 1 dakika süreyle N2 ile kurutulur.
    3. Steril su ilave 100 ul durulama tekrar edin ve 3 dakika boyunca N2 ile alt-tabakanın kuru.
    4. Daha fazla deneyler veya görüntüleme yapılabilir kadar temiz bir kapta saklayın örnek. Örnekler kadar mu bağlı olarak depolama yaklaşık 1-2 hafta sonra parçacık birikimi göstermeye başlarch onlar işlenir.

7. AFM Görüntüleme ve DNA Origami Örneklerinin Görüntü Analizi

  1. Görüntüleme amaçlı havada modunda Vurma AFM kullanın. Modu dokunulduğunda az kuvvet iletişim moduna göre, hassas nanoyapılarda uygulanacak sağlar.
    Not: görüntüleme parametreleri enstrüman bağlı olacaktır. Sunulan tüm görüntüler MultiMode NanoScope Ula kullanılarak ele geçirildi.
  2. Altın yansıtıcı kaplama ile hava kılavuz çekme modunda olmayan temas için seçin AFM sondalar /, 300 kHz ~ bir rezonans frekansı (nominal), 40 N / m ve uç yarıçapının <10 nm, sabit kuvvet.
  3. Süreç ve NanoScope Analiz Yazılımı kullanarak AFM görüntüleri analiz. ImageJ kullanarak kapsama hesaplamaları gerçekleştirmek. 19

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

İki değişken alt tabaka üzerinde DNA origami kapsama dikte: çözelti konsantrasyon ve maruz kalma süresi. adsorpsiyon mika DNA origami özellikleri ve işlevselleştirilmiş silikon oksit aptes, daha önce rapor edilmiştir. 13 çökelme çözeltisi ve mika üzerinde son sigortaların DNA origami konsantrasyonu arasındaki ilişki artan bir konsantrasyonu ile sonuçlarını gösteren Tablo 1 ve Şekil 2 'de özetlenmiştir artan kapsama. bağlanmanın zaman bağımlılığı Şekil 3. Yüzey içerisinde görülür önce mika DNA origami bağlanma davranışı ve modifiye silikon oksit yüzeyleri ölçmek için incelendi. 1x TAE tamponu içinde 12 mM magnezyum DNA origami yüzeyinde 30 dakika emme süre sonra mika% 83,3% 3,1 ± kapsama sahiptir. Aptes SAM ile modifiye silikon oksit maksimum kapsama mika maksimum içerisinde daha az 60 dakika sonra gözlemlenmiştir. Biryüksek bir yüzey kaplama silikon oksit fonksiyonlandırılmış APTES üzerinde gerekiyorsa daha uzun çökelme süresi gereklidir.

Zayıf numune hazırlama neden olabilir çeşitli değişkenler vardır. en sıkıntılı yetersiz durulama ve kurutma olduğunu. Tampon çözeltisi doğru durulandı ise büyük agregalar alt-tabaka (Şekil 4A) ilgili oluştururlar. Nanoyapılar yüzeye (Şekil 4B) üzerine magnezyum tuzlarının yamalar uygun zaman 'DNA origami adaları' görülmektedir. Son olarak, yüksek kapsama alanı örnekleri ile, bu zor AFM kullanılarak nano ayırt kolaylaştırır bağımsız bir DNA origami (Şekil 4C) arasında köprü fazla tampon bileşenleri olması mümkündür. Bu sonuçlar, hem mika ve silikon substratlar için baştan başa bir çalkalama ve kurutma protokolünü izleyerek önlenebilir.

Silisyum oksit yüzeylerde aptes filmlerin oluşumu da sorun teşkil edebilir. Silikon gofret bir olmasıuzaklaştırılmalıdır kaba silikon oksit tabakası ve fonksiyonalize önce yeniden daha yumuşak, ince silikon oksit tabakası. Uygun bir şekilde temizlenmiş silikon alt-tabaka Şekil 5A'da gösterilmiştir. Silikon gofret temizlenmesi sırasında, iki fiş reaktifler (Şekil 5B) maruz bloke birbirine yapışabilir için mümkün olduğu gibi, tabii silikon çipler sayısı çok yüksek olmayan bir hale getirmek için önemlidir. Temizlenmiş silikon birden fazla hafta boyunca 18 M x ​​cm suda kayıtlı ise, kirletici katman reform ve recleaning gereklidir. Aptes kaynağı da numune hazırlama ile ilgili sorunlara neden olabilir. Aptes kolaylıkla tek tabaka oluşumu için temel olan, hidroliz yoluyla polimerize. 20, bu polimerizasyon derecesi aptes maruz su konsantrasyonuna bağlıdır. Zamanla ve sürekli kullanımla su aptes şişe içinde yoğunlaşabilir ve kontamine için, bu mümkünkaynağı. Nihai polimerizasyon alt-tabaka (Şekil 5C) bağlı büyük topaklar oluşturur. artan pürüzlülüğü ve agrega varlığı zor AFM kullanılarak DNA nano belirlenmesi yapar. Bu buzdolabında bir plastik torba içinde aptes şişe depolamak ve aptes yoğunlaşmayı önlemek için açmadan önce oda sıcaklığına ılık şişe izin için iyi bir yöntemdir.

