Introduction
Området regenerativ medicin och tissue engineering snabbt framåt, med genombrott i luftrör och njure regenere två anmärkningsvärda nya landvinningar. De biomaterial utvecklas i vävnadsteknik blir mer tillgängliga, med möjlighet att överföra sådana protokoll till mindre specialiserade laboratorier. Ett område trimmade för att dra nytta genom att öka användningen av biomaterial är in vitro-diagnostik.
In vitro-studier är en viktig plattform för att undersöka intracellulära signalvägar inom enskilda celltyper, och har hjälpt beskriva mekanismerna bakom många pathophysiologies sjukdoms. Dessa studier bygger i allmänhet på en enda celltypen som odlas som ett monoskikt på vävnadsodlingsplast (TCP); en tvådimensionell (2D) stel yta betydligt mindre elastisk och porös än de tredimensionella (3D) miljö celler exponeras för inom en vävnad eller ett organ. Djurmodeller har traditionellt varit employed att bekräfta effekter som iakttas in vitro också översätta till hel vävnad, och kan även användas som prekliniska plattformar för att undersöka humana sjukdomar. Skillnaderna mellan arter gräva denna beroende av djurmodeller i vår förståelse av sjukdomar hos människan -. Till exempel, är mycket förståelse av lungsjukdom astma baserad på en musmodell trots inneboende skillnader mellan människans villkor och denna modell inklusive få tecken på mastcellinfiltration av luftvägarnas glatta muskulatur bunt, eller förmåga till spontan sjukdomsutveckling inom djuret modell 3,4. Det finns också etiska överväganden när det gäller användning av djurmodeller, med "3R" standard "ersättning, förfining och minskning" i djurförsök uppmuntras i Storbritannien och andra länder.
Ett attraktivt alternativ skulle vara rekapitulation av mänsklig vävnad in vitro skapa strukturs för att undersöka den kooperativa natur mellan vuxna typer humana cell i en enda enhet. Celler existerar i 3D flercelliga strukturer inom mjukpapper, var och en inom en unik mikromiljö. Odlingen av celler på TCP endast tillåter odling av cellmonoskikt, oförmögen att replikera denna miljö, eller ge kapacitet för multi-cellodling. Biomaterials avancemang ger möjlighet att utveckla både naturliga och syntetiska 3D plattformar för cellodling. Decellulariserade ECM kan användas för 3D cellodling när recellularized med andra celltyper inklusive stamceller 1, men sådana protokoll kan vara komplicerat och tidskrävande, med tillgång till vävnaden begränsad och till stor del av icke-mänskligt ursprung. Andra protokoll tillåter större kontroll över de cellulära miljöer skapade såsom nanoimprinting, ECM nedfall, teknik cell ark eller elektrospinning. Electro skapar non-woven porösa 3D mattor av fibrer med diametrar som sträcker sig från nanometer till mikrometer, replicating naturliga ECM dimensioner. Electrospun byggnadsställningar alltmer används som 3D cellodlings plattformar -. Manipulering av elektrospinning parametrar tillåter intrikata kontroll över ställnings egenskaper såsom porstorlek, fiberdiameter, topografi och justering och ytkemi. Förändringar i sådana parametrar har visat sig direkt påverka cellvidhäftning och tillväxt, när celler odlades i isolering.
Dessa fördelar har utnyttjats i föreliggande studie för att tillåta odling av flera celltyper som en enda 3D vävnadskonstrukt, med hjälp av luftvägs bronkiol som modell 3D vävnadsstruktur. Den bronchiole väggen består av tre huvudområden (Figur 1). Slemhinnan är där luftvägarna epitelceller sitta vid luft-vätskegränssnittet (ALI), vilket ger ett stort hinder för den yttre miljön. De bor på retikulära basalmembranet (RBM), en tätt kompakt ECM består huvudsakligen av collagsv IV perlecans och lamininer. Under slemhinneskiktet hittas direkt under slemhinnan, en mer porös region består av flera celltyper inklusive fibroblaster, myofibroblaster och infiltrerande leukocyter enligt sjukdomstillstånd. Slutligen glatt muskulatur buntar lindas runt luftvägarna i en spiralform, och består av inriktade ark av luftvägarnas glatta muskulatur (ASM). Det är den glatta muskulaturen relativa sammandragningstillstånd som styr luftvägstonus. Användningen av elektrospunna ställningar inom lungsystemet hade tills nyligen varit begränsad till regenerativa ändamål; med en electrospun trakeal Ersättning framgångsrikt transplanterade. Även framgångsrika, sådana behandlingar är begränsade i antal, och är inriktade på luftstrupen på grund av den relativa enkla karaktären av vävnadens funktion. Begränsade exempel på luftvägs modeller som används för in vitro-diagnostik finns, och är främst inriktade på släta mätningar muskelkontraktion,. Den icke-toxiska och ingenn-nedbrytbar polymer av polyetentereftalat (PET) har tidigare Electrospun, och användes i föreliggande studie för att säkerställa byggnadsställningar producerade kunde lagras under långa perioder utan att försämra (så att de kan användas "från hyllan"), och även vara lämpliga för stabil cellodling under längre tidsperioder. Tidigare studier från vår grupp har visat att användning av tre varianter av en grundläggande elektrospinning protokollet kan tre individuella PET elektrospunna byggnadsställningar ställas för att tillhandahålla optimala topografier för odling epitelceller i luftvägarna, fibroblast och glatta muskelceller i isolering 21,22 och samodling av luftvägarna epitelceller och fibroblastceller 22. Fiber diameter befanns kraftigt påverka epitel funktionalitet 22 och fiberinriktning tillät genereringen av inriktade ark av glatt muskulatur 21. Dessa studier utfördes oberoende av varandra under statiska förhållanden. I den föreliggande studien, dessa different ställningar, innehållande fullt differentierade vuxna humana celler har samodlades under en vecka vid ALI i en kommersiellt tillgänglig bioreaktor som en 3D-sektion av luftvägsväggen, vilket ger en fysiologiskt relevant in vitro-modell för att undersöka luftvägsinter cellulära svar. Även detta protokoll använder luftvägs bronchiole som ett modellsystem, skulle det kunna anpassas som en plattform för 3D samodling av slemhinnor enheter från andra organ.
