Introduction
La comprensión de cómo las células adquieren propiedades específicas durante el desarrollo es crucial para poder apreciar la complejidad de los órganos y su posible evolución hacia condiciones patológicas. Hay un gran impulso de investigación para descifrar las redes reguladoras de genes que subyacen en la especificación y diferenciación celular por perfiles de expresión génica global unrevealing, el estado de unión Pol II, factor de transcripción de ocupación en secuencias reguladoras o modificaciones post-traduccionales de las histonas.
Para evaluar la expresión de genes en una microarrays nivel mundial y se utilizan enfoques de ARN-ss. Microarrays permiten detectar la abundancia de ARNm, mientras que el ARN-ss es mejor orientado a informar sobre los diferentes tipos de ARN, incluyendo codificación y noncoding RNAs como microRNAs, lncRNAs o snARNs. Sin embargo, estas técnicas no pueden diferenciar activamente transcritas-, en estado estacionario de ARNm, la traducción de ARNm-activamente, y el ARNm de entrar en el proceso de degradación. La medición constante-stcomieron los niveles de mRNA se sabe que es un pobre estimación de la composición proteoma a 1-3. Por el contrario, la identificación de forma activa-traducción de ARNm da una imagen más precisa de la producción de proteínas.
Sin embargo, los estudios de transcriptómica principalmente se han dirigido a nivel de todo el organismo mediante la comparación de la ganancia o pérdida de la función de un factor específico a la condición de tipo salvaje 4-7 o en el tejido diseccionado, por lo que los perfiles de expresión génica de difícil interpretación. Los recientes avances en instrumentos de focalización de células, purificación por afinidad y mejoras de sensibilidad permiten ahora para llevar a cabo los análisis de todo el genoma en las poblaciones de células pequeñas o células individuales incluso en un organismo vivo.
En Drosophila, grandes colecciones de líneas transgénicas permiten la orientación temporal y espacial específica de diferentes tejidos y las subpoblaciones de células a través del sistema GAL4 / UAS 8-10 obteniéndose la cuantificación más precisa de los mecanismos moleculares requeridos para la función celular.
RNA-11. Este método basado en sacarosa centrifugación en gradiente permite la selección de la fracción polisomas y la determinación de ARNm traducido en todo el genoma cuando se analizaron con microarrays o secuenciación de profundidad. Polisoma aislamiento se puede acoplar con la digestión nucleasa para identificar huellas ribosomal correspondientes a fragmentos de ARN protegidos por los ribosomas durante el proceso de traducción 12. Footprinting Ribosomal aumenta la precisión de la cuantificación de la traducción del ARN y ARN resolución a nivel de secuencia y posicionamiento ribosoma, hace que sea posible medir la frecuencia de la traducción. Sin embargo, hasta la fecha no se ha aplicado al aislamiento de células específicas de translatomes, principalmente debido a la fuerte disminución en el rendimiento de ARN obtenido al final del proceso de footprinting ribosoma. Dado que la selección de tamaño de ARN puede generar potencial de falsos positives de diferentes RNPs que también podrían estar protegiendo ARN de una manera similar, se necesitan nuevos avances para mejorar la huella ribosomal y adaptarlo a los enfoques específicos de células.
Uno de tales métodos, llamado el Translating ribosoma Purificación por Afinidad (TRAP) ha sido descrita en 2008 por Heiman et al. y aplicado para aislar el translatome de un subconjunto de neuronas en ratones. Por epítopo etiquetado una proteína ribosomal de una manera específica del tipo celular, polisomas se pueden purificar selectivamente sin la etapa laboriosa de disociación celular y la clasificación. En este caso, los 60S proteína ribosómica L10A en la superficie de los ribosomas fue etiquetado con eGFP 13. Desde 2008, varios estudios han utilizado este método en diferentes especies, a partir de ratones 14-19 a X. laevis 20,21, 22,23 pez cebra y Arabidopsis thaliana 24. El método TRAP también ha sido adaptada al modelo de Drosophila y utilizado a Purify ARNm a partir de células neuronales y astrocitos 26 25 específicos de tipo celular. Se utilizó el sistema GAL4 / UAS binaria versátil para expresar RpL10A-GFP etiquetados de una manera específica de tejido. Jefes de las moscas adultas fueron disecados para realizar la selección polisoma de células neuronales (dirigidos por pan-neuronal conductor Elav-Gal4) y ARN aislados fueron secuenciados. El gran número de genes regulados correspondió a los conocidos por ser expresado en el sistema nervioso, lo que indica que el enfoque tiene buena especificidad y nos impulsa para adaptarlo a las poblaciones de células raras (menos de 1% de las células) presentes en el desarrollo de embriones de Drosophila .
Dentro del modelo de Drosophila, la etapa embrionaria es un modelo de elección para el estudio de los procesos de desarrollo, como los actores moleculares y movimientos morfogenéticos se conservan evolutivamente. Los enfoques transcriptomic solamente tejidos específicos llevados a cabo hasta la fecha en este modelo se han realizado usando celular o nuclear por lorting y sólo han podido estudiar transcriptoma en estado estacionario 27 a 31, creando la necesidad de métodos dedicados al tejido / translatome perfil específico de las células en el embrión de la mosca. Aquí mostramos el primer protocolo TRAP dedicada a los embriones de Drosophila. Con este método, enganchado-in-traducción del ARNm en una población celular muy restringido de alrededor de 100 células musculares por embrión se aisló con éxito con alta calidad y especificidad. El sistema binario GAL4 / UAS se utiliza para conducir la expresión de RpL10A GFP-etiquetados en subpoblación de músculos sin ninguna toxicidad, no hay fenotipos aparentes o retraso en el desarrollo como se indica anteriormente 25. Embriones de Drosophila poseen 30 músculos por hemisegment que darán lugar a la musculatura de la larva. Mediante el uso de una región reguladora descubierto en las proximidades del gen de identidad se queda atrás, 6 de los 30 músculos multi-nucleadas están dirigidos. En este ensayo, los ribosomas se inmovilizan en el ARNm usando el alargamiento traduccióninhibidor cicloheximida. Extractos citosólicos se utilizan entonces para purificación por afinidad con perlas magnéticas recubiertas con anticuerpo GFP. Calidad de ARN purificado fue validado utilizando bioanalizador. Quantitative PCR de transcripción inversa (RT-qPCR) se utilizó para determinar la especificidad y la sensibilidad de aislamiento de mRNA y demostró que nuestro protocolo optimizado es altamente eficiente.
Protocol
1. Fly Line Generación
- Generar dos construcciones diferentes. En la primera construcción, ADNc RpL10A (proteína ribosomal subunidad L10A) se clona aguas abajo de las buenas prácticas agrarias en el plásmido UPAEP-PL-GFP-Nter (versión modificada de 32). El uso de un promotor de la línea germinal permite un uso más polivalente de la línea transgénica.
NOTA: Obtener el segundo constructo clonando la secuencia reguladora que dirige la expresión específica de tejido del gen se queda atrás aguas arriba de GAL4 (TF) utilizando el plásmido pPTGAL4. - Inyectar plásmidos por separado en w 1118 moscas e insertar los constructos en el genoma de la mosca de la inserción del elemento P (de acuerdo con el procedimiento estándar) 33.
- Seleccione transformantes para recuperar líneas de vuelo con construcciones en dos cromosomas diferentes. La línea de TRAP final se crea mediante la combinación de estas dos líneas (cruces genéticos) con el fin de obtener una línea estable de doble transgénico. F0: w-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; MKRS / TM6Bx w-; Cyo / SCU; Slouch Gal4 / TM6B. F1: w-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; Slouch Gal4 / TM6B. Massively amplificar esta línea y recoger los embriones protagonizadas deseado.
2. Embryo Collection
- Preparar 8 grandes jaulas de población cilíndricos que contienen alrededor de 40 g de moscas jóvenes por jaula (alrededor de 180,000 moscas / jaula).
- Proceda con los llamados pre-Lays que permiten a las moscas para borrar los embriones en desarrollo de sus oviductos. Para ello, sentar las moscas para 1 hr en dos platos Petri de 11 cm de diámetro que contienen una mezcla de agar y zumo de uva solidificada y cubrir ⅓ de la superficie con pasta de levadura recién hecho. Después de 3 intercambios de uva placas jugo recogen los embriones reales en platos recién hechos similares.
NOTA: El tiempo de incubación variará de acuerdo con el desarrollo de ventana de tiempo estudiado. - Retire las placas de las jaulas y dejarlos a la misma temperatura durante el tiempo necesario para obtener el grado de desarrollo correcto (por ejemplo, 3 horas de la puesta de huevos + 10 h de Additincubación ional da embriones de etapa de 10 a 13 horas después de la puesta de huevos (AEL)). Resuspender el contenido de la placa (embriones, pasta de levadura, moscas muertas) con 50 ml de agua utilizando un cepillo.
- Ir a través de una serie de tamices (700 m, 355 m, 112 m) para separar los embriones de moscas muertas y demás partes del cuerpo y recoger embriones retenidos en el tamiz de menor diámetro, y luego lavar brevemente en agua destilada. No utilice más de 18 planchas por la colección, ya que puede obstruir los tamices.
- Embriones Dechorionate en 4,5% de lejía en agua desionizada durante 2 minutos y enjuagar bien con agua desionizada durante 30 a 60 segundos. Incubar los embriones en PBS 0,01% Tween 20, 100 mg / ml de cicloheximida, durante 5-10 min a RT bajo agitación.
- Embriones secos en hojas absorbentes de celulosa y transferirlas a tubos de microcentrífuga. Pesar los tubos y el flash-congelar los embriones por inmersión en nitrógeno líquido. En esta etapa, los embriones secos se pueden almacenar durante varios meses a -80 ° C.
- Completamente resuspender la proteína G cuentas magnéticas en la botella original de agitación suave.
- Transferencia de 90 l de perlas a un tubo de RNasa libre y recogerlos en un imán (30-60 seg). 90 l de perlas es necesario llevar a cabo la inmunoprecipitación (IP) con 1 ml de lisado que contienen el 60-80 mg / ml proteínas. Respetar las proporciones para evitar la saturación del grano. Utilice varios tubos de acuerdo con la cantidad de proteínas.
- Bolas de lavado con 1 × PBS 0,01% Tween 20 (500 l) y recolectar los granos en el imán para desechar el sobrenadante. Añadir 30 g de anticuerpo GFP en 350 l de PBS 0,01% Tween 20 a las perlas y se incuba con el extremo lento sobre el extremo de mezclar durante 30 min a TA.
- Recoger los granos en el imán (30-60 seg), desechar el sobrenadante y enjuague en 500 l de tampón de extracción polisomas (Hepes 10 mM, KCl 150 mM, MgCl2 5 mM, DTT 0,5 mM, Triton 1%, cicloheximida 100 g / ml , Protease inhibidor 1 ×, inhibidor de RNasa 100 U).
- Recoger los granos en el imán y añadir 500 l de tampón de bloqueo (BSA 0,1 mg / l, ARNt de levadura 0,1 g / l, glucógeno 0,1 g / l en tampón de extracción polisomas).
- Incubar durante 30 min a TA y repetir este paso una vez con tampón de bloqueo fresco.
- Recoger los granos en el imán y enjuague en 500 l de tampón de extracción polisomas, a continuación, recordar cuentas y proceder de inmediato a la etapa inmunopurificación (artículo 6).
4. Preparación de lisado
- Antes de iniciar, configurar el programa en el multi-direccional cuentas de velocidad rápida grinder: 2 × 10 segundos a 5000 rpm, 15 segundos de pausa. Transferencia de embriones secos (1,5 g) a tubos de 15 ml previamente enfriado en hielo que contiene tampón de extracción polisomas, y homogeneizar inmediatamente. Homogeneizar 1,5 g de embriones en 4 ml de tampón de extracción polisomas.
- Spread homogeneizada embriones de cada dos preenfriados 2 tubos mL y muelen el embryos ejecutando el programa homogeneizador. Transferir el lisado a tubos de microcentrífuga frescos previamente enfriado en hielo y preparar un sobrenadante postnuclear por centrifugación a 4 ° C durante 10 min a 2000 g.
- Transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga de preenfriado fresco en hielo, añadir un centésimo volumen de muestra de 10% Nonidet P-40 al sobrenadante (concentración final = 0,1%), y se mezcla suavemente invirtiendo el tubo.
- Pulse-centrífuga la muestra en un Minifuge para recoger el líquido en la parte inferior del tubo, añadir un noveno volumen de muestra de 300 mM de 1,2-sn-Diheptanoyl-glicero-3-fosfocolina (DHPC) (concentración final = 30 mM ), mezclar suavemente invirtiendo el tubo, y se incuba la mezcla en hielo durante 5 min (mezcla invirtiendo varias veces durante la incubación).
- Preparar el sobrenadante post-mitocondrial por centrifugación a 4 ° C durante 10 min a 20.000 g. Medir la concentración de proteína por el método de Bradford: concentración en lisado debe estar entre el 60-80 mg / ml. Take el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga preenfriado fresco y proceder de inmediato a la etapa de pre-absorción (sección 5).
5. Pre-absorción
- Completamente resuspender las perlas magnéticas por agitación suave y la transferencia de 30 l de perlas en un tubo de microcentrífuga a temperatura ambiente (30 l de perlas / 1 ml de lisado embrionaria).
- Recoger los granos en el imán, pipeta el sobrenadante, y resuspender las perlas en tampón de extracción polisomas (500 l). Recoger los granos en el imán, añadir lisado embrionario, y se incuba durante 1 hora a 4 ° C en un rotador.
- Eliminar cuentas y mantener sobrenadante en hielo durante la etapa inmunopurificación. Antes inmunopurificación, mantenga 100 l de sobrenadante (de entrada) para comparar la muestra mundial de ARN con la muestra de ARN recogido después inmunopurificación, por RT-qPCR por ejemplo.
6. La inmunopurificación
- Añadir 1 ml (correspondiente a un 60-80 mg / ml de proteína) delisado pre-absorbido a un tubo de RNasa libre que contiene 90 l de cuentas bloqueadas acoplados a anticuerpos GFP. Incubar las muestras a 4 ° C durante 2 horas con suave mezclado de extremo a extremo en un rotador tubo. Alternativamente, realice la incubación O / N a 4 ° C.
- Después de la incubación, recoger los granos en el imán. Utilice un Minifuge a girar hacia abajo las perlas, a continuación, volver a suspender en 500 l de tampón de lavado (Hepes 10 mM, KCl 350 mm, MgCl2 5 mM, Nonidet P-40 1%, DTT 0,5 mM, cicloheximida 100 mg / ml, RNasa inhibidor de 100 U ) y recogerlos en el imán. Repita este paso dos veces más.
- Cambiar las perlas a un nuevo tubo RNasa libre de preenfriado y lavar dos veces. Recoge las cuentas de un imán y proceder a la extracción de ARN mediante la adición de 1 ml de Trizol directamente a las cuentas y seguir las instrucciones del fabricante.
7. ARN Limpieza y Evaluación de la Calidad
- Utilice un Kit RNeasy Micro según las instrucciones del fabricante. Al finalizar, elute ARN con (x) l de agua libre de RNasa. Caliente durante 2 minutos a 60 ° C, y la tienda de complemento congeladas muestras a -80 ° C. Compruebe la calidad del ARN utilizando bioanalizador (siga las instrucciones del fabricante).
- Para probar la especificidad de la Traped ARN, lleve a cabo la transcripción inversa en 3 ng de ARN purificado (de entrada y de IP) según las instrucciones del fabricante (superíndice III). Utilice el ADNc obtenido para qPCR utilizando conjuntos de cebadores específicos del gen.
Representative Results
El sistema muscular somática embrionario de Drosophila está compuesto por 30 músculos por hemisegment, y cada músculo tiene un conjunto específico de propiedades: el código de los genes de identidad, posición, número de eventos de fusión, sitios de fijación y la inervación. Identificar traducida del ARNm en un subconjunto específico del músculo dará información sobre las proteínas necesarias para formar estas características musculares específicos. Utilizando el método basado en la TRAP, ARN a partir de una subpoblación de los músculos que expresan el gen se queda atrás identidad se purificó (Figura 1A-B). Una preocupación importante de este enfoque es la calidad y la especificidad de la ARN aislado. El protocolo optimizado informó aquí habilitada la recuperación sistemática de ARN de alta calidad evaluados con el análisis bioanalizador. El perfil obtenido muestra ninguna degradación del ARN (Figura 1C).
En otros estudios desarrollados en torno al método TRAP, se plantearon cuestiones sobre la especificidad de los datos. Aquí iejorar el método para suprimir el fondo ligado a la unión no específica del ARN a las perlas o los tubos y por la optimización de la solución tampón de lavado. Con el fin de evaluar el nivel y la eficacia de aislamiento de células que expresan slouch fondo, nos llevó ensayos RT-qPCR en 3 repeticiones de la misma etapa embrionaria. Doblar-enriquecimientos de 4 genes diferentes (MEF2, se queda atrás, prospero, soxNeuro) se calcularon en comparación con la entrada y normalizado contra el gen RPL32 (Figura 1D). Estos resultados mostraron enriquecimiento de 2,3 veces de pan-musculares MEF2 genes y enriquecimiento de 5,6 veces del gen se queda atrás. En contraste, los dos genes expresados en el sistema neural se empobrecido en comparación con la entrada. Se observaron valores de cambio veces muy similares en 3 repeticiones biológica, lo que demuestra que el protocolo es robusto. Con conductor Slouch-Gal4 y partiendo de 1,5 g, alrededor de 1,5x10 ^ 6 embriones fueron obtenidos que contienen 100 células GFP / embrión (un total de 150 × 10 ^ 6 positivocélulas).
Después de ejecutar el experimento TRAP, el rendimiento es de alrededor de 25 a 45 ng de ARN específico dependiendo de la etapa de intereses. Este material es suficiente para hacer funcionar el análisis de microarrays o RNA-Seq usando un protocolo de amplificación para construir una biblioteca de ARN-ss. Eficiencia dependerá en gran medida de la fuerza del conductor utilizado para expresar RpL10A-EGFP.
Figura 1. Calidad y evaluación especificidad de ARN TRAP-aislado de Slouch-GAL4> embriones UASRpL10A-EGFP.
(AB) Confocal de imágenes de un embrión de etapa-16 que muestra la expresión RpL10A-EGFP específicamente en las seis células musculares Slouch por hemisegment (A). Co-localización de RpL10A-EGFP con el Beta3tubulin generales marcador muscular se observa en la foto de combinación (B). (C) Control de calidad de Traped ARN ran en bioanalizador mostrando perfecta integridad de ARNr 18S y 28S. Análisis (D) RT-qPCR mostrando una alta especificidad de experimentos de mRNA TRAP aislado en 3 réplicas biológicas de etapa-16 embriones. Doblar el cambio se calcula en comparación con la entrada y normalizado contra el gen RPL32. MEF2 transcripciones presentes en todos los linajes musculares son enriquecidos en 2,3 veces en comparación con la entrada, mientras que las transcripciones slouch más restringidas son 5,6 veces enriquecido. Células neuronales que expresan prospero y genes soxN se agotan 2,2 veces y 5,5 veces, respectivamente. Las barras de error representan la desviación estándar (n = 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
En este trabajo se describe un protocolo de purificación Traducción ribosoma Affinity modificado (apodado 'TRAP-rc') dedicado al estudio de las poblaciones de células raras en embriones de Drosophila. Se proporciona información sobre los pasos clave para el aislamiento exitoso de ARN específico con un rendimiento adecuados para microarray o análisis de ARN-ss, es decir, 1) la cantidad de material biológico requerido y procedimiento optimizado para la lisis de embriones y la extracción de polisomas; 2) cuentas / anticuerpo-to-lisado ratios para inmunoprecipitación óptima; 3) los pasos que permite la reducción del fondo incluyendo la composición de tampón de lavado con el fin de ejecutar experimentos-TRAP rc con alta especificidad y sensibilidad.
Este protocolo produce datos reproducibles por lo que es aplicarse fácilmente a otros tipos de células. Esta técnica hace que sea posible analizar la expresión génica diferencial en el nivel de mRNA activamente-traducción y por lo tanto preparar el camino para la comprensión de la expresión de proteínas en una especificación tipo de célula ific a una ventana de tiempo específica. Tenga en cuenta sin embargo, que la abundancia de proteínas dependerá de la velocidad de los procesos de traducción y la degradación. Una limitación importante del método TRAP es su incapacidad para medir el contenido de proteína de una manera cuantitativa precisa o para detectar modificación post-traduccional. La mejora de la cuantificación mediante la medición de la densidad de los ribosomas a lo largo del cuerpo de ARNm y, al hacerlo, de una manera específica del tipo celular puede hacer trampa en combinación con ribosoma footprinting una herramienta muy poderosa. En un trabajo reciente 34, esta combinación se realizó en las células embrionarias humanas de riñón 293. Los autores corrieron footprinting nucleasa seguido de purificación por afinidad de una forma biotinilada inducible de RpL10A usando perlas de estreptavidina. Esta es una prueba de principio de que es posible llevar a cabo la huella de ribosomas en un organismo completo mientras que apunta un tipo celular específico, la limitación es la cantidad de material biológico necesario para el propósito.
"> Realizando experimentos TRAP en paralelo con los análisis transcriptomic globales permitirá realizar un seguimiento de proporciones entre los recién transcrita y actively- traducir ARN. Este será profundamente informativa de los posibles mecanismos post-transcripcional que tienen lugar en contextos específicos del desarrollo o poblaciones de células específicas microRNAs -por por ejemplo.En conclusión, TRAP es un método altamente eficiente, específico y sensible para identificar RNAs activamente unidos a los ribosomas-traducción de una manera específica de la célula. Este método se puede utilizar en una amplia variedad de organismos y tipos de tejidos. El nuevo protocolo de TRAP-rc descrito aquí se ha optimizado para las poblaciones de células raras (menos de 1% del número total de células) y de una cantidad de material final suficiente para los análisis posteriores a nivel de todo el genoma.
Una posible limitación de este método es la exigencia de un fuerte impulsor de producir ribosomas etiquetados en cantidad suficiente para compensarmeete con los no etiquetados endógenos en el tipo de célula diana. En un estudio reciente 25, los autores estiman en 10-30% la proporción de etiquetado frente a ribosomas sin etiquetar.
Para superar este problema cada vez mayor número de copias-EGFP UAS-RpL10A debería mejorar considerablemente este equilibrio. Alternativamente, añadiendo a los antecedentes genéticos se describe un transgén UAS-GAL4 amplificará la producción de la proteína GAL4 e indirectamente aumentar la expresión de RpL10A-EGFP. Esto debería favorecer una mejor ocupación de los ribosomas etiquetados en ARNm.
Tenga en cuenta que este enfoque ya eficiente se puede hacer aún más potente mediante la adaptación de los métodos complementarios para traer un aspecto más cuantitativa o para descubrir y desentrañar los mecanismos moleculares que son esenciales para el control de la expresión génica.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Sigma | H4034-1006 | |
| 1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850306P | |
| Glycogen | thermo scientific | R0561 | |
| Purified BSA 100X | Biolabs | B9001 | |
| Yeast tRNA | Sigma | R5636 | |
| Super RNase In | Ambion | AM2694 | |
| Antibody GFP clone N86/38 | UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty Antibodies Incorporated | 75-132 | |
| Nonidet P40 | Roche | 11754595001 | |
| Precellys 24 Lysis homogenisation | Bertin Technology | ||
| Nuclease free water | Nalgene | ||
| Dynabeads ProteinG | Invitrogen | 10004D | |
| Potassium chloride (KCl) | Applied Biosystem | AM96406 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Applied Biosystem | AM95306 | |
| Cellulose waddin unbleached | VWR | 115-2597 | |
| Sieves 112, 355, 710 um | Retsch | ||
| TRiZol | Invitrogen | 15596-018 | |
| MagRack 6 | GE HealthCare | 28948964 | |
| Low binding filter tips | ClearLine | ||
| Rnase free tube 1.5 ml | ClearLine | 390689DD | |
| Tween 20 | Fischer Bioreagent | BP337-500 | |
| Cycloheximide | Sigma | C1985 | |
| Protease inhibitor tablets, Mini-Complete, EDTA-free | Roche | 11836170001 |
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