Figür 1
Şekil 1. mika Bağlama şematik bir (A), mika ve (B) DNA origami bağlama yöntemi karşılaştırırken fonksiyonalize aptes silikon oksit (ölçeğine göre olmayan). Iki değerli katyonları, genellikle, Mg + 2 varlığında aracılık eder. Protone amin bir tek-tabakalı 3-aminopropiltrietoksisilan, silikon oksit, alt-tabaka üzerindeki yapışmasını sağlamak için kullanılan sona erdirildi.

<img alt = "Şekil 2" src = "/ files / ftp_upload / 52972 / 52972fig2highres.jpg" width = "700" />
Şekil (a), 2 nM, (B), 4 nM, ve (C) 6 nM mika. Bütün görüntüler için yüksekliği ölçektir 5 mil 10 dakika birikimlerinin sonra değişken bir kapsama gösteren 2. AFM ve görüntüler.

Şekil 3,
1x TAE tamponu içinde 2 nM DNA origami, 12 mM Mg Şekil yüzey kapsama 3. Trendler 2+. MİKA = mor çizgi ve daire işaretleri, aptes = sarı çizgiler ve üçgen işaretleri. N = standart hata tespitinde 3.

Şekil 4,
Şekil 4. Yetersiz durulama ve kurutma ile nano (A), alt-tabaka üzerine çözelti, toplanmasını, (B), DNA origami adalar ve (C) bağlanmasına sebep olabilirFazla tampon tuzları varlığında yüksek kapsama örnekleri. Bütün görüntüler için yüksekliği ölçek 5 nm'dir.

Şekil 5,
Şekil 5. (A) Temiz silisyum 1 kare mikron üzerinde 0,5 Å daha az RMS pürüzlülük olmalıdır. Tam aptes SAM (B). 1 kare mikron üzerinde 1 Å daha bir RMS pürüzlülük daha az olmalıdır iyi bir yerli oksit üzerinde biriken 1 kare mikron üzerinde 2.29 nm RMS pürüzlülüğü ile eksik temizlenmiş silisyum oksit üzerinde oluşturulan bir film aptes. . Aptes film boşlukları ve pürüzleri Not (C) yoğunlaştırılmış atık ile kontamine APTES bir örnekten oluşan yüzey aptes; aptes şişe biçimleri büyük partiküller hidroliz. Tüm fotoğraflar için yükseklik ölçeği 5 nm.

Varyin ile mika yüzeyler için Tablo 1. Yüzde kapsama ölçümlerig DNA origami çözelti konsantrasyonları. Tüm biriktirme süreleri 10 dk.

DNA Origami Çözümü Mika Yüzey üzerinde% Kapsam
2 nM 8.49 ± 2.67 (n = 5)
4nM 55,89 ± 5.65 (N = 3)
6 nM 77,44 ± 1.89 (N = 4)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tutarlı ve ideal sonuçlar elde etmek için vurgulanması gereken gereken birkaç adım vardır. Mika örneklerinde, sıkı ve kapsamlı durulama takip ve adımlar 3.3 ve 3.4 gibi rejimi kurutmak için bireysel DNA origami yüksek kaliteli görüntüler Temsilcisi Sonuçlar bölümünde özetlenen çeşitli sorunlar olmadan AFM kullanılarak elde edilebilir olmasını sağlayacaktır. Silikon örnekleri için birincil öneme sahip alt tabakanın temizliktir. Iyice ve titizlikle adımda 5.2 özetlenen temizleme prosedürlerini takiben uygun bir şekilde temizlenmiş silikon oksit yüzeyi elde edileceğini garanti edecektir. Ayrıca, kaliteli ve hidrojen peroksit, hidroflorik asit ve APTES gibi kimyasalların, etkinliğinin izlenmesi, prosedür sorunsuz bir şekilde sağlayacaktır.

