Wir haben einen Test auf Augenreizung, die einen dreidimensionalen rekonstruierten menschlichen Hornhaut artigen Epithelzellen (RhCE) Gewebemodell nutzt entwickelt. Der Test ist in der Lage, zwischen den Augenreizstoffes und ätzende Stoffe (GHS Kategorien 1 und 2 kombiniert) und diejenigen, die nicht die Kennzeichnung (GHS Keine Kategorie) erfordern, zu unterscheiden.
Um mit dem siebten Änderung der EU-Kosmetikrichtlinie und der EU-REACH-Verordnung zu erfüllen, sind validierte tierversuchsfreien Alternativmethoden für eine zuverlässige und genaue Bewertung der okulare Toxizität beim Menschen erforderlich. Um diesen Bedarf anzusprechen, haben wir eine Augenreizung (EIT), die ein dreidimensionales rekonstruiertes menschlichen Hornhaut artigen Epithelzellen (RhCE) Gewebemodells, die auf normalen menschlichen Zellen basiert, nutzt entwickelt. Das ETI ist in der Lage, die Augen reizenden und ätzenden Stoffen (GHS Kategorien 1 und 2 kombiniert) und jene, die keine Kennzeichnung (GHS Keine Kategorie) zu trennen. Der Test verwendet zwei getrennte Protokolle, eine für flüssige Chemikalien, und ein zweites, ähnliches Protokoll für feste Testartikel konzipiert. Das EIT Vorhersagemodell verwendet einen einzelnen Expositionszeit (30 min für Flüssigkeiten, 6 Stunden für Feststoffe) und eine einzelne Gewebelebensfähigkeit cut-off (60,0%, wie durch den MTT-Test bestimmt). Basierend auf den Ergebnissen für 83 Chemikalien (44 Flüssigkeiten und Feststoffen 39) EIT erreicht 95,5 / 68,2 / 81,8% sensitivity / Spezifität und Genauigkeit (SS & A) für Flüssigkeiten, 100,0 / 68,4 / 84,6% und SS & A für Feststoffe und 97,6 / 68,3 / 83,1% und für die gesamte SS & A. Das EIT wird wesentlich zur Klassifizierung des Augenreizungspotenzial von einer breiten Palette von flüssigen und festen Chemikalien, ohne die Verwendung von Tieren zu regulatorischen Testanforderungen gerecht zu leisten. Die EpiOcular EIT-Verfahren wurde im Jahr 2015 in den OECD-Prüfungsrichtlinien als TG 492 implementiert.
Consumer-Produkte wie Kosmetika, Wasch- und Reinigungsmitteln umfassen eine Vielzahl von Chemikalien, die schwere Schäden verursachen können, wenn sie Kontakt mit den Augen. Daher ist die Prüfung dieser Mittel zur Augenreizung durch die US- und EU-Aufsichtsbehörden erforderlich ist, um die Sicherheit der Verbraucher zu gewährleisten 1. Eine Bewertung der Augenreizung Potenzial der Mischungen und Formulierungen ist auch eine Voraussetzung für die Einhaltung der REACH (Registrierung, Bewertung, Zulassung und Beschränkung chemischer Stoffe) Rechtsvorschriften für die Etikettierung von kosmetischen Inhaltsstoffen im Rahmen der EU-Kosmetik-Richtlinie für den Transport von Chemikalien und für die Kennzeichnung von Pflanzenschutzmitteln und Haushaltsprodukte 2. Derzeit Aufsichtsbehörden verlangen, Augengefährdungsbeurteilung unter Verwendung des Global Harmonisierte System zur Einstufung und Kennzeichnung von Chemikalien (GHS) 3. GHS basiert hauptsächlich auf der Draize Augenreiztest basiert, die am weitesten verbreitete Augenreizung Assay, in dem Fremdstoffe und mixtures werden direkt in den Bindehautsack des Kaninchenauges 4 eingeleitet. Nach GHS-Einstufung, GHS-Kategorie 1 (augenverätzender) bezieht sich auf Chemikalien, die schwere anfänglichen Schädigung der Augengewebe oder schwere Schäden am Auge und Vision, die nicht innerhalb von 21 Tagen nach der Exposition 3,5 vollständig reversibel verursachen testen. GHS Kategorie 2 bezieht sich auf Chemikalien, die wesentlichen Änderungen des Auges, die innerhalb von 21 Tagen nach der Exposition vollständig reversibel sind produzieren zu testen. Testchemikalien, die keine korrosive oder Reizstoffe werden als GHS Keine Kategorie bezeichnet.
Seit mehr als 40 Jahren hat sich die Kaninchenaugentest Draize für seinen Mangel an Reproduzierbarkeit, Überschätzung der menschlichen Reaktionen, und der Einsatz von lebenden Tieren 08.05 kritisiert worden. Diese Bedenken wurden viele Vorschläge zur Verfeinerung, Verringerung und Ersetzung der in-vivo-Test 9 gefördert. Der Bedarf an validierten ohne Tier Alternativen weiter gestärktdurch die Annahme der siebten Änderung der Kosmetik-Richtlinie, die die Verwendung von Tieren in die Sicherheitsbewertung kosmetischer Mittel (2005) verboten und Zutaten (in 2009) 2.
