Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos.
Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given point in time. The protocol dubbed Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture this mRNA translation process in a cell-type-specific manner. Based on the affinity purification of polysomes carrying a tagged ribosomal subunit, TRAP can be applied to translatome analyses in individual cells, making it possible to compare cell types during the course of developmental processes or to track disease development progress and the impact of potential therapies at molecular level. Here we report an optimized version of the TRAP protocol, called TRAP-rc (rare cells), dedicated to identifying engaged-in-translation RNAs from rare cell populations. TRAP-rc was validated using the Gal4/UAS targeting system in a restricted population of muscle cells in Drosophila embryos. This novel protocol allows the recovery of cell-type-specific RNA in sufficient quantities for global gene expression analytics such as microarrays or RNA-seq. The robustness of the protocol and the large collections of Gal4 drivers make TRAP-rc a highly versatile approach with potential applications in cell-specific genome-wide studies.
Forstå hvordan celler skaffe spesifikke egenskaper under utvikling er avgjørende for å sette pris på kompleksiteten av organer og deres potensial utvikling mot patologiske tilstander. Det er et stort forsknings push for å dechiffrere genet regulatoriske nettverk som underly celle spesifikasjon og differensiering av unrevealing globale genekspresjonsprofiler, Pol II bindende status, transkripsjon-faktor belegg på regulatoriske sekvenser eller post-translasjonelle modifikasjoner av histoner.
For å vurdere genekspresjon på et globalt nivå mikromatriser og RNA-seq tilnærminger brukes. Mikromatriser tillate å detektere mRNA overflod, mens RNA-seq er bedre rustet til å informere om de ulike typene RNA inkludert koding og ikke-kodende RNA som microRNAs, lncRNAs eller snRNAer. Imidlertid kan disse teknikkene ikke skille aktivt transkribert, steady-state mRNA, aktivt-sette mRNA, og mRNA inn i nedbrytingsprosessen. Måling steady-stspiste mRNA-nivåer er kjent for å være et dårlig estimering av proteom- sammensetning 1-3. I motsetning, identifisere aktivt-sette mRNA gir et mer nøyaktig bilde av proteinproduksjon.
Imidlertid har studier transcriptomic hovedsakelig blitt ledet ved hel organismen nivå ved å sammenligne gevinst eller tap av funksjon av en bestemt faktor for villtype tilstand 4-7 eller på dissekert vev, noe som gjør genekspresjonsprofiler vanskelige å tolke. Nylige fremskritt i celle målretting verktøy, affinitetsrensing og sensitivitets forbedringer nå tillate å utføre genome-wide analyser på små cellepopulasjoner eller enkeltceller i en levende organisme.
I Drosophila, store samlinger av transgene linjer aktivere spesifikk tidsmessig og romlig målretting av ulike vev og celle subpopulasjoner via GAL4 / UAS system 8-10 givende mer nøyaktig kvantifisering av de molekylære mekanismene som kreves for celle funksjon.
<p class = "jove_content"> Blant nyutviklede tilnærminger polysome profilering av fraksjonering ble beskrevet som en måte å fange aktivt-sette RNA 11. Denne metode basert på sukrose-gradient sentrifugering tillater valg av polysome fraksjon og bestemmelse av mRNA oversettes genom-wide når det analyseres med mikromatriser eller dyp-sekvensering. Polysome isolasjon kan være kombinert med nuklease-behandling for å identifisere ribosomale spor som svarer til RNA-fragmenter beskyttet av ribosomene under oversettelsesprosessen 12. Ribosomalt footprinting øker nøyaktigheten av kvantifisering av RNA oversettelse og RNA-sekvens-nivå oppløsning og ribosom posisjonering, gjør det mulig å måle frekvensen av oversettelse. Men hittil har det ikke blitt anvendt til celle-spesifikk isolering av translatomes, hovedsakelig på grunn av den sterke reduksjon