tarif edilen teknikler APTES sadece sulu çözeltileri ile sınırlı değildir. APTES ve trimethylaminopropyltrimethoxysilyl klorür (TMAC) bir karışık tek tabaka bize olabilirayarlamak için ed silikon yüzey yükü ve değişken DNA origami yapışmasını teşvik. 11 TMAC kalıcı yüklü Terminal kuaterner amin içeren -N (CH3) 3 + APTES pH bağımlı şarj ile karşılaştırıldığında. Çözelti çevre protonation devleti veya TMAC kutu melodi çözüm konsantrasyonunu karışık tek tabaka yüzey yükü değişen TMAC ücret, etkilemekte ve alt tabaka ve DNA origami arasındaki etkileşimi etkilemez çünkü. Optimal DNA origami SAMs% 100 ila% 40 TMAC konsantrasyonu ihtiva eden karşılık gelen 2 mil 0,75-1,5 masraflar /, bir yüzey yüküne sahip mono tabakaları için gözlenen bağlanma. Bu optimum yüzey yükü aptes SAMs ve 120 origami / TMAC SAMs üzerinde mikron 2 yaklaşık 110 origami / um 2 DNA origami teminatları istenir.

Silikon bir avantajı taşbaskı desen süreçleri ile uyumlu olduğunu. Yüksek magnezyumlukonsantrasyonları silikon DNA origami seçici bir şekilde bağlanmasını teşvik etmek için, plazma ile muamele edilmiş silikon oksitler ile birlikte kullanılabilir. Uzakta magnezyum iyonlarının durulama önlemek için biriktirme çözeltisi örnek almanın ve DNA origami deforme dikkatli olunmalıdır. Kovalent silisyum oksit yüzeyi üzerindeki katyonları ekli 21,22 aptes işlem formları, yıkama, böylece veya tampon veya su ile durulama yapar Ekli DNA origami zarar. 'Moleküler havalanış' yöntemi silikon yüzeylerde desenlendirme ve DNA origami yapışmasını teşvik etmek için başka bir olası yoldur. silikon alt-tabaka, elektron demeti kullanılarak desenli ve aptes maruz kalan alt-tabaka üzerine biriktirilmektedir. Fotorezist liftoff takiben, DNA origami tercihli APTES bağlanma, desenli bir yüzeye tatbik edilebilirler. 23

Bir alt tabaka ile DNA origami etkileşim araştırma ve uygulamalar için yeni açılımlar, istikrarı değiştirir. DNA, Origami nano boyutlarının gözle görünür değişim ve en az bir kimyasal değişiklik olmadan 150 ° C'ye ısıtılabilir mika yapıştırılır. 24 Bu nano 70 ° C. 25, yukarıda dehybridized tamamlandıktan Solüsyon içindeki DNA origami kırılganlığı, taban tabana zıt olan bir 26 Bu stabilite, ısıtılmış silikon oksit alt tabakalar üzerinde muhafaza edilmektedir. 27 da heksan, tolüen, etanol, şekil ve nano içerisinde gibi çeşitli çözücü maddeler içinde muhafaza edilir. DNA, origami şaşırtıcı sabitlik plazma geliştirilmiş buhar biriktirme, ortak fotodirencin ve çözücülerin kullanımı ve benzersiz kimyasal biriktirme ortamları, daha önce uyumlu olmayan düşünülen uygulamalar DNA origami ile bağlantılı olarak kullanılabilir olduğunu gösterir. Ancak, DNA origami onların işlevlerini korumak ister hala bilinmemektedir ve olası uygulamaları sınırlayabilir.