Seit 1996 ist der rekonstruierte Cornea artigen Gewebemodell wurde in großem Umfang von der kosmetischen Industrie verwendet, um das Reizpotential der Rohstoffe, tensidhaltigen Formulierungen zu bewerten und compoundierten Mischungen, die zur Verwendung in ausgelegt sind, oder in der Nähe von, dem Auge 10-13. Die Nutzung der RhCE Gewebemodell ermöglicht die direkte topische Anwendung des Testmaterials auf die Gewebeoberfläche in seiner nativen, unverdünnt. Auf diese Weise können nicht-wasserlösliche Formulierungen, ohne sie mit Lösungsmitteln verdünnt getestet werden. Als Reaktion auf EURL ECVAM (EU-Referenzlabor Europäische Zentrum für die Validierung alternativer Methoden) Anforderung für eine breite Anwendung, einfache und wirtschaftliche Methode der Test auf Augenreizung (EIT), das eine singl nutzte Belichtungszeit und ist in der Lage, die Augen reizenden und ätzenden Stoffen aus Materialien, die nicht Kennzeichnung erfordern getrennt wurde (Abbildung 1) 14 entwickelt. Basierend auf den Ergebnissen für die 83 Chemikalien (44 Flüssigkeiten und 39 Feststoffe) erzielte das EIT 95.5 / 68.2 / und 81,8% Sensitivität / Spezifität und Genauigkeit (SS & A) für Flüssigkeiten, 100,0 / 68,4 / 84,6% SS & A für Feststoffe und 97,6 / 68,3 / 83,1% und für die gesamte SS & A.
Im Jahr 2007, ein Multi-Labor vor, eine Validierungsstudie durch Cosmetics Europe (ehemals Colipa) unter der Schirmherrschaft der EURL ECVAM gesponserte bewertet die Relevanz und Zuverlässigkeit des EIT mit dem Ziel, es zu formellen Validierung 15 bringen. In dieser Studie wurden 298 unabhängige Studien in sieben unabhängigen Labors durchgeführt. Die Ergebnisse der Studie zeigten 99,7% Zustimmung bei der Vorhersage mit niedrigen Variationskoeffizienten für alle teilnehmenden Laboratorien 15. Als Ergebnis im Jahr 2010 die EIT-Protokoll trat eine formelle EURL ECVAMValidierungsprogramm. Die Validierungsstudie verwendet 104 codierte Testchemikalien, einschließlich Einzelstoffe und Mischungen von Chemikalien, für die in-vivo-Referenzdaten (Draize-Augenreizungsdaten) zur Verfügung standen. Basierend auf dem Erfolg dieser Arbeit wurde ein OECD-Prüfrichtlinie Entwurf 2014 vorgelegt Es wird erwartet, dass das EIT wird wesentlich zur Einstufung von Augenreizungspotenzial von einer breiten Palette von Materialien gemäß der UN GHS Einstufung und Kennzeichnung Systems beitragen.
Wir haben den Test auf Augenreizung (Abbildung 1), die für die EpiOcular Gewebemodell entwickelt wurde, vorgestellt. Das ETI ist in der Lage, die Augen reizenden und ätzenden Stoffen (GHS Kategorien 1 und 2 kombiniert) aus Materialien, die keine Kennzeichnung (GHS Keine Kategorie) mit hoher Sensitivität und Spezifität 17. Das EIT zu trennen, wie sie hier vorgestellt wird nicht zwischen GHS-Kategorie unterscheiden 1 von Kategorie 2 Chemikalien. Das EIT wurde für die Einstufung und Kennzeichnung von Augenreizungspotenzial von einer breiten Palette von Chemikalien, einschließlich kosmetischen und pharmazeutischen Inhaltsstoffen validiert. In Verbindung mit anderen in vitro-Tests wird das EIT als Ersatz für die in-vivo-Kaninchenaugenreiztest dienen.
Das EIT verwendet zwei ähnliche, aber unterschiedliche Protokolle für flüssige und feste Materialien, die in der Länge der Exposition und der Nachbelichtung Inkubationszeiten (Figur 1) variieren. Die in der EIT verwendet Endpunktist die Lebensfähigkeit des Gewebes, durch das MTT-Assay, der zuvor in validierten menschlichen Epithelgewebe Modelle 20,21 verwendet wurde bestimmt. Um diesen Test durchzuführen, wird keine spezielle Ausrüstung neben Standard-Zellkultur Ausrüstung benötigt. Aufgrund der hohen Gewebe zu Gewebe Reproduzierbarkeit, n = 2 Geweben anstelle der Regel empfohlen, n = 3 verwendet. Der Fähigkeit zur Nutzung n = 2 Geweben ist ein kritischer Aspekt des Protokolls, denn sie erlaubt es einem erfahrenen Bediener, zwei Gewebe gleichzeitig zu verarbeiten, wodurch die Variabilität des Assays, die entstehen, minimiert aufgrund der unterschiedlichen Handhabung von einzelnen Tissues 14. Auch durch Verwendung von n = 2 Geweben pro Testartikel, die Reizwirkung von 10 Testsubstanzen der gleichen physikalischen Zustand (flüssig oder fest), zusammen mit den positiven und negativen Kontrollen, unter Verwendung von einem Satz (24 Gewebe) ausgewertet werden.
Andere wichtige Punkte, die zuverlässige Klassifizierung von Materialien gewährleisten Spezifikationen für die positive Kontroll substance (Gewebeviabilität ≤50.0%), Reproduzierbarkeit zwischen doppelte Gewebe (Differenz <20,0%) und negative Kontrolle OD-Ablesungen (> 0,8 und <2,5).
Bei der Durchführung des EIT-Test, ist es wichtig, auf die validierten Protokoll und der vorgeschlagenen Dosierung und Spülen Pläne (Tabellen 3 und 4) zu halten, da Abweichung vom Protokoll oder Änderungen der Inkubationszeiten kann zu veränderten Ergebnissen führen. Ebenso werden Abweichungen von der 3 Stunden Zeit für MTT Inkubation in verschiedenen MTT Lesungen führen und Assay-Ergebnis auswirken.
Gelegentlich kann eine Testchemikalie müssen optische oder andere Eigenschaften, die mit MTT Gewebelebensfähigkeitstest oder verursachen Reduktion von MTT stören können. Zum Beispiel kann eine Testchemikalie direkt MTT in blau-lila-Reaktionsprodukt, oder sie kann eine gefärbte Substanz, die Licht in der gleichen Größenordnung wie MTT Formazan (~ 570 nm) absorbiert werden. Allerdings werden diese Testchemikalien prESENT nur ein Problem, wenn zum Zeitpunkt des MTT-Tests, ist immer noch eine ausreichende Menge des Materials auf den heutigen (oder absorbiert) des Gewebes. Um diese Störungen zu vermeiden, sind umfangreiche Spülvorgänge in den EIT-Protokoll einbezogen. Wenn Spülen nicht entfernen Sie die TA und die TA stört MTT-Reduktion, müssen zusätzliche Kontrollen verwendet werden, zu erkennen und zu korrigieren ist. Kurz gesagt, wenn eine direkte MTT-Reduktion der Prüfsubstanz wird vermutet, 50 ul (oder 50 mg für Feststoffe) der betreffenden Chemikalie wird 3 h mit Arbeits MTT-Lösung bei SCC (NC 50 ul sterilem, entionisiertem Wasser inkubiert wird, sollte gleichzeitig laufen). Wenn der MTT Lösung blau-violett, ist der Testgegen vermutlich das MTT reduziert. In diesem Fall ist eine Funktionsprüfung mit gefrier getötet Gewebekontrollen durchgeführt werden sollte, um zu bewerten, ob das Testmaterial auf die Gewebebindung und zu einer falschen MTT-Reduktionssignal. Wenn es nennens MTT-Reduktion in der TA-ausgesetzt, getötet Gewebekontrolle(relativ zu der Menge bei der unbehandelten lebensfähiges Gewebe), muß die mittlere Gewebelebensfähigkeit des Testgegenstands durch Subtrahieren der mittleren Überlebensfähigkeit des getötet Steuerung korrigiert werden.
Das EIT irrt auf der Seite der Sicherheit, wie durch die niedrige Inzidenz von falsch negativen Klassifikationen 14,15,18 gezeigt. Wichtig ist, dass keiner der GHS-Kategorie 1 Chemikalien, die ätzend auf die Augen sind und stellen den schwersten Augengefahr, wurden als nicht reizend in diesem Assay 14,15,18,19 klassifiziert. Schließlich ist einer der Hauptvorteile des RhCE in vitro-Testverfahren die Möglichkeit der Prüfung reine Flüssigkeit und festen Materialien (die nicht mit zweidimensionaler, untergetaucht Zellkulturen möglich ist).
Das EIT wird bei der Bestimmung des Augenreizungspotenzial von einer breiten Palette von Materialien gemäß der UN GHS Einstufung und Kennzeichnung System einen wichtigen Beitrag. Der Ersatz von Tieren o bestimmen,sondere Toxizität ist seit vielen Jahren ein Ziel der toxikologischen Forschung. Das EIT Testmethode hat eine formelle Validierungsstudie durch EURL ECVAM unterstützt im Jahr 2014 abgeschlossen und die EpiOcular EIT wurde im Jahr 2015 in den Testleitlinien der OECD OECD TG 492 implementiert.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren bedanken sich bei Dr. John Harbell für seine wissenschaftliche Unterstützung und Zeit für das ETI-Projekt gewidmet danken. Die Autoren möchte auch danken, Beiersdorf AG (Deutschland), IIVS (USA), Mary Kay Inc. (USA), Avon Products Inc. (USA), Procter & Gamble / Cosmital (Schweiz), Laboratoire Pierre Fabre (Frankreich), Harlan Laboratories (Vereinigtes Königreich), und LVMH Parfume (Frankreich) für die Teilnahme an multizent Internationale Pre-und Validierungsstudien der Test auf Augenreizung 15.