Protocol
Primära ASM celler från icke-astmatiska individer isolerades från luftrörs biopsier på Glenfield Hospital (Leicester, Storbritannien) såsom beskrivits tidigare. Forskningen godkändes av Leicestershire etikkommittén och patienter gav sitt skriftliga informerade samtycke.
1. Electro PET Ställningar (figur 2)
- Bered en lösning (10 ml) av dryck flaskmaterial av PET i en 1: 1 diklormetan (DCMro) - trifluorättiksyra (TFA) lösning. PET koncentrationer av 8%, 30% och 10% vikt / volym (vikt / volym) krävs för nanofiber, microfiber och inriktade ställningar respektive och sedan röra om lösningen O / N vid RT för PET att lösa.
- Överför PET lösningen i en spruta och bifoga en 23-G (för nanofiber) eller en 18-G (för mikrofiber och linje) nål på sprutan och placera sprutan i en motoriserad sprutpump. Se till att nålens spets roteras till botten.
- Placera mandrel 15 cm från spetsen av nålen, som säkerställer att nålen är riktad mot trummans centrum.
- Fäst elförsörjningen till nålspetsen med krokodilklämmor och jorda spindeln (via bananuttag) till jord. Slå på strömförsörjningen till kärnan och inställda hastigheten till 60 varv per minut (motsvarande cirka 13,2 m · min -1) för nanofiber och microfiber ställningar. Ställ in hastigheten till 2000 rpm (motsvarande ca 440 m · min -1) för inriktade byggnadsställningar.
- Ställ sprutpumpen till en flödeshastighet av 0,5 ml • h -1 för nanofiber slump och inriktade stödstrukturer eller 2,0 ml • h -1 för mikrofiber ställningar. Låt pumpen gå tills lösningen strängsprutas från nålspetsen för att avlägsna eventuell luft i nålen. Sedan stoppa pumpen.
- På sprutpumpen, ställa den totala volymen av lösning som skall utvisas till 2 ml och starta pumpen.
- Ställ strömförsörjningen till 14 kV, och slå på strömmen supply.
- Electrospin tills 2 ml lösning har Electrospun (4 timmar för nanofiber och inriktade ställningar, 1 timme för mikro ställningar).
- Skär ställningen med ett blad längs bredden av dornen. Detta producerar en 2D ark av byggnadsställning storleken dornens yta (i detta fall, ett rektangulärt ark 22 cm x 11 cm), som kan noggrant skalas av dornen). Förvara byggnadsställning i aluminiumfolie för att minska elektrostatisk laddning).
Obs: Bifasisk byggnadsställningar tillverkas genom sekventiell elektrospinning en nanofiber byggnadsställning direkt på en microfiber byggnadsställning.
2. Sterilisering av byggnadsställningar före användning i cellodling
- Från ställningen ark, stansa ut skivor av bifasiska eller inriktade ställningar med hjälp av en 0,8 mm diameter biopsi penna och hålla sig till packning med hjälp av giftfria akvarium lim.
- Sterilisera byggnadsställningar som använder ultraviolett bestrålning under 30 min på varje sida av de ställningar innan blötläggning i en 20% Vol / vol antibiotisk / antimykotisk lösning (2x10 5 enheter ml -1 penicillin G, 2000 mg ml -1 streptomycinsulfat och 500 ^ g ml -1 amfotericin B) O / N vid 4 ° C.
- Tvätta ställningar med PBS 3 gånger, och sedan lagra ställningar i TCP-brunnsplattor i PBS vid 4 ° C fram till användning.
3. cellodlingsmedia Beståndsdelar
- Kultur CALU3 epitelceller i DMEM-F12-medium kompletterat med 10% volym / volym fetalt kalvserum (FCS), 2 nM L-glutamin-lösning, 1% volym / volym antibiotisk / antimykotisk lösning (10 tusen enheter ml -1 penicillin G, 100 mg ml -1 streptomycinsulfat och 25 pg ml -1 amfotericin B).
- Kultur MRC5 fibroblastceller och ASM-celler i DMEM-medium kompletterat med 10% volym / volym fetalt kalvserum (FCS), 2 nM L-glutamin-lösning, 1% volym / volym antibiotisk / antimykotisk lösning (10 tusen enheter ml -1 penicillin G, en00 mg ml -1 streptomycinsulfat och 25 pg ml -1 amfotericin B).
- Kultur epitel-fibroblast-ASM cell co-kulturer i en 70:30 DMEM-F12: DMEM-medium blandning.
4. Sådd av fibroblaster och epitelceller på Biphasic Scaffold
- I en vävnadsodlingsplatta, blöt ställningar i DMEM-kompletterat medium och inkubera vid 37 ° C under 1 h före cellsådd.
- Avlägsna DMEM-kompletterat medium, placera mikrofasen av ställningen apikalt och utsäde 1.5 x10 4 MRC5 fibroblastceller i 30 pl DMEM-kompletterat medium. Skaka plattan på en orbital skakanordning under två timmar, innan de lämnar i en inkubator vid 37 ° C 5% CO2 i luft O / N.
- Vänd ställningen över så att nanofiber fasen av ställningen ansikten apikalt, utsäde 3.0 x10 4 CALU3 epitelceller i 30 pl DMEM-F12-kompletterade medier på nanofiber fasen av ställningen och inkubera for 2 h vid 37 ° C, 5% CO2 i luft innan nedsänkning av byggnadsställningen i 70:30 DMEM-F12: DMEM-kompletterat medium O / N före överföring till bioreaktorn.
5. Sådd av ASM celler på allians Scaffold
- I en vävnadsodlingsplatta, blöt ställningar i DMEM-kompletterat medium och inkubera i 1 timme vid 37 ° C före sådd 2,5 x10 4-celler i 30 | il DMEM-kompletterat medium och inkubering under 2 h (37 ° C, 5% CO 2 i luft). Sänk byggnadsställning i DMEM-kompletteras media återgå till inkubatorn och lämna O / N innan du ställer in en tri-kultur i bioreaktorn.
6. Inrättande Tri-kulturen med hjälp av Bioreactor System (Figur 7)
- Placera den bifasiska ställningen packningen i spåret inom en kammare med den epiteliala fasen vänd uppåt in i kammaren.
- Placera det inriktade ställningen under den bifasiska ställningen (så att det ligger i anslutning till microfiber fasen av tvåfas ställningen) och lås de två kamrarna i bioreaktorn tillsammans.
- Montera två perfusion flödeskretsar som är anslutna till två medelstora reservoarer (DMEM-F12-kompletterade medier i apikala reservoar, DMEM-F12 / DMEM-kompletterade medier i basal reservoar) och pumpmedier runt de två kretsarna på ungefär 0,1 ml / min med användning av en peristaltisk pump (40 ml medium återcirkuleras genom varje krets). House har alla delar av systemet inom en inkubator vid 37 ° C, 5% CO2 i luft.
- Efter en vecka, ta bort materialet från den apikala kammaren, och kultur epitelcellerna vid ALI för ytterligare en vecka före analys.
Representative Results
Svepelektronmikroskop bilder av decellulariserad luftvägsvävnad eller immunohistologiska bilder från luftvägs biopsier identifierade önskvärda egenskaperna hos luftvägarna ECM vi ville införa i elektrospunna ställnings topografier: Native RBM matrisen består av fibrer cirka 153 nm ± 30,6 nm (medelvärde ± SD n = 50 mätningar ) i diameter (Figur 3A och 5A), medan matrisen kring RBM var mer porös i naturen (Figur 3C). Immunhistologisk snitt genom glatta muskelceller buntar visar ASM närvarande som inriktade ark av celler 21 (figur 3E). Denna information användes för att styra egenskaper som införts i elektrospunna ställningar. En roterande dorn kunde stabilt rotera med höga hastigheter (> 2000 rpm / 440 m • min -1) för att producera ställningar med inriktade fibrer. Långsam spindelrotation (60 rpm 13,2 m · min -1) påverkade inte fiberorienteringen, Men producerade ställningar med mera likformig tjocklek än när elektrospinning på en statisk platta. Genom att ändra de elektrospinning parametrar (PET-koncentration och lösning flödeshastighet), var det möjligt att skapa ställningar fibrer med diametrar av flera mikrometer eller hundratals nanometer (elektrospinning parametrar anges i tabell 1).
Elektrospunna fibrer med fiberdiametrar på naturliga RBM fibrer (150 nm) framställdes med användning av en 6% PET-lösning, dock till så låga PET koncentrationer ekvivalenta, beading av fibrerna inträffade (Figur 4A). Detta eliminerades genom att öka koncentrationen av PET-lösningen till 8% som producerade enhetliga nanofibrer som har en medeldiameter av 255 nm ± 2,4 nm (medelvärde ± SEM) och genomsnittlig porstorlek av 1,43 ^ m ± 0,02 ^ m (fig 4B, 5A & B). Att electrospin nanofibrer det var nödvändigt att minska st från 18 G 23 G, vilket gör långsammare flöden whilst upprätthålla en högre flödeshastighet och minska nål blockering, ett återkommande problem med större nål. När elektrospinning mikrofibrer, en ökning av PET-lösningen till> 30% PET leder till en brist på enhetlighet i fiberdiameter (Figur 4F) utöver flera blockeringar vid nålspetsen beroende på den höga lösningsviskositet. Enhetliga mikrofibermattor som har en genomsnittlig fiberdiameter av 2,50 ^ m ± 0,02 ^ m (medelvärde ± SEM) och genomsnittlig porstorlek av 10,45 ^ m ± 0,13 ^ m framställdes vid elektrospinning en 30% vikt / volym av PET-lösning vid en flödeshastighet av 2 ml / h -1 (figurerna 4F, 5A och B). Sekventiell elektrospinning av nanofiber ställningen direkt på en microfiber byggnadsställning (fortfarande sitter spindeln) skapade en bifasisk byggnadsställning (Figur 3D). Den genomsnittliga fiberdiametrar var 280 nm ± 20 nm och 2.30 pm ± 0,06 um för nanofiber och microfiber faser respektive,jämförbar med dimensioner enskilda nanofiber och mikrofiber ställningar. Dessutom, tjockleken hos det tvåfasiga ställningen var ungefär lika med summan av de individuella nanofiber och mikrofiber ställningar (Figur 5C). Genom att öka spindeln hastighet (2000 rpm / 440 m · min -1), var starkt inriktade nano- eller mikrofiber ställningar produceras. Den 8% vikt / volym PET-lösningen var inte optimala för framställning inriktade nanofibrer och producerade fibrer som uppvisar en våg-liknande morfologi (Figur 3F). En ökning till 10% PET nullified denna effekt, men fortfarande resulterade i en reducerad diameter fiber (216 nm ± 2,2 nm (medelvärde ± SEM)) jämfört med de slumpmässigt inriktade nanofiber ställningar. Fiberinriktning beräknades genom bestämning av avvikelsen för varje fiber: s vinkel från medelfibervinkeln. I linje nanofiber byggnadsställningar 79% av fibrer i linje (± 10 ° medelfibervinkel) jämfört med 10,2% av fibrer i slumpmässigt inriktade nanofiber scaffåringar (Figur 5D).
Den 8% nanofiber schavotten användes för att sammanfatta RBM som epitelceller är bosatta, och användes för att stödja odling av CALU3 celler (en luftväg epitelcellinje-line). Vikt / volym mikro schavotten Den 30%, är mer porös i naturen användes för att efterlikna under mucosal regionen, och odlades med MRC5 celler (en luftväg fibroblastcell-linje). Den 10% vikt / vol linje nanofiber byggnadsställning tillhandahålls topologiska referenser för att säkerställa ASM celljustering när de odlas på schavotten. Alla tre celltyper visade en ökning i lönsamheten när de odlas på deras individuella ställningar under en 2 veckors period (Figur 6A), och uttryckte celltyp specifika proteiner efter 2 veckor långa odlingsperioden (Figur 6B, 6C, och 6D). Ytterligare karakterisering av enskilda cellställnings interaktioner har rapporterats på annat håll 21,. Den sekventiella elektrospinning av nanofiber byggnadsställningpå mikro schavotten producerade en bifasisk klätterställning för samodlingen av CALU3 epitelceller och MRC5 fibroblastceller på nanofiber och microfiber faser respektive. Odlingen av de två cellerna tillsammans under statiska förhållanden har rapporterats på annat håll 22. Ytterligare arbete försöker lägga till andra cellager eller förlänga tvåfasiga odlings gånger längre än 2 veckor under statiska förhållanden misslyckades (data visas ej). Till kulturen en tri-skiktad modell över en längre period, använde vi en perfusion flöde bioreaktor. Den CALU3 och MRC5-celler såddes på den bifasiska ställningen, och ASM-celler såddes ut på en inriktad byggnadsställning, och båda odlades separat för två dagar. De två ställningar därefter köpte tillsammans för att bilda ett treskikts modell av luftvägsväggen i bioreaktom (Figur 7). Båda kamrarna perfunderades med media för 7 dagar innan den apikala epiteliala kammaren hade dess media avlägsnas och epitelceller odlades vidALI under ytterligare 7 dagar. Ställningar fixerades och antingen snittades och färgades, eller hela ställningar immunfärgades för cellspecifika markörer. Sektioner genom tri-skiktet kultur visade cellkärnor distribueras genom alla tre skikten av samodling (Figur 8B). När celler immunfärgades för cellspecifika markörer, epitelceller befolkade den apikala nanofiber fasen som ett sammanflytande cellskikt och färgades positivt för cytokeratin (fig 8C), på mikrofiberfasen, fibroblaster färgades positivt för S100A4 (fig 8D), och på de inriktade 10% byggnadsställning ASM celler färgade positivt för SM22α (Figur 8E), vilket indikerar god överlevnad av varje celltyp inom 3D-modell av luftvägsväggen.
Figur 1. Luftvägs bronchiole. Bronkial biopsi från en allvarligastmatiska luftvägar visande epitelet på retikulära basalmembranet (RBM), med det underliggande submukösa regionen befolkade med mesenkymala celler, och de omgivande glatta muskelknippen befolkade med glatt muskel-celler färgade för glatt muskel-alfa-aktin (brun). Skala bar visar 200 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. En schematisk bild av elektrospinning utrustning. En spruta innehållande polymer / lösningsmedelslösningen (med fastsatt nål) placeras på en sprutpump som vetter mot dornen. En elektrisk potential etableras mellan nålen och spindel orsakar fibrer som skall sprutas ut från nålspetsen och avsatta på den roterande dornen. Då fiber passerar genom atmosfären,lösningsmedlet avdunstar orsakar avsättning av polymerfibrer på kärnan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Jämförelse av elektrospunna ställningar till nativt luftväg ECM. Svepelektronmikroskop bilder av decellulariserade basalmembran (A), decellulariserad luftväg bronkiol tvärsnitt (C) och en histologisk sektion av en luftvägarnas glatta muskulatur knippe (färgade med hematoxylin och eosin, skala bar 40 pm) (E) jämfört med nanofiber (B) bifasisk (D) och linje (F) PET ställningar. Klicka här för att seen större version av denna figur.
Tabell 1. Parametrar som används för elektrospinning av microfiber, nanofiber och inriktade ställningar individuellt och för två faser schavotten.
Figur 4. Förändring i PET-koncentrationer påverkar fiberegenskaper. Svepelektronmikroskop bilder av elektrospunna ställningar spunna från 6%, 8%, 10% (AC), 25%, 30% och 35% (EG) (vikt / vol) PET-lösningar . Dessutom visas är inriktade ställningar produceras från 8% (D) och 30% (H) vikt / vol PET-lösningar. AD avbildas på 5,000X förstoring, EH avbildas på 1,000X förstoring. Klicka här för att se en störreversion av denna figur.
Figur 5. Egenskaper hos elektrospunna PET ställningar. (A) Distributions kurvor som visar fördelningen fiberdiameter från retikulära basalmembranet extracellulärmatrix (RBM ECM), slumpmässigt inriktade nano- och mikrofiber byggnadsställningar och inriktade nanofiber schavotten. (B) Histogram visar den relativa porstorleksfördelning i nano- och mikrofiber ställningar. (C) Genomsnittlig tjocklek av de nanofiber, mikrofiber, bifasiska och inriktade ställningar (medelvärde ± standardavvikelse, n = 6). (D) Histogram diagram som visar avvikelsen från medelfiberorientering i slumpvisa eller inriktade nanofiber ställningar Scaffold fiberanalys utfördes med ImageJ programvara. Pleasa klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Kulturen i de enskilda celltyper på de enskilda ställningar. (A) alamarBlue cellviabiliteten analysresultat för ASM celler på linje ställningar, CALU3 celler på nanofiber byggnadsställningar och MRC5 celler på mikro ställningar (medelvärde ± SEM, n = 3- 20). Svepelektronmikroskop bilder av nanofiber, microfiber och inriktade fiber ställningar (B, C och D respektive) och immunofluorescerande bilder av CALU3 celler färgade för E-cadherin (röd), MRC5 celler färgade för vinkulin (röd) och ASM celler färgades för SM22α (röd) helt på egen specialiserade schavotten (E, F och G respektive). Hoechst användes för att färga kärnor (blå), indikerar skalan bar 40 &# 181; m. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. Perfusion system för tri-skikt luftvägsväggmodell. (A) Fotografera av bioreaktor kärl anslutet till peristaltisk pump och 2x media reservoarer. (B) Schematisk bild av tri-lager byggnadsställningar. (C) Schematisk bild av de två bioreaktor kretsar när luftvägsmodellen hålls vid luft-vätskegränssnittet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8. Komplett 3D luftvägsväggmodell. (A) Bronkial biopsi av luftvägarna väggen med slemhinneskiktet markerade i rött, betonade submukosal regionen i grönt, och den glatta muskulaturen bunt markerad i guld. (B) Sektion genom tri-lager luftvägs vägg bestående av bifasiska och inriktade ställningar befolkade med epitel, fibroblaster och glatta muskelceller fast efter 2 veckor coculture. Cellkärnor färgades med DAPI (blå) med ställningsreflektion (grå) samtidigt avbildas. Ställningar också fasta och immun för cellspecifika markörer efter 2 veckor, med CALU3 celler färgade för cytokeratin (grön) (C), MRC5 celler färgade för S100A4 (grön) (D), och glatta muskelceller färgas för SM22α (röd) ( E). Skala bar visar 200 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1.
Discussion
Förmågan att electrospin polymerfibrer med strukturella egenskaper som är jämförbara med naturliga ECM har lett till ett stort antal naturliga eller syntetiska polymerer, eller polymerblandningar vara electrospun att återskapa dessa miljöer,. Manipulering av processparametrarna (inklusive polymer val, polymerkoncentration, lösningsmedel, nålspets avstånd och temperatur) kan alla påverka ställnings egenskaper; men vissa parametrar kan ha större inverkan på ställnings egenskaper än andra 25,. När modifiera PET-fiberdiameter, fann vi de nyckelparametrar vara koncentrationen av den använda polymeren, den hastighet med vilken polymerlösningen var electrospun, och nålens diameter. När elektrospinning inriktade fibrer de viktigaste parametrarna är insamlingsmetod som används (en roterande kärna), och den hastighet med vilken spindel roterar. Genom att reducera spindelhastigheten till 60 rpm, fann vi slumpmässigt inriktade byggnadsställningar producerade visade större byggnadsställning unistämmelse jämfört med elektrospinning på en plan samlingsplattan.
Egenskaperna hos decellulariserade luftvägsvävnad analyserades för att ge vägledning för de olika ställningskretsmönster som utvecklats för odling av varje luftvägs celltyp. Elektrospunna nanofibrer är ett attraktivt byggnadsställning för att replikera basalmembranstrukturer på grund av den lilla porstorleken men hög total porositet som medger ökad metabolit diffusion samtidigt begränsa cellulär rörelse. 9 Medan optimera elektrospinning parametrar, var ett intervall av PET-koncentrationer och flödeshastigheter testas. De tunnaste fibrerna uppnås med hjälp av en 6% vikt / vol PET lösning, som tidigare använts av andra grupper. Höga nivåer av beading, och brist på enhetlighet var ständiga problem. Initiala försök att avlägsna beading ingår tillsats av ett katjoniskt ytaktivt medel, cetyltrimetylammoniumbromid (CTAB), till lösningen för att sänka ytspänningen och testa olika källorPET. Tillsatsen av tensid minskade mängden beading, men inte helt. Efter att ha provat ett antal kommersiella källor av PET-pellets, var livsmedelskvalitet dryck flaska PET används, genom att skära upp drycker flaskor och upplösning dessa i DCM: TFA lösningsmedelslösning. Med detta som PET källa resulterade i en ökning av fiber enhetlighet och en minskning av fiber beading. Genom att öka lösningens koncentration något till 8% vikt / volym och minska nåldiametern (18G till 23G) vi konsekvent producerat felfria Nanofiber med en fiberdiameter på ca 250 nm. Electrospun nanofiber ställningar kan vara mycket elektro i samband med hämtning från kärnan gör manuell hantering av byggnadsställningar svåra. Detta förbättrades genom att lagra ställningar i aluminiumfolie efter spinning och blötläggning i 70% IMS före användning. Detta visade sig bidra till att skingra den återstående elektrostatisk laddning kvar på schavotten från electroprocessen.
Att ge toppenographies liknar de enskilda mikromiljöer möter de tre huvudvägarna celltyper inom luftvägsväggen, var en grundläggande elektrospinning protokoll anpassad för att producera tre unika ställningar för dessa celltyper: genom elektrospinning en låg koncentration PET lösningen långsamt, randomiserades inriktade Nanofiber genereras, på vilken epitelceller såddes (härma RBM). Genom elektro en högre koncentration PET lösning i en snabbare takt, valdes slumpmässigt inriktade mikrofibrer alstras (som producerar en mer porös byggnadsställning), in i vilken fibroblaster ympades (mimicking omedelbart sub-mukosala området under RBM). Genom elektro en låg koncentration PET-lösningen på en hög hastighet roterande dorn inriktade nanofibrer producerades, på vilken glatta muskelceller orienterade i fiberriktn, producerar inriktade ark av celler.
Ökade fiberdiametrar leda till ökad porstorlek, vilket gör att större cell penetration till byggnadsställningar och så bidra till att skapa en verklig 3D-miljö,. Mikrofiber ställningar användes för odlingen av fibroblaster i studien för att säkerställa att cellerna bosatt på flera plan inom ställningen. Genom att öka PET-koncentrationen till 30% vikt / volym, var PET-fibrer med en genomsnittlig diameter av 2,5 | j, m produceras. Fibrer större diameter (≈ 4 um) framställdes med hjälp av en 35% vikt / vol PET lösning, men ställningen tjocklek enhetlighet förlorades, och högre variabilitet mellan enskilda fibrer var uppenbar. Porer i mikrofiber schavotten var över 7 gånger högre än de som uppmätts i nanofiber ställningar (10.45 pm vs 1,43 respektive pm), men fortfarande statisk sådd av celler under förutsättning begränsad cellulär penetration. Detta förbättrades genom att dynamiskt ympning av cellerna med användning av en orbital-blandare, en metod visat sig vara effektiv tidigare.
Mycket inriktade nanofiber ställningar skapades genom elektrospinning en 10%vikt / volym PET-lösningen på dornen roterande med 2000 varv per minut (≈ 440 m • min -1). Den PET-koncentrationen ökades från 8% för att förhindra en oregelbunden våg-liknande morfologi som fibrer uppvisade vid lägre koncentrationer. Trots den ökade koncentrationen och rikta in fibrerna minskade den genomsnittliga fiberdiametern (216 nm jämfört med 255 nm, i linje kontra slumpmässiga). Den höga hastigheten hos dornen dra fibrerna innan de har torkat är sannolikt att orsaka denna effekt. Anpassningen av fibrerna påverkade anpassningen av ASM celler, och har även andra fysiologiska effekter på ASM celler som har präglats på annat håll 21.
Den största begränsningen av detta protokoll är oförmågan att avbilda levande celler på / i ställningar gör ursprungliga cellfäst eller differentiering över en längre tidsperiod omöjligt att avgöra utan att göra avkall prover. Detta innebär att de flesta optimering inträffar efter odlingsperioden, det vill säga, fixaing prover och sedan mäta huruvida cellkultur lyckades efter inte under cellodling. Observation en färgförändring i byggnadsställningar inkuberade i alamarBlue (blå till rosa) visar celler är närvarande och livskraftiga, men är inte idealisk. Electro mer transparenta polymerer såsom gelatin kan hjälpa till att visualisera celler på byggnadsställningar. Den elektrospinning av en nanofibrous byggnadsställning inom vår modell tillät replikationen av luftvägs RBM, på liknande sätt består av täta nanofibrer där epitelcellerna bor. Det har tidigare visats att strukturella celler inte kan migrera genom nanofiber byggnadsställning 22, även om immunceller kan (data ej visade). Medan fördelaktig för odling av specifika celltyper på en 3D-yta (såsom epitel- och endotelceller), kan detta förebygga strukturell cellmigration genom Nanofiber vara skadligt för odling av andra celltyper. Som glatt muskulatur inte kan migrera genom the inriktade nanofiber schavotten vi samlat tri-lager coculture med den glatta muskulaturen och fibroblast skikt mot varandra (till skillnad från den linje schavotten som skiljer de två celltyper). Även om detta gör det möjligt för cellerna att stå i nära beröring, kan den aktuella studien inte dra slutsatsen huruvida en celltyp (antingen fibroblast eller glatt muskel) skulle gå om hela skiktet över en mer förlängd odlingsperiod. Trots dessa begränsningar, har en livskraftig treskikt modell av luftvägsväggen har utvecklats som ger en alternativ plattform för att undersöka samspelet mellan dessa olika celltyper. Ett liknande tre-skiktad studien har nyligen publicerats där fibroblaster var inbäddade i en cylindrisk kollagen I hydrogelen med glatt muskulatur ympas på den yttre ytan och epitelceller inom den luminala ytan 17. Den mekaniska stabiliteten hos de elektrospunna byggnadsställningar utvecklats här skulle tillåta liknande rörformade konstruktioner som skall bildas, och förblir en ström reseaRCH syftar inom vår grupp. Även om studien har fokuserat på luftvägarna, flera organ i kroppen dela denna grundläggande slemhinna konstruktionsenhet och genom att modifiera hyresgästerna lyfts fram i denna studie skulle liknande plattformar utvecklas för vävnader som innehåller en källare membranenhet inklusive blodkärl, urinblåsan och hornhinnan, där kollagenbaserade flerskiktade modeller har använts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylene terephthalate (PET) | Lucozade (GSK) bottles | N/A | Source of PET for electrospinning. Cut into small pieces and weigh out as necessary |
| Dichloromethane (DCM) | Solvent for PET | ||
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma | Solvent for PET | |
| Rotating Mandrel | Built in house | Used to collect electrospun fibres. By rotating at different speeds, fibres can be aligned or randomly oriented | |
| Syringe Pump | Harvard apparatus | used in the electrospinning process | |
| DMEM-F12 | Gibco | Culture medium for CALU3 cells | |
| DMEM | Gibco | Culture medium for HASM cells | |
| MEM | Gibco | Culture medium for MRC5 cells | |
| Antibiotic/ antimycotic solution | Gibco | Media supplement | |
| FCS | Gibco | Media supplement | |
| Orbital mixer (Orbital shake 503) | Stuart Scientific | For dynamic seeding of cells onto microfibre scaffolds | |
| Peristaltic Pump | Watson Marlow | For providing media flow through bioreactor | |
| 3DKube | Kiyatec | Bioreactor for 3D cell culture |
References
- Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).
- Song, J., Guyette, J., Gilpin, S. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature medicine. 19 (5), 646-651 (2013).
- Wenzel, S., Holgate, S. The mouse trap: it still yields few answers in asthma. American journal of respiratory and critical. 174 (11), 1171-1173 (2006).
- Zosky, G. R., Sly, P. D. Animal models of asthma. Clinical and experimental allergy journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. 37 (7), 973-988 (2007).
- Bates, J. H. T., Rincon, M., Irvin, C. G. Animal models of asthma. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 297 (3), L401-L410 (2009).
- Johansson, F., Carlberg, P., Danielsen, N., Montelius, L., Kanje, M. Axonal outgrowth on nano-imprinted patterns. Biomaterials. 27 (8), 1251-1258 (2006).
- Paik, I., et al. Rapid micropatterning of cell lines and human pluripotent stem cells on elastomeric membranes. Biotechnology and bioengineering. 109 (10), 2630-2641 (2012).
- Williams, C., et al. Aligned Cell Sheets Grown on Thermo-Responsive Substrates with Microcontact Printed Protein Patterns. Advanced Materials. 21 (21), 2161-2164 (2009).
- Schindler, M., et al. A synthetic nanofibrillar matrix promotes in vivo-like organization and morphogenesis for cells in culture. Biomaterials. 26 (28), 5624-5631 (2005).
- Schindler, M., et al. Living in Three Dimensions. Cell Biochemistry and Biophysics. 45 (14), 215-227 (2006).
- Ahmed, I., et al. Morphology, cytoskeletal organization, and myosin dynamics of mouse embryonic fibroblasts cultured on nanofibrillar surfaces. Molecular and Cellular Biochemistry. 301 (1-2), 241-249 (2007).
- Flemming, R., Murphy, C., Abrams, G. Effects of synthetic micro-and nano-structured surfaces on cell behavior. Biomaterials. 20, 573-588 (1999).
- Sun, T., et al. Development of a 3D Cell Culture System for Investigating Cell Interactions With Electrospun Fibers. Biotechnol. Bioeng. 97 (5), 1318-1328 (2007).
- Kim, D. -H., Provenzano, P. P., Smith, C. L., Levchenko, A. Matrix nanotopography as a regulator of cell function. The Journal of cell biology. 197 (3), 351-360 (2012).
- Jeffery, P. K. Remodeling in Asthma and Chronic Obstructive Lung Disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164 (10 pt 2), S28-S38 (2001).
- Jungebluth, P., et al. Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: a proof-of-concept study. Lancet. 378 (9808), 1997-2004 (2011).
- Miller, C., George, S., Niklason, L. Developing a tissue-engineered model of the human bronchiole. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. (July), 619-627 (2010).
- West, A. R., et al. Development and characterization of a 3D multicell microtissue culture model of airway smooth muscle. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 304 (1), L4-L16 (2013).
- Nesmith, A. P., Agarwal, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Human airway musculature on a chip: an in vitro model of allergic asthmatic bronchoconstriction and bronchodilation. Lab on a chip. , (2014).
- Hadjizadeh, A., Ajji, A., Bureau, M. N. Nano/micro electro-spun polyethylene terephthalate fibrous mat preparation and characterization. Journal of the mechanical behavior of biomedical materials. 4 (3), 340-351 (2011).
- Morris, G., et al. Human airway smooth muscle maintain in situ cell orientation and phenotype when cultured on aligned electrospun scaffolds. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (1), L38-L47 (1999).
- Morris, G. E., et al. A novel electrospun biphasic scaffold provides optimal three-dimensional topography for in vitro co-culture of airway epithelial and fibroblast cells. Biofabrication. 6 (3), 035014 (2014).
- Sell, S., et al. The Use of Natural Polymers in Tissue Engineering: A Focus on Electrospun Extracellular Matrix Analogues. Polymers. 2 (4), 522-553 (2010).
- Subbiah, T., Bhat, G. S., Tock, R. W., Parameswaran, S., Ramkumar, S. S. Electrospinning of nanofibers. Journal of Applied Polymer Science. 96 (2), 557-569 (2005).
- Dalton, P. D., et al. Electrospinning and additive manufacturing: converging technologies. Biomaterials Science. 1 (2), 171 (2013).
- Boland, E. D., Wnek, G. E., Simpson, D. G., Pawlowski, K. J., Bowlin, G. L. Tailoring tissue engineering scaffolds using electrostatic processing techniques: A study of poly(glycolic acid) electrospinning. Journal of Macromolecular Science-Pure and Applied Chemistry. 38 (12), 1231-1243 (2001).
- Stitzel, J. D., Bowlin, G. L., Mansfield, K., Wnek, G. E., Simpson, D. G. Electrospraying and electrospinning of polymers for biomedical applications. Poly(lactic-co-glycolic acid) and poly(ethylene-co-vinylacetate). Revolutionary Materials: Technology And Economics. 32, 205-211 (2000).
- Liu, W., Thomopoulos, S., Xia, Y. Electrospun nanofibers for regenerative medicine. Advanced healthcare materials. 1 (1), 10-25 (2012).
- Veleirinho, B. Solvent and concentration effects on the properties of electrospun poly (ethylene terephthalate) nanofiber mats. Journal of Polymer. , 460 (2008).
- Balguid, A., et al. Tailoring Fiber Diameter in Electrospun Poly(epsilon-Caprolactone) Scaffolds for Optimal Cellular Infiltration in Cardiovascular Tissue Engineering. Tissue Engineering Part A. 15 (2), 437-444 (2009).
- Shalumon, K. T., et al. Fabrication of three-dimensional nano, micro and micro/nano scaffolds of porous poly(lactic acid) by electrospinning and comparison of cell infiltration by Z-stacking/three-dimensional projection technique. IET nanobiotechnology / IET. 6 (1), 16-25 (2012).
- Thevenot, P., Nair, A., Dey, J., Yang, J., Tang, L. Method to Analyze Three-Dimensional Cell Distribution and Infiltration in Degradable Scaffolds. Tissue Engineering Part C-Methods. 14 (4), 319-331 (2008).
- Rose, J., et al. Gelatin-Based Materials in Ocular Tissue Engineering. Materials. 7 (4), 3106-3135 (2014).
- Liliensiek, S. J., Nealey, P., Murphy, C. J. Characterization of Endothelial Basement Membrane Nanotopography in Rhesus Macaque as a Guide for Vessel Tissue Engineering. Tissue Engineering Part A. 15 (9), (2009).
- Abrams, G. A., Murphy, C. J., Wang, Z. -Y., Nealey, P. F., Bjorling, D. E. Ultrastructural basement membrane topography of the bladder epithelium. Urological research. 31 (5), 341-346 (2003).
- Abrams, G. A., Bentley, E., Nealey, P. F., Murphy, C. J. Electron Microscopy of the Canine Corneal Basement Membranes. Cells Tissues Organs. 170 (4), 251-257 (2002).
- Reichl, S., Bednarz, J., Muller-Goymann, C. Human corneal equivalent as cell culture model for in vitro drug permeation studies. British Journal of Ophthalmology. 88 (4), 560-565 (2004).