Yükseltilmiş sıcaklıkta, DNA origami kararlılığı olmasına rağmens ve çözücü sistemleri arasında, sınırlı sayıda tespit edilmiş olarak, alt tabakalar üzerinde, DNA origami uzun dönemli kararlılığı hala bilinmemektedir. Steril tekniklerin kullanılması mümkün kirlenmesini önlemek için gerekli olduğunu, ancak bu yüzey birikimi sonra önlenemez. Görüntüleme ve numune analizi numune hazırlama hemen sonra tamamlanması gerekir; Numune partikül birikimi ve kırık DNA nanoyapıların dahil, örnek bozulması çeşitli örnekler genellikle tanımlanır (bir haftadan daha fazla) çok uzun saklanır eğer. Nanoelektronik, biosensörleme ve diğer alt-tabaka bazlı DNA origami uygulamalarda muhtemel araştırma yolları DNA, zamana-bağlı destabilizasyona ile sınırlı olabilir. Uzun zaman süreleri için kararlılık gerektiren uygulamalar için bu tekniklerin kısıtlamaları ile daha fazla araştırma gerektirir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Eppendorf epT.I.P.S. Reloads, capacity 2-200 μl VWR International, LLC 22491733 10 reload tray of 96 tips
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene VWR International, LLC 87003-290 0.65 ml, natural
Research Plus Pippete - Single Channel - 20-200 μl A. Daigger & Company, Inc. EF8960F-3120000054 EACH Adjustable Volume
Research Plus Pippete - Single Channel - 2-20 μl A. Daigger & Company, Inc. EF8960D-3120000038 EACH Adjustable Volume
Scotch 237 Permanent Double-Sided Tape Office Depot, Inc. 602710 3/4" x 300", Pack of 2
Vortex Mixer Thermo Scientific M37610-33Q
Wafer container single, 2" (50 mm), 60 mm x 11 mm Electron Microscopy Sciences 64917-2 6 per pack
6" Wafer, P-type, <100> orientation, w/ primary flat Nova Electronic Materials, Ltd. GC49266
Powder-Free Nitrile Examination Gloves VWR International, LLC 82062-428 Catalog number is for size large
High Accuracy Noncontact probes with Au reflective coating K-Tek Nanotechnology, Inc. HA_NC/15
Autoclave Pan A. Daigger & Company, Inc. NAL692-5000 EF25341C
Sol-Vex II Aggressive Gloves, Size: 9-9.5; 15 mil, 13 inch - 1 dz Spectrum Chemical Mfg. Corp. 106-15055 Before use, rinse with water and scrub together until no bubbles form on the gloves.
Tweezers PTFE 200 mm Square Dynalon Corp. 316504-0002
Muscovite Mica Sheets V-5 Quality Electron Microscopy Sciences 71850-01 10 per pack
Mica Disc, 10 mm Ted Pella, Inc 50 Mica discs are optional
Scriber Diamon Pen for Glassware VWR International, LLC 52865-005
Scintillation Vials, Borosilicate Glass, with Screw Cap - 20 ml VWR International, LLC 66022-060 Case of 500, with attached polypropylene cap and pulp foil liner
4 x 5 Inch Top PC-200 Hot Plate, 120 V/60 Hz Dot Scientific, Inc. 6759-200
Straight-Sided Glass Jars, Wide Mouth VWR International, LLC 89043-554 Case of 254, caps with pulp/vinyl liner attached
Standar-Grade Glass Beaker, 250 ml Capacity VWR International, LLC 173506
Beakers, PTFE VWR International, LLC 89026-022 For use with HF
Shallow form watch glass, 3" VWR International, LLC 66112-107 Case of 12
Plastic Storage Container VWR International, LLC 470195-354 For secondary container
General-Purpose Liquid-In-Glass Thermometers VWR International, LLC 89095-564
High precision and ultra fine tweezers Electron Microscopy Sciences 78310-0
Polycarbonate Faceshield Fisher Scientific, Inc. 18-999-4542
Neoprene Apron Fisher Scientific, Inc. 19-810-609
Calcium Gluconate, Calgonate W.W Grainger, Inc. 13W861 Tube, 25 g
Hydrogen Peroxide 30% CR ACS 500 ml Fisher Scientific, Inc. H325 500 HARMFUL, TOXIC
3-Aminopropyltriethoxysilane Gelest Inc. SIA0610.0-25GM Let warm to room temperature before use.
Ammonium hydroxide, 2.5 L Fisher Scientific, Inc. A669-212 HARMFUL, TOXIC
Hydrochloric acid Fisher Scientific, Inc. A144-212 HARMFUL, TOXIC
Hydrofluoric acid Fisher Scientific, Inc. A147-1LB HARMFUL, TOXIC
MultiMode Nanoscope IIIa Veeco Instruments, Inc. Any AFM capable of tapping mode is suitable for analysis
Dunk basket Made in lab Made in lab The dunk basket was made using the bottom of a PTFE bottle with holes drilled in, PTFE handle, and all PTFE screws.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440, 297-302 (2006).
  2. Anderson, E. S., et al. Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid. Nature. 459, 73-77 (2009).
