Protocol
הפרוטוקולים ושימוש בחיות ניסוי אושרו על ידי ועדות טיפול בבעלי החיים ושימוש המוסדיים באוניברסיטת של יאמאנאשי והאוניברסיטה ואסדה. טיפול בבעלי חיים בוצע בהתאם להנחיות מוסדיות.
1. הכנת CPEC
- הכן את המנגנונים וחומרים הבאים: מיקרוסקופ סטריאו, מסוגל לשדר תאורה מלמטה רצוי; זוג המלקחיים שען (דומון # 3 או מס '4), מעוקר להבה, מספריים הפעלה ישר, מעוקר להבה; שתי מנות 10 סנטימטרים פלסטיק סטרילית המכילות 20 בינוני ליבוביץ L-15 מיליליטר קר כקרח; זכוכית תחתונה מנות 35 מ"מ המכילות 2 מיליליטר RT ליבוביץ בינונית L-15; כוס 100 מיליליטר המכילה 70% אתנול; גורי עכבר יילודים.
- בקצרה לטבול עכבר בילוד באתנול 70% ולהרדים במהירות על ידי עריפת ראש באמצעות המספריים ההפעלה.
- מניחים את הראש מייד במדיום ליבוביץ L-15 קר כקרח בdi 10 סנטימטרים סטריליsh.
- הסר את העור ממִכסֵה הַגוּלגוֹלֶת באמצעות זוג המלקחיים שען, לחתוך לפתוח את הגולגולת כדי לחשוף את המוח, ולאחר מכן לחתוך את עצבי גולגולת כדי לבודד את המוח כולו.
- העבר את המוח למנה חדשה המכילה בינוני ליבוביץ L-15 קר כקרח ולהתבונן תחת מיקרוסקופ סטריאו, ולוודא כי המוח הוא שקוע לחלוטין במדיום.
- הגדר את היבט הגב של המוח פונה כלפי מעלה, ולכוון את המוח כך שנורות חוש הריח מתגוררות במיקום השעה שלוש (לאנשים בידיים הנכונים). החזק את המוח בעדינות עם המלקחיים ביד השמאל.
- שימוש במלקחיים לנתיחה הקנס (דומון # 3 או מס '4) ביד ימין, חתך את כפיס המוח ומתחת parenchyma חיבור אונות המוח, לאורך בקע האורך של המוח הגדול.
- דחף בעדינות את אונות המוח משם לצדדים לרוחב ולחשוף את סדק המוח הרוחבי.
- הפרד את ההמיספרות על ידי צובט את הparenchyma דואר בין חצי הכדור והתלמוס.
- משוך בעדינות את מקלעת דמית העין חדרית הרוחב שמחוברת לצד לרוחב של ההיפוקמפוס ידי affixa lamina.
- העבר את מקלעת דמית העין המבודדת לצלחת הזכוכית תחתונה 35 מ"מ המכילה בינוני ליבוביץ L-15 טריים, וכיסוי במשקל (חומרי רשימה) בעדינות להחזיק את הרקמות במקום.
2. הדמית חיה של CPEC צילה
- לאשר אולטרה סגול נכון (UV) ומסנן לחתוך להסיק (IR) (ים) כדי לחסום אור קצר יותר מ -400 ננומטר ועוד מ 700 ננומטר, ושצפיפות ניטראלית (ND) מסננים (25% ו -6%) מוכנס בנתיב האור של מיקרוסקופ ההפוכה.
- התאם את המיקוד של העדשה האובייקטיבית בערך לפי העין, ולאחר מכן להתאים את הקבל כך שהמרכז והמוקד כדי להתאים את תאורת קוהלר. פריזמה הכנס התערבות ההפרש לעומת זאת מתאימה (DIC), אלמנט דסק"ש, כמו גם אלמנטי מנתח והמקטב בliדרך להילחם כדי להתאים אופטיקה דסק"ש.
- כוון את הניגודיות של תצוגה על ידי עמדת פריזמה דסק"ש, כך שהמבנה של פני השטח הרקמה הוא מוכר ביותר. אם כל cilia של תאי המטרה הוא ניעתי, לא ניתן לקבל תצוגה ברורה של cilia ניע לפי העין בגלל התנועה שלהם.
- לשנות את נתיב האור למצלמת וידאו, והסר את מסנני ND להגדיל את כוח האור.
- השתמש במצלמה בהתמקדות מצב כדי להתאים את שדה הראייה והמיקוד. במהלך התמקדות, שבתמונות וידאו מוצגות בזמן אמת על המסך, תצוגה ברורה של cilia ניע אינה זמינה.
- השתמש במצלמה ב 200 הרץ עם זמן חשיפה של 0.1 מילים-שני לתקופה הרצויה (שניות עד דקות). לאחר רכישת מחסנית התמונה, מסגרות בודדות יציגו מבני הריסים ברורים. אם קצות הריסים הם מטושטשים, להגדיל את מסגרת הדולר או להשתמש זמן חשיפה קצר יותר.
- רשום את התנועה של cilia CPEC בתוך 25-60 דק 'לאחר המתת חסד בליבוביץL-15 בינוני.
3. ניתוח של ריסי Motion
- ידני לעקוב אחר להכות דפוסים של כל cilium על צג המחשב. עמדות קצה ריסי מארק בכל מסגרת עם סמן העכבר, אשר התאסף למידע מסלול של כל cilium. או לנתח את מידע המסלול תוך שימוש באותה תוכנה או לייצא ליישומים כלליים יותר אחרים לניתוח נוסף. היעילות של צעד ניתוח זה מתואר בדיון.
- לסווג את המסלולים לשני מצבים של תנועה, גב ו-ושוב או סיבובי, לפי העין.
- לחשב את תדירות פעימות הריסים (CBF) באמצעות הנוסחא הבאה: [CBF = (מספר הפריימים לשניה) / (מספר הפריימים ממוצע לפעימה אחת)] 14, שניתן להשיג מתרשים תנועת קצה הריסים (איור 3 ). חזור על חישוב זה למחזורי מכות הריסים מרובים, כי cilia האחר באותו התא יכול להפריע לתנועה של כל ciliuמ ', וכתוצאה מכך אי סדירות.
- כדי לנתח את האחידות הזוויתית של ריסי מכות צירים בתוך תא בודד, להגדיר את זווית θ מכות לכל מסלול (איור 4). למסלולי גב ו-ושוב, שיתאים לעמדות של קצה הריסים לקו ישר, ולהגדיר θ כזווית הקו עושה עם x -axis. למסלולים סיבוביים, שיתאים לעמדות לאליפסה, ולהגדיר θ כמו זווית הציר המרכזי של האליפסה עושה עם x -axis. פרטים של ההולם מתוארים בסעיף נציגי תוצאות.
- לתיאור כמותי של כל מסלול, לחשב AR יחס היבט הכללי. בקצרה, לסובב את המסלול על ידי - θ ולהגדיר AR כיחס בין הרוחב של ההפצה לאורך x - ו-axes y (איור 4). פרטים מוצגים בסעיף נציג תוצאות, והפרשנות, משמעות, וההגבלה של הפרמטר מתוארות בדיון.
לדוגמא הכנה 4. לSEM
הערה: SEM הוא שיטה חשובה להעריך את המצב של cilia על CPECs באופן מקיף. כדי להכין דגימות לSEM, הליך סטנדרטי שדווח בעבר 15 מועסקים בשינויים קלים.
- לפני לנתח את הרקמה מהמוח, להכין מקבע בבקבוקון זכוכית 5 מיליליטר עם מכסה פוליאתילן. מקבע מורכב paraformaldehyde 2%, glutaraldehyde 2.5% (הפתרון של Karnovsky מחצית 16) במאגר M 0.1 פוספט, pH 7.4.
- לנתח את הרקמה מהמוח כמתואר בשלב 1.
- בקצרה לשטוף את הרקמה המבודדת עם הפתרון של האנק המאוזן מלח (HBSS) בצלחת חדשה ולאחר מכן לתקן את הרקמות במקבעות בבקבוקון הזכוכית עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר. השתמש טפטפות העברה חד פעמית ולטפל דגימות GEntly. לאחר השטיפה בHBSS, הרקמה הופכת דביקה.
- כדי להעביר את הדגימות לפתרון מקבע, לגרש לאט כמות קטנה של תמיסה המכילה רקמה מפיפטה ההעברה כטיפה ומוסיף למקבעים.
- לאחר קיבוע, לבטל את מקבע ולשטוף את הרקמה עם חיץ פוספט שלוש פעמים.
- לטבול את הרקמה בתמיסת סוכרוז 10% לשטוף את אלדהידים שנותרו. כדי להבטיח חיסול אלדהידים מלא, לטבול את הדגימות בפתרון עבור 10 דקות ולאחר מכן לחזור פעמיים עם סוכרוז 10% טריים. שלב זה חשוב כדי להשיג פוסט קיבעון-נכון בשלבים הבאים.
- לטבול את הרקמה בתמיסה של 1% tetroxide אוסמיום בחיץ פוספט למשך 30 דקות ולאחר מכן למקם על קרח להודעה קיבעון. לשפוט את מידת osmification על ידי צבע המדגם: כאשר אלדהידים יוסרו לחלוטין, המדגם הוא שחור.
- שטוף את דגימות רקמה קבועות פוסט נרחב עם distille הכפולכמה פעמים מים ד.
- מייבש את הדגימות על ידי טבילה בריכוזים מדורגים של אתנול, בדרך כלל 65%, 75%, 85%, 95%, 99%, ו -100%, במשך 10 דקות כל אחד. להשיג אתנול נטול מים על ידי הצבת הנפות מולקולריות ל99.5% אתנול מבקבוק חדש שרכש. חזור על התייבשות עם שלוש פעמים אתנול נטול מים.
- מניחים את הדגימות המיובשים לתוך אצטט isoamyl, מגיב חילוף לייבוש נקודה קריטי, במשך 10 דקות. חזור על פעולה זו פעמיים. מגיב זה מתאדה במהירות והמדגם יכול להיות יבש, וכתוצאה מכך הרס על ידי מתח פנים. לכן, לא לייבש את המדגם לחלוטין.
- לאחר חילופי הסופיים של אצטט isoamyl, להסיר את רוב הממס, מייד לעטוף את בקבוקון הזכוכית הפתוח בנייר אלומיניום, ומניח את הבקבוקון על קרח יבש. באמצעות מחט או מלקחיים בסדר, לעשות כמה חורים בנייר הכסף המכסה את הפה של הבקבוקון, כך שנוזל פחמן דו חמצני זורם בקלות לתוך הבקבוקון במייבש הנקודה הקריטי. להמשיך לשלב הבאמהר ככל האפשר.
- בשלב זה, למזער את שריד של אצטט isoamyl לתוך התא של מייבש, אבל אל תנתנו לי המדגם להתייבש לפני ייבוש נקודה קריטי לחלוטין. בנוסף, אל תשאיר את המדגם על קרח יבש לזמן ארוך שלא לצורך, כדי למנוע היווצרות של כפור על הבקבוקון.
- העבר את בקבוקוני זכוכית עטוף בנייר האלומיניום המכילים דגימות הרקמה למייבש הנקודה הקריטית שמבטיח את המבנה של רקמות המשטח נותר בשלמותה בזמן שהכילו מים הסרת ברקמה. ניתן להשיג מידע מפורט על הפעלת מייבש הנקודה הקריטית מהוראות היצרן.
- ידית הדגימות באמצעות זהירות קיסם כדי למזער את הנזק מכאני. דגימות רקמה מיובשות וכתוצאה מכך הן שבירות. הר הדגימות של ספחי מתכת ומעיל עם זהב-פלדיום באמצעות גמגום יון.
5. תצפית על ידי SEM
- שים לב על ידי SEM ולהקליט תמונות עם מצלמה דיגיטליתמצויד למיקרוסקופ אלקטרונים סורק.
- העבר את נתוני תמונה דיגיטליים למחשב לניתוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סקירה של העבודה מוצגת באיור 1, כולל תמונות של המכשירים.
תצפיות תנועה חיים של CPECs
סרט 1 מציג סרט של CPECs מבודד מעכבר סביב הלידה, וסרט 2 מראה תצוגה מורחבת של התמונות בסרט 1. יש לציין כי טיפים הריסים בודדים הם פחות ברורים בתמונות סטילס בהשוואה לאלו בסרטים. איור 2 מראה מעקב של התנועה של שני cilia עם מצבים שונים של תנועה, גב ו-ושוב ותנועות סיבוביות, מהנתונים המוצגים בסרטי 1 ו -2. איור 3 מראה ניתוח פשוט של המסלולים של cilia, שבו הפרש המופע בשתי הקואורדינטות ברורה בתנועה הסיבובית.
ניתוח של מסלולי קצה ריסי CPEC
דה שיטות זנב לנתח כל מסלול כמותית מוצגות באיור 4 עם איורים סכמטי של הגדרות θ זווית המכות () ותרשים זרימה של הניתוח עם תוצאות נציג (B).
כדי להגדיר את זווית θ המכות למסלולי גב ו-ושוב, שיתאים לעמדות של קצה הריסים במהלך מחזורים מרובים לy = גרזן קו ישר + b, ולהגדיר את כיוון המכות כמו שלאורך הקו המצויד. הגדר את זווית המכות כאן כθ = Arc שיזוף. בגלל הקו ההולם לעתים קרובות לא מצליח לחלץ את הכיוון במקרים של תנועה סיבובית, להתאים את המסלולים סיבוביים לאליפסה, ולהגדיר את הכיוון שכלאורך הציר של האליפסה המצויד הארוך. לייתר דיוק, עמדות הקצה (x, y) במהלך מחזורי מכות מרובים מצוידות לפונקציה להלן.
"Width =" 310 1.jpg "/>
שם 
ראוי האליפסה כרוכה חמישה פרמטרים מתאימים: x 0, y 0, a, b, וθ. X - וקואורדינטות -spatial y של מרכז האליפסה הם x ו- y 0 0, בהתאמה. רדיוס הגדול והקטנה של האליפסה הוא A ו- B, בהתאמה. θ הזווית הוא הזווית שהציר המרכזי עושה עם x -axis, או זווית המכות. ייצוג סכמטי של פרמטרים אלה מוצג בלוח השמאלי של איור 4 א. הראוי מתבצע באמצעות תוכנת Pro איגור על ידי הגדרת הפונקציה המפורשת שתוארה לעיל. לאחר מכן, היסטוגרמה של מכות θ זווית לכל cilia לצפותד באותו התא הוא להתוות כמו היסטוגרמה עגולה (איור 2 באל Narita et. 8). התדירות מנורמלת מספר הטיפים הריסים ניתחו. יש לציין כי כל cilium מתפרש לשני θ ערכים בהיסטוגרמה המעגלית, למשל π / 4 ו3π / 4, שהוביל לחלוקה סימטרית של הכיוון.
כדי להגדיר AR יחס היבט הכללי, עמדות קצה הריסים במהלך מחזורים מרובים מסובבות על ידי - θ (איור 4). על פי הסיבוב, שני-ושוב חזרה ומסלולים סיבוביים הפכו מופצים כ מקביל לx -axis, שבו הרוחב של ההפצה A ו- B, לאורך X- וy-צירים, בהתאמה, מוגדר כמחצית מ ההבדל בין המינימום והמקסימום. לכן, פרמטרים אלה הם רלוונטיים יותר לרדיוס הגדול והקטנים של האליפסה, A ו- B. AR אז מוגדר כיחס בין A ו- B על ידי AR = B /.
תצפיות של האפיתל מקלעת דמית העין על ידי SEM
SEM מאפשר התבוננות במבנה פני השטח הקנס של דגימות. הנוכחות של cilia על CPECs הוא אישר במהלך קורס הזמן התפתחותי. הופעתם של ריסים מרובים בCPECs הוא ציין ביום העוברי (E) 13, זמן קצר לאחר פיתוח מקלעת דמית העין מתחיל בחדרים לרוחב סביב E11. בשלב זה, התאים קטנים עם מראה משתנה בשלה, וטיפי הריסים פונים לכיוון כיוונים שונים. בE15, ציצה של cilia מרובה הוקמה בחלק העליון של משטח הפסגה, העומדים לצאת מmicrovilli שמסביב. ביום לידה (P) 2, cilia רבים קבוע בעמדה כפופה, המשקף את תנועתיות הריסים שנצפו על ידי הדמיה לחיות. בP14, רוב התאים בעלי ריסים מרובים שהם לא ניע, כמו גם microvilli w ה- i מרקם עדין בהשוואה לשלבים המוקדמים יותר. איור 5 מראה תמונות SEM של CPECs עם ריסים בשלבים אלה. בהתבסס על הסרטים שמוצגים באיור 1 ו -1 סרטים, ברור שcilia ניע מוכר בקלות על ידי הדמיה לחיות. עם זאת, קשה להבחין cilia לא ניע על ידי מיקרוסקופ דסק"ש. כתוצאה מכך, SEM הוא הכרחי כדי להבין מדינות הריסים הכוללות.
איור 1:. סקירה כללית של זרימת העבודה (א) מיקרוסקופ סטריאו. (ב) מיקרוסקופ הפוך מצויד במצלמת מכשיר טעון מצמידים (CCD). מסך (ג) מחשב במהלך ניתוח. (ד) יון גמגום. דגימה (ה) לSEM. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (ו).
סרט 1.טען / 52991 "target =" / Figure_2.mov _ blank "> סרט של המבט מלמעלה של CPECs והריסים מגור עכבר P2 במיקרוסקופ וידאו במהירות גבוהה. בגלל המשטח לא סדיר של רקמת מקלעת דמית העין, תמונת מצב זו מכילה . שני האזור בתיבה מורחב בפוקוס ומטוסים מחוץ לפוקוס ולראות בסרט 2 בר סולם:. 2 מיקרומטר.
סרט 2. סרט של התצוגה המורחבת של דגימת הרקמה בסרט 1. הכאת cilia הראה תנועות סיבוביות או או לגבות ו-ושוב. בר סולם: 1 מיקרומטר.
איור 2: צילה כינונה מחדש של המסלול של cilia CPEC מהזמן לשגות התמונות בסרט 2 (א) עם תנועה לאחור ו-ושוב (למעלה) ותנועה סיבובית (תחתונה).. דסק"ש תמונות מנתוני הסרט מוצגות ב 50 אלפיות שני מרווחים (1-8, סרגל קנה מידה: 1 מיקרומטר). העמדה של קצה ריסי היעד הוא הצביע על ידי ראש חץ. (ב) המסלולים (הקו שבור) ועמדות של טיפים הריסים (עיגולים צבעוניים) שמוצגים בתמונות הם כיסו.
איור 3:. שני מצבים של תנועת קצה ריסי CPEC מחדש מנתוני סרט תנועות נציג קצה הריסים, תנועה לאחור ו-ושוב () ותנועה סיבובית (ב '), על מחזורים מרובים מוצגים כמסלולים (למעלה, ברים בקנה מידה: 0.5 מיקרומטר). קורסי זמן של X- וy-קואורדינטות של מיקום הקצה הם זממו, בהתאמה (באמצע). כדי להדגים שלב משמרת בין שתי הקואורדינטות, X- וy-קואורדינטות היו מנורמל [-1,1] ומעולף (למטה, קווים אדומים וכחולים, בהתאמה).
igure 6 "src =" / קבצים / ftp_upload / 52991 / 52991fig6.jpg "/>
איור 4: איורי סכמטי המתארים את הניתוח של מסלולי קצה ריסי הגדרות (א) לθ זווית המכות לגב ו-ושוב (פנל משמאל) ומסלולים סיבוביים (פנל מימין).. פרמטרים בנוסחא המתארים את האליפסה המצויד, a, b, x 0, ו- y 0, מוצגים בפנל הימני. (ב) תרשים זרימה של הניתוח ההולם של המסלולים להגדיר θ זווית המכות וAR. תוצאות בפועל של ההולם של מסלולי הנציג מוצגות בלוחות מהימין.
איור 5: תמונת SEM של cilia. micrographs SEM נציג CPECs בE13, E15, P2, וP14. במהלך הזמן, CPECs גדל בגודל, ופיתח microviLLI וcilia על משטח הפסגה. ציצה של cilia בE13 היא עדיין לרכוש תנועתיות. בP2, כאשר היחס של ריסים עם תנועתיות הגיע לנקודה הגבוהה ביותר, רב cilia הכפוף הם נצפו. בP14, cilia לאבד תנועתיות. בר סולם: 5 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרספקטיבות של שיטה זו
למרות שהטכניקה המתוארת כאן אינה מספקת ניתוח מפורט יותר של ריסים מאשר שיטות שפורסמו בעבר, את המשמעות של טכניקה זו מתגוררת בפשטות של המערכת ועלות האפקטיביות, אשר ניתן ליישם בקלות להקרנה בכל סוג של תנועתיות ריסי vivo לשעבר. בפרט, TI Workbench מספק ממשק פשוט וידידותי למשתמש המאפשר לחוקרים לבחון ולנתח תנועתיות הריסים בקלות רבה יותר. שיטות מעקב יעילות אוטומטיות לא פותחו עבור אובייקטי ניגודיות נמוכים כגון cilia בלא כתם במשופר וידאו ניגוד-דסק"ש. למרות שהשיטה כדי לעקוב אחר תנועת הריסים היא ידנית בטכניקה זו, הסכום של מאמץ בניתוח מעקב אחר תנועת הריסים בצורה אופטימלית הוא מופחת בהשוואה לשימוש בחבילות תוכנה ייעודית לניתוח תמונה.
נתיחת מדגם
כדי להכין דוארדגימות vivo CPEC x, מניפולציות מהירות ועדינות נחוצות כדי לשמר את הכדאיות של הרקמות, אשר מבטיחה את תנועתיות של cilia vivo לשעבר. בגלל זיהום על ידי אריתרוציטים מטשטש את השדה של תצפית, שטיפה עדינה אך מורכבת של הרקמה גזור עם פוספט שנאגרו מלוח מומלצת מאוד. כדי להימנע מדימום, טיפול חייב להיות מופעל כדי למנוע את קריעת העורק דמית העין האחורית שיכול להיות מזוהה כמבנה דמוי חוט בולט אדמדם דבקו lamina affixa של מקלעת קולואיד.
מיקרוסקופ
מיקרוסקופ ההפוך מצויד באופטיקה דסק"ש ומקור אור העברת הספק גבוה הוא חיוני לשיטה זו. בגלל מנורות כספית הן בדרך כלל אינן מסוגלות לעתים קרובות מיתוג לסירוגין, תריס מול דיור המנורה הוא הכרחי. כך או תריס ידני או חשמלי יכול לשמש למטרה זו. כדי להגן על דגימות וfr עיניו של הצופהUV אום ואור IR, מסננים אופטיים נדרשים כדי לאפשר רק אור הנראה (לעבור להקה 400-700 או שילוב של UV ומסננים לחתוך IR). מסנני ND גם צורך לשנות את כוח האור שמשתנה בהתאם למצב: ניטור על ידי העין, תוך התמקדות במצלמת וידאו, והקלטת הזמן לשגות במהירות גבוהה. עדשה אובייקטיבית עם צמצם מספרי גבוה היא הכרחית לרזולוציה גבוהה. יש מרחק מסוים בין החלק העליון של coverslip והנקודה בגלל המורפולוגיה והעובי של רקמת מוקדי. לכן, עדשת טבילה במים ולא עדשת טבילת שמן עדיפה לאיכות תמונה טובה יותר. בידוד רעידות הוא גם הכרחי כדי להניב ערימות תמונה יציבה. שולחנות משליך סוג מיזוג שימושיים למטרה זו, אבל ריפוד פשוט של מיקרוסקופ על ידי הכנסת כדורי טניס מתחת לבסיס מיקרוסקופ עם שולחן יציב עשויים גם לעבוד.
מצלמת וידאו
מצלמת CCD מסוגל בלאהרח '200 מסגרות / שנייה יש צורך לעקוב אחר התנועה של cilia. בעשור האחרון, מצלמות CCD עם שיעורי מסגרת מהר יותר (25-30 הרץ) שיעור וידאו הסטנדרטי הפכו זמינות בהרבה עלויות נמוכות יותר. מודלים מצלמה מסוגלים קצרות לחשוף פעמים מאשר מרווח המסגרת שימושיים להפחתת טשטוש עקב התנועה של cilia מבלי להגדיל את כמות הנתונים. זמן חשיפה של 0.1 מילים-שנייה ומרווח 5 אלפיות שני מסגרת (200 הרץ) הם תנאים מינימליים כדי להשיג תמונות הריסים של CPECs עם איכות מספקת.
תוכנה
הניתוח כדי לעקוב אחר התנועה של כל cilium זמן רב, במיוחד כאשר חבילות תוכנה ייעודית לניתוח תמונה משמשות למעקב אחר כל קצה הריסים. הפחתת מספר השלבים של משימות חוזרות ונשנות, כגון לחיצת עכבר על עמדת קצה הריסים על המסך, בחירת תפריט כדי להקליט את העמדה לחצה, ולחיצה על כפתור כדי לעבור למסגרת תמונה הבאה, תוצאות במחדש משמעותיduction של זמן ומאמץ. במחקר זה, שגרה מיוחדת התווספה לתוכנת TI Workbench מחוייט. במצב מעקב הריסים של תוכנת TI Workbench, המשתמש שומר looping פעולת שני שלבים פשוטים הבאה: הזזת סמן העכבר לקצה הריסים ולחיצה מקש חץ במקלדת כדי לקדם את המסגרת, אשר אינו דורשת ההעברה מצביע עכבר או עיניים של המשתמש להעביר (לתפריטים וכפתורים על מסך המחשב) מטיפי הריסים על מסך המחשב. התוכנה עוקבת אחר עמדות קצה הריסים, מציגה את המסלול המוקלט לסייע למשתמש, ויוצרת טבלה של מידע תנועת הריסים לניתוח נוסף. רוב התוכנות ייעודיות לניתוח תמונה מאפשרת פקודות מאקרו תכנות לעיבוד אצווה של משימות חוזרות ונשנות מסוג זה. תכנות מותאם אישית כגון להפחית צעדים חזרו מומלץ מאוד.
ניתוח של מסלולים
הפקת trajectories בוצע באמצעות תוכנת TI Workbench המותאמת אישית, כפי שתואר לעיל. ניתוח פשוט יחסית ועיבוד תמונה גם בוצעו באמצעות אותה התוכנה. עבור ניתוחים הולמים, מסלולו של כל קצה הריסים הועבר לתוכנת Pro איגור. גם תוכנת ניתוח מתקדם אחר כגון MATLAB יכולה לשמש למטרה זו.
במחקר הנוכחי, בגלל הקשיים בסיווג המסלולים בגב ו-ושוב או מסלולים סיבוביים, המסלולים סווגו לפי העין בצורה עיוורת, אשר אושרו על ידי משקיף אחר, וכתוצאה מכך הסיווג עקבי. עם זאת, יותר מבחינה מתמטית קפדני אמצעים כדי לסווג את המסלולים ללא כל שרירות אפשרית יהיו עדיפים. אליפסה הולמת של המסלולים שנראה אידיאלי, אשר יכול לכמת את מידת סְגַלגַלוּת כיחס ההיבט של האליפסה המצויד () בשני-ושוב חזרה ותנועות סיבוביות. עם זאת, ניסיון להשתמש בהפצה של היחס הגובה-הרוחב להגדיר ערך סף לסיווג לא היה יעיל. הראוי לעתים קרובות נכשל למסלולי גב ו-ושוב, לעתים קרובות נכשלו הפרמטרים להתכנס, וראויים היה התכנסו חמקמק ככל הנראה. לכן, ראוי אליפסה לא אימץ לסווג מסלולים באופן אוטומטי או לכמת את סְגַלגַלוּת של כל מסלול. הראוי בוצע כדי לחלץ את כיוון הכאת הטיפים rotationally מרגשים כציר המרכזי של האליפסה המצויד.
במחקר הנוכחי, AR הוצע לכמת את המידה שחורג ממסלול ליניארי אידיאלי תנועת גב ו-ושוב. הפרמטר הוא היחס בין הרוחב של הפצה בניצב לכיוון מכות שללאורך הכיוון. הערך צריך להיות אפס כאשר המסלול הוא קו ישר, ואחד, כאשר המסלול הוא מעגל, שמזכיר את יחס הממדים של האליפסה שהוזכר לעיל.
בפועל, קבלת ערך AR יכולה להיות קלה יחסית על ידי החלפה של המסלול, כך שכיוון המכות הופך במקביל לx -axis (איור 4). כימות זה מוביל לערכים משמעותי ברורים לשני מצבים של תנועה, המצביע על פוטנציאל השימוש של הפרמטר לא רק לכמת את המאפיינים של כל מסלול, אלא גם לסווג יותר בקפדנות המסלולים. עם זאת, יש לציין שכיוון המכות עצמו הוא כבר התוצאה של תהליכים הולמים נפרדים לשני מצבים בשיטה הנוכחית.
שיפור נוסף של הניתוח, כגון אלגוריתם הולם מתקדם יותר, עשוי לפתור את הבעיות של שרירות אפשרית.
היבט לגבי סְגַלגַלוּת של המסלול הוא שהמכות של כל cilium CPEC לא ניתן מתרחשות במטוס שניצב בקפדנות x - y
הכנה לSEM
במהלך ההכנה לתצפית SEM, יש כמה נקודות חשובות שתבטחנה את הרכישה של תמונות באיכות גבוהות. ראשון, שלאחר קיבוע על ידי tetroxide אוסמיום חייב להתבצע בזהירות, כולל מראש כביסה עם תמיסת סוכרוז 10%. ללא קיבעון נכון על ידי הליך osmification, השלבים הבאים לא יכולים לשמור או לשחזר את המצב של הדגימות, שמוביל לאיכות נמוכה יותר של ההכנה. בגלל fixatives אלדהיד מצמצמים סוכנים, כל שנותרו אלדהידים בתוך הדגימה מעכבים את הפעילות של tetroxide אוסמיום, מגיב חמצון חזק. כדי להבטיח חיסול אלדהידים מיותרים בדגימות, כביסה זהירה עם פתרון סוכרוז היא הכרחית. במקרים של פו הכי מוצלחST-קיבעון, הצבע של הדגימה אינו משתנה מחום עד שחור. שנית, היקף tetroxide אוסמיום חייב להיות לפחות פי 50 יותר גדולים מזה של המדגם. אחרת, לא ניתן לצפות קיבעון מספיק. שלישית, חשוב להימנע מייבוש של הדגימות מלאים, במיוחד במהלך תהליך ההתייבשות שמעסיק אתנול טהור ביותר ותצטטו isoamyl. ייבוש של הדגימה הורס את מבני משטח הדקים כגון cilia, וכתוצאה מכך תמונות עניות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים. מאמר זה נועד בדיווח מתודולוגיה מפורטת להתבונן תנועתיות של cilia ברקמות מקלעת דמית העין מבודדת. חידושים מדעיים דווחו במחקרים קודמים 1,8.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Required reagents | |||
| for live cell imaging | |||
| ethanol | Wako Chemicals | 057-00456 | |
| Leibovitz L-15 medium | Life Technologies | 11415-064 | |
| for SEM preparation | |||
| ethanol | Wako Chemicals | 057-00456 | |
| Hank's balanced salt solution | Life Technologies | 14170112 | |
| paraformaldehyde | Merck | 1040051000 | |
| glutaraldehyde | Nacalai tesque | 17003-05 | |
| isoamyl acetate | Nacalai tesque | 02710-95 | |
| Molecular Sieves 4A 1/8 | Wako Chemicals | 130-08655 | for preparation of anhydrous ethanol |
| phosphate buffer saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| phosphate buffer, 0.1 M | To make 100 ml, mix 19.0 ml of 0.1 M NaH2PO4 and 81.0 ml of 0.1 M Na2HPO4 | ||
| monosodium phosphate (dihydrate) | Nacalai tesque | 31718-15 | |
| disodium phosphate (anhydrous) | Nacalai tesque | 31801-05 | |
| suclose | Nacalai tesque | 30406-25 | |
| osmium tetroxide | Nisshin EM | 300 | |
| dry ice | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools and materials for dissection | |||
| for both live imaging and SEM preparation | |||
| stereo microscope | Olympus | SZX7 | |
| flat paper towel | |||
| Φ10 cm plastic dish | |||
| 100 ml beaker | |||
| straight operating scissors | Sansyo | S-2B | |
| watchmaker forceps | Dumont | No.DU-3 or -4, INOX | |
| for live cell imaging | |||
| glass bottom dish | Matsunami Glass | D110300 | |
| for SEM preparation | |||
| alminum foil | |||
| 5 ml glass vial with a polyethylene cap | Nichiden Rika-Glass | PS-5A | |
| transfer pipette | Samco Scientific | SM251-1S | for specimen tranfer |
| toothpick | for specimen transfer | ||
| ion sputter with gold-palladium | Hitachi | E-1030 | |
| critical point dryer | Hitachi | HCP-2 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopic equipment and materials | |||
| for live cell imaging | |||
| inverted microscope | Olympus | IX81 | |
| 100 W mercury lump housing and power supply | Olympus | U-ULH and BH2-RFL-T3 | |
| 100 W mercury lamp | Ushio | USH103D | |
| DIC condenser, n.a. 0.55 | Olympus | IX-LWUCD | |
| electrrical shutter | Vincent Associates | VS35S22M1R3-24 and VMM-D1 | manual shutter can be used. |
| band-pass filter (400-700 nm, Φ45 mm) | Koshin Kagaku | C10-110621-1 | |
| ND filter (Φ45 mm) | Olympus | 45ND6, 45ND25 | combination of 25% and 6% ND filters are used |
| objective lens (water immersion) with DIC element | Olympus | UApo 40XW/340, n.a., 1.15 with IX-DPAO40 | |
| high-speed video camera | Allied Vision Technologies | GE680 | ≥200 Hz frame rate and 1 msec expose time |
| image acquisition / analysis software | in-hous software | TI Workbench | capable of acquisition at high frame rates. |
| PC for camera control / analysis | Apple | Mac Pro | |
| vibration isolation table | Meiritsu Seiki | AD0806 | |
| weight for tissue | Warner Instruments | slice anchor kits | It can be made with nylon mesh glued to a U-shape squashed Φ0.5 mm platinum wire. |
| cover glass (alternative weight for tissue) | Matsunami | made-to-order | A cover glass can be used as a tissue weight. |
| for SEM | |||
| inverted microscope | Olympus | IX81 | |
| scanning electron microscope | JEOL | JSM-6510 | |
References
- Nonami, Y., Narita, K., Nakamura, H., Inoue, T., Takeda, S. Developmental changes in ciliary motility on choroid plexus epithelial cells during the perinatal period. Cytoskeleton. 70 (12), 797-803 (2013).
- Bisgrove, B. W., Yost, H. J. The roles of cilia in developmental disorders and disease. Development. 133 (21), 4131-4143 (2006).
- Fliegauf, M., Benzing, T., Omran, H. When cilia go bad: cilia defects and ciliopathies. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (11), 880-893 (2007).
- Oh, E. C., Katsanis, N. Cilia in vertebrate development and disease. Development. 139 (3), 443-448 (2012).
- Shah, A. S., Ben-Shahar, Y., Moninger, T. O., Kline, J. N., Welsh, M. J. Motile cilia of human airway epithelia are chemosensory. Science(New York, N.Y). 325 (5944), 1131-1134 (2009).
- Kiprilov, E. N., et al. Human embryonic stem cells in culture possess primary cilia with hedgehog signaling machinery). The Journal of Cell Biology. 180 (5), 897-904 (2008).
- Hirokawa, N., Tanaka, Y., Okada, Y., Takeda, S. Nodal flow and the generation of left-right asymmetry. Cell. 125 (1), 33-45 (2006).
- Narita, K., Kozuka-Hata, H., et al. Proteomic analysis of multiple primary cilia reveals a novel mode of ciliary development in mammals. Biology Open. 1 (8), 815-825 (2012).
- Takeda, S., Narita, K. Structure and function of vertebrate cilia, towards a new taxonomy. Differentiation; Research in Biological Diversity. 83 (2), S4-S11 (2012).
- Ikegami, K., Sato, S., Nakamura, K., Ostrowski, L. E., Setou, M. Tubulin polyglutamylation is essential for airway ciliary function through the regulation of beating asymmetry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (23), 10490-10495 (2010).
- Foster, K. W.
- Lechtreck, K. -F., Sanderson, M. J., Witman, G. B. High-speed digital imaging of ependymal cilia in the murine brain. Methods in Cell Biology. 91, 255-264 (2009).
- Okada, Y., Hirokawa, N. Observation of nodal cilia movement and measurement of nodal flow. Methods in Cell Biology. 91, 265-285 (2009).
- Chilvers, M. A., Rutman, A., O’Callaghan, C. Ciliary beat pattern is associated with specific ultrastructural defects in primary ciliary dyskinesia. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 112 (3), 518-524 (2003).
- Takeda, S., et al. Left-right asymmetry and kinesin superfamily protein KIF3A: new insights in determination of laterality and mesoderm induction by kif3A-/- mice analysis. The Journal of Cell Biology. 145 (4), 825-836 (1999).
- Karnovsky, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolarity for use in electron microscopy. The Journal of Cell Biology. 27, 137-138A (1965).