i RNA utbytte oppnådd ved slutten av ribosomet footprinting prosessen. Gitt at valget av RNA størrelse kan generere potensielle falske-positives fra forskjellige RNPs som også kan beskytte RNA på en lignende måte, er ytterligere utvikling for å forbedre ribosomal spor og tilpasse den til celle-spesifikke tilnærminger.En av slike metoder, kalt Sette ribosom Affinitetsrensing (TRAP) er blitt beskrevet i 2008 av Heiman et al. og anvendt for å isolere translatome fra en undergruppe av nevroner i mus. Av epitop-merkingen ribosomalt protein i en celletype-spesifikk måte, kan polysomes selektivt renses uten arbeidskrevende trinn i celle dissosiasjon og sortering. I dette tilfellet, ble 60S ribosomalt protein L10a på overflaten av ribosomet merket med EGFP 13. Siden 2008 har flere studier brukt denne metoden i ulike arter, fra mus 14-19 til X. laevis 20,21, sebrafisk 22,23 og Arabidopsis thaliana 24. Fellen Metoden har også blitt tilpasset Drosophila modell og brukes til purify celletype-spesifikk mRNA fra nerveceller 25 og 26 astrocytter. Den allsidige binære GAL4 / UAS systemet ble brukt til å uttrykke GFP-merket RpL10A i en vev-spesifikk måte. Hoder av voksne fluer ble dissekert å utføre polysome utvalg fra nerveceller (målrettet av pan-nevrale Elav-Gal4 driver) og isolerte RNA ble sekvensert. Det store antall oppregulert gener som tilsvarte de som er kjent for å bli uttrykt i nervesystemet, noe som indikerer at tilnærmingen har god spesifisitet og spørre oss å tilpasse den til sjeldne cellepopulasjoner (mindre enn 1% av cellene) som er tilstede i utviklings Drosophila embryo .
Innenfor Drosophila modell, er fosterstadiet en modell av valg for studier av utviklingsprosesser, som de molekylære skuespillere og morphogenetic bevegelser er evolusjonært konservert. De eneste vevsspesifikke transcriptomic tilnærminger gjennomført så langt i denne modellen er utført ved hjelp av mobiltelefon eller kjernekraft sårting og har bare vært i stand til å studere steady-state transkriptomet 27-31, skaper et behov for metoder som er dedikert til vev / cellespesifikke translatome profilering i flue embryo. Her rapporterer vi først FELLE protokollen dedikert til Drosophila embryoer. Med denne metoden er engasjert-in-translation mRNA i en meget begrenset cellepopulasjon på rundt 100 muskelceller pr embryo ble vellykket isolert med høy kvalitet og spesifisitet. Den binære GAL4 / UAS systemet brukes til å drive uttrykk for GFP-merket RpL10A i undergruppe av muskler uten toksisitet, ingen åpen fenotyper eller forsinket utvikling som vist tidligere 25. Drosophila embryoer har 30 muskler per hemisegment som vil gi opphav til muskulaturen av larven. Ved hjelp av et regulatorisk område oppdages i nærheten av henge slapt identitet genet, 6 av de 30 flerkjerneinne muskler er målrettet. I denne analysen blir ribosomer immobilisert på mRNA ved hjelp av oversettelses forlengelseinhibitor cycloheximide. Cytosoliske ekstrakter blir så brukt for affinitetsrensing med GFP-antistoff-belagte magnetiske kuler. Kvaliteten på renset RNA ble validert ved hjelp Bioanalyzer. Kvantitativ revers transkripsjon PCR (RT-qPCR) ble anvendt for å bestemme spesifisiteten og sensitiviteten av mRNA isolert og vist at vår optimalisert protokollen er svært effektiv.
Dette notatet beskriver en modifisert Sette ribosom Affinitetsrensing protokoll (kalt 'TRAP-rc') dedikert til studiet av sjeldne celle populasjoner i Drosophila embryoer. Det gis informasjon om de viktigste trinnene for vellykket isolering av spesifikke RNA med en yield egnet for microarray eller RNA-seq analyse, dvs. 1) mengden av biologisk materiale som kreves og optimalisert prosedyre for embryo lyse og polysome utvinning; 2) perler / antistoff-til-lysat-forhold for optimal immunpresipitering; 3) trinn som tillater reduksjon av bakgrunnen inkludert vaskebuffer sammensetning, slik som å kjøre TRAP-rc eksperimenter med høy spesifisitet og sensitivitet.
Denne protokollen gir reproduserbare data som gjør det lett anvendes på andre celletyper. Denne teknikken gjør det mulig å analysere differensial genekspresjon på nivå med aktivt-sette mRNA og derved legge forholdene til rette for å forstå protein ekspresjon i en spec ific celletype på et bestemt tidsvindu. Merk imidlertid at protein mengde vil avhenge av graden av omregnings og nedbrytningsprosesser. En vesentlig begrensning av TRAP-metoden er dens manglende evne til å måle proteininnholdet i en nøyaktig kvantitativ måte, eller for å detektere post-translasjonell modifikasjon. Forbedring av kvantifisering ved å måle ribosom tetthet langs mRNA legemet og ved å gjøre dette, i en celletype-spesifikk måte kan foreta TRAP kombinert med ribosom footprinting et meget kraftig verktøy. I en nyere artikkel 34, ble denne kombinasjonen utført i humane embryonale nyre 293 celler. Forfatterne kjørte nuclease footprinting fulgt av affinitetsrensing av en induserbar biotinylated form av RpL10A bruker streptavidin perler. Dette er et bevis på prinsippet om at det er mulig å utføre ribosom spor i en hel organisme mens rettet mot en bestemt celletype, den begrensning er mengden av biologisk materiale som kreves for formålet.
"> Performing TRAP eksperimenter parallelt med globale transcriptomic analyser vil gjøre det mulig å spore proporsjoner mellom nylig transkribert og actively- sette RNA. Dette vil være dypt informative av de potensielle post-transkripsjonelle mekanismer som finner sted i spesifikke utviklings sammenhenger eller spesifikke cellepopulasjoner -Ved microRNAs for eksempel.I konklusjonen, er TRAP en svært effektiv, spesifikk og sensitiv metode for å identifisere RNA bundet til aktivt-sette ribosomer i en celle-spesifikk måte. Denne metoden kan brukes i en rekke forskjellige organismer og vevstyper. Den nye TRAP-rc-protokollen beskrevet her var optimalisert for sjeldne celle populasjoner (mindre enn 1% av total celle nummer) og for en mengde endelige materialet tilstrekkelig for senere analyser på hel-genom nivå.
En mulig begrensning ved denne metode er kravet til en sterk driver for å fremstille merkede ribosomer i tilstrekkelig mengde til å compete med endogene umerkede de i målrettede celletype. I en fersk undersøkelse 25, forfattere estimert til 10-30% av forholdet mellom merket versus umerkede ribosomer.
For å bøte på dette problemet øker UAS-RpL10A-EGFP kopiantallet bør betraktelig bedre denne balansen. Alternativt vil legge til den beskrevne genetisk bakgrunn et UAS-GAL4 transgenet forsterke produksjonen av GAL4-proteinet og indirekte øke ekspresjonen av RpL10A-EGFP. Dette bør favorisere et bedre belegg på merket ribosomer på mRNA.
Legg merke til at dette allerede effektiv tilnærming kan gjøres enda kraftigere ved å tilpasse komplementære metoder for å bringe en mer kvantitativ aspekt eller å oppdage og løse molekylære mekanismer som er avgjørende for genekspresjon kontroll.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Nicolas Allegre, Maud Peyny and Jean-Philippe Da Ponte for their excellent technical assistance. This work was supported by the Agence Nationale de la Recherche (ANR-JC-CARDIAC-SPE), the INSERM starting grant, ANR ID-CELL-SPE grant, Equipe FRM and the AFM 15845 grant.
HEPES | Sigma | H4034-1006 | |
1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850306P | |
Glycogen | thermo scientific | R0561 | |
Purified BSA 100X | Biolabs | B9001 | |
Yeast tRNA | Sigma | R5636 | |
Super RNase In | Ambion | AM2694 | |
Antibody GFP clone N86/38 | UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty Antibodies Incorporated | 75-132 | |
Nonidet P40 | Roche | 11754595001 | |
Precellys 24 Lysis homogenisation | Bertin Technology | ||
Nuclease free water | Nalgene | ||
Dynabeads ProteinG | Invitrogen | 10004D | |
Potassium chloride (KCl) | Applied Biosystem | AM96406 | |
Magnesium Chloride (MgCl2) | Applied Biosystem | AM95306 | |
Cellulose waddin unbleached | VWR | 115-2597 | |
Sieves 112, 355, 710 um | Retsch | ||
TRiZol | Invitrogen | 15596-018 | |
MagRack 6 | GE HealthCare | 28948964 | |
Low binding filter tips | ClearLine | ||
Rnase free tube 1,5 mL | ClearLine | 390689DD | |
Tween 20 | Fischer Bioreagent | BP337-500 | |
Cycloheximide | Sigma | C1985 | |
Protease inhibitor tablets, Mini-Complete, EDTA-free | Roche | 11836170001 |