  3. Wang, Z., Ding, B. Engineering DNA Self-Assemblies as Templates for Functional Nanostructures. Acc. Chem. Res. 47, 1654-1662 (2014).
  4. Xu, K., et al. Graphene Visualizes the First Water Adlayers on Mica at Ambient Conditions. Science. 329, 1188-1191 (2010).
  5. Bustamante, C., et al. Circular DNA-molecules imaged in air by scanning force microscopy. Biochemistry. 31, 22-26 (1992).
  6. Hsueh, C., et al. Localized Nanoscopic Surface Measurements of Nickel-Modified Mica for Single-Molecule DNA Sequence Sampling. ACS Appl Mater. Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).
  7. Pastre, D., et al. Anionic polyelectrolyte adsorption on mica mediated by multivalent cations: A solution to DNA imaging by atomic force microscopy under high ionic strengths. Langmuir. 22, 6651-6660 (2006).
  8. Woo, S., et al. Self-assembly of two-dimensional DNA origami lattices using cation-controlled surface diffusion. Nature Communications. 5, 4889 (2014).
  9. Vesenka, J., et al. Substrate preparation for reliable imaging of DNA molecules with the scanning force microscope. Ultramicroscopy. 42-44, 1243-1249 (1992).
  10. Adsorption studies of DNA origami on silicon dioxide. Albrechts, B., et al. 21st Micromechanics and Micro Systems Europe Workshop 2010, (2010).
  11. Sarveswaran, K., et al. Adhesion of DNA Nanostructures and DNA Origami to lithographically patterned self-assembled monolayers in Si[100]. Proc. of SPIE-Soc. Opt. Eng. 7637, 76370M-1 (2010).
  12. Kern, W., Puotien, D. A. Cleaning solutions based on hydrogen peroxide for use in silicon semiconductor technology. RCA Rev. 31, 187-206 (1970).
  13. Pillers, M., Goss, V., Lieberman, M. Electron-Beam Lithography and Molecular Liftoff for Directed Attachment of DNA Nanostructures on Silicon: Top-down Meets Bottom-up. Acc. Chem. Res. 47, 1759-1767 (2014).
  14. Saccá, B., Niemery, C. M. DNA Origami: The Art of Folding DNA. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 58-66 (2012).
  15. Douglas, S. M., et al. Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno. Nucleic Acids Res. 37, 5001-5006 (2009).
  16. Ben-Ishay, E., et al. Designing a Bio-responsive Robot from DNA. Origami. J. Vis. Exp. (77), e50268 (2013).
  17. Woo, S., et al. Programmable molecular recognition based on the geometry of DNA nanostructures. Nature Chemistry. 3, 620-627 (2011).
  18. Schlegel, M. L., et al. Cation sorption on the muscovite (001) surface in chloride solutions using high-resolution X-ray reflectivity. Geochim. Cosmochim. Acta. 70, 3549-3565 (2006).
  19. Rasband, W. S., Howarter, J. A., et al. National Institutes of Health. Langmuir. 22, Bethesda, Maryland, USA. 11142-11147 (2006).
  20. Kershner, R. J., et al. Placement and orientation of individual DNA shapes on lithographically patterned surfaces. Nature Nanotechnology. 4, 557-561 (2009).
  21. Hung, A. M., et al. Large-area spatially ordered arrays of gold nanoparticles directed by lithographically confined DNA origami. Nature Nanotechnology. 5, 121-126 (2010).
  22. Sarveswaran, K., et al. et al.Adhesion of DNA nanostructure and DNA origami to lithographically patterned self-assembled monolayers on Si[100. Proc. SPIE-Int. Soc. Opt. Eng. 7637, 76370M (2010).
  23. Pillers, M. A., Lieberman, M. Thermal stability of DNA origami on mica. J. Vac. Sci. Technol. B. 32, 040602 (2014).
  24. Song, J., et al. Direct Visualization of Transient Thermal Response of a DNA. Origami. J. Am. Chem. Soc. 134, 9844 (2012).
  25. Wei, X., et al. Mapping the thermal behavior of DNA origami nanostructures. J. Am. Chem. Soc. 135, (16), 6165-6176 (2013).
  26. Hyojeong Kim,, et al. Stability of DNA Origami Nanostructures under Diverse Chemical Environments. Chem. Mater. 26, 5265-5273 (2014).
DNA Origami Analiz ve Deney için Mika ve Silikon Yüzeyler Hazırlanması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pillers, M. A., Shute, R., Farchone, A., Linder, K. P., Doerfler, R., Gavin, C., Goss, V., Lieberman, M. Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation. J. Vis. Exp. (101), e52972, doi:10.3791/52972 (2015).More

Pillers, M. A., Shute, R., Farchone, A., Linder, K. P., Doerfler, R., Gavin, C., Goss, V., Lieberman, M. Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation. J. Vis. Exp. (101), e52972, doi:10.3791/52972 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter