Protocol
Los protocolos y uso de animales experimentales fueron aprobados por los comités de cuidado animal y el uso institucional de la Universidad de Yamanashi y la Universidad de Waseda. Cuidado de los animales se realizó de acuerdo con las directrices institucionales.
1. Preparación CPEC
- Preparar los siguientes aparatos y materiales: un microscopio estéreo, preferiblemente capaz de transmitir la iluminación desde la parte inferior; un par de pinzas de relojero (Dumont # 3 o # 4), llama-esterilizado, tijeras de funcionamiento rectas, llama-esterilizado; dos platos de 10 cm de plástico estériles que contienen 20 ml de hielo frío medio Leibovitz L-15; Platos con fondo de cristal de 35 mm que contienen 2 ml RT Leibovitz medio L-15; un vaso de precipitados de 100 ml que contiene 70% de etanol; cachorros neonatales ratón.
- Brevemente sumerja un ratón neonatal en etanol al 70% y la eutanasia de forma rápida por decapitación con las tijeras que operan.
- Coloque la cabeza inmediatamente helada Leibovitz L-15 en el medio estéril 10 cm dish.
- Retire la piel de los bóveda craneal utilizando el par de pinzas relojero, cortar el cráneo para exponer el cerebro, y luego cortar los nervios craneales para aislar todo el cerebro.
- Transferir el cerebro a un nuevo plato que contiene helado Leibovitz L-15 medio y observar bajo el microscopio estereoscópico, asegurándose de que el cerebro está completamente inmerso en el medio.
- Establezca la cara dorsal del cerebro hacia arriba, y orientar el cerebro para que los bulbos olfatorios residen en la posición tres (para personas diestras). Mantenga el cerebro suavemente con las pinzas en la mano izquierda.
- Usando las pinzas de disección finas (Dumont # 3 o # 4) en la mano derecha, cortar el cuerpo calloso y debajo del parénquima que conecta los hemisferios cerebrales, a lo largo de la fisura longitudinal del cerebro.
- Presione suavemente los hemisferios cerebrales de distancia a los lados laterales y exponer la fisura cerebral transversal.
- Separar los hemisferios pellizcando a cabo ªe parénquima entre el hemisferio y el tálamo.
- Retire con cuidado el plexo coroideo del ventrículo lateral que se adjuntan a la parte lateral del hipocampo por el Affixa lámina.
- Transferir el plexo coroideo aisladas para el plato de fondo de vidrio de 35 mm que contiene frescos medio Leibovitz L-15, y las cubrirás de un peso (Lista de Materiales) suavemente para mantener el tejido en su lugar.
2. imágenes en vivo de CPEC cilios
- Confirmar ultravioleta adecuada (UV) y el filtro (s) deducido (IR) de corte para bloquear la luz corta que 400 nm y más de 700 nm, y que de densidad neutra (ND) Filtros (25% y 6%) se inserta en la trayectoria de la luz del microscopio invertido.
- Ajuste el enfoque de la lente objetivo más o menos a ojo, y luego ajustar el condensador de modo que el centro y el enfoque para ajustarse a la iluminación Köhler. Insertar un contraste de interferencia diferencial apropiado (DIC) prisma, un elemento de DIC, así como elementos del analizador y el polarizador en el liruta luchar para ajustarse a la óptica DIC.
- Ajustar el contraste de la vista por la posición del prisma DIC modo que la estructura de la superficie del tejido es más reconocible. Si todos los cilios de las células diana son móviles, una visión clara de cilios móviles no se puede obtener por el ojo a causa de su movimiento.
- Cambie la trayectoria de la luz a la cámara de video, y quitar los filtros ND para aumentar la potencia de la luz.
- Utilice la cámara en el modo de enfoque para ajustar el campo de visión y el enfoque. Durante el enfoque, en el que las imágenes de vídeo se visualizan en tiempo real en el monitor, una visión clara de cilios móviles no está disponible.
- Utilice la cámara a 200 Hz con un tiempo de exposición de 0,1 ms para el período (segundos a minutos) deseado. Después de la adquisición de la pila de imágenes, cuadros individuales se mostrarán las estructuras ciliares claras. Si bordes ciliares están borrosas, aumentar la velocidad de fotogramas o utilizar un tiempo de exposición corto.
- Registrar el movimiento de los cilios CPEC dentro 25-60 minutos después de la eutanasia en LeibovitzL-15 medio.
3. Análisis de movimiento ciliar
- Rastrear manualmente superando patrones de cada cilio en el monitor de la computadora. Marcar las posiciones de punta ciliar en cada cuadro con el puntero del ratón, que se ensamblan para obtener información trayectoria de cada cilio. Cualquiera de analizar la información de trayectoria utilizando el mismo software o exportar a otras aplicaciones más generales para su posterior análisis. La eficiencia de este paso de análisis se describe en la discusión.
- Clasificar las trayectorias en dos modos de movimiento, de ida y vuelta o de rotación, por ojo.
- Calcular la frecuencia de latido ciliar (CBF) utilizando la siguiente fórmula: [CBF = (número de fotogramas por segundo) / (número promedio de marcos para un solo latido)] 14, que se puede obtener a partir de un diagrama de movimiento punta ciliar (Figura 3 ). Repetir este cálculo para múltiples ciclos de batido ciliar, porque otra cilios en la misma célula puede interferir con el movimiento de cada cilium, resultando en irregularidad.
- Para analizar la uniformidad angular de la ciliar superando ejes dentro de una sola célula, definir el ángulo θ golpes para cada trayectoria (Figura 4). Para trayectorias de nuevo adelante y hacia atrás, ajuste la posición de la punta cilios a una línea recta, y definir θ como el ángulo de la línea hace con el eje x. Para las trayectorias de rotación, encajar las posiciones a una elipse, y definir θ como el ángulo del eje mayor de la elipse hace con eje x. Los detalles de la instalación se describen en la sección de Resultados Representante.
- Para obtener una descripción cuantitativa de cada trayectoria, calcular generalizada relación de aspecto AR. Brevemente, rotar la trayectoria por - θ y definir AR como la relación entre las anchuras de la distribución a lo largo de x - y -axes Y (Figura 4B). Los detalles se muestran en la sección Resultados Representante, y la interpretación, El significado y la limitación de los parámetros se describen en la Discusión.
4. Preparación de muestras para SEM
Nota: SEM es un método importante para evaluar el estado de los cilios en CPECs de una manera integral. Para preparar muestras para SEM, un procedimiento estándar se informó anteriormente 15 se emplea con ligeras modificaciones.
- Antes de la disección de los tejidos del cerebro, preparar el fijador en un vial de vidrio de 5 ml con un tapón de polietileno. El fijador se compone de 2% de paraformaldehído, 2.5% de glutaraldehído (solución media de Karnovsky 16) en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,4.
- Diseccionar el tejido del cerebro como se describe en el paso 1.
- Brevemente enjuagar el tejido aislado con solución salina equilibrada de Hank (HBSS) en un nuevo plato y luego fijar el tejido en el fijador en el vial de vidrio durante 1 hora a temperatura ambiente. Utilice pipetas de transferencia desechables y manipular las muestras gently. Después de enjuagar en HBSS, el tejido se vuelve pegajosa.
- Para transferir los especímenes en la solución de fijación, expulsar lentamente una pequeña cantidad de solución que contiene el tejido de la pipeta de transferencia como una gotita y añadir a la fijador.
- Después de la fijación, deseche el fijador y lavar el tejido con tampón fosfato tres veces.
- Sumergir el tejido en una solución de sacarosa al 10% para lavar los aldehídos restantes. Para garantizar la eliminación completa de los aldehídos, sumergir las muestras en la solución durante 10 min y luego repetir dos veces con 10% de sacarosa fresco. Este paso es importante para lograr la adecuada post-fijación en los pasos posteriores.
- Sumergir el tejido en una solución de 1% de tetróxido de osmio en tampón fosfato durante 30 min y luego se coloca en hielo durante post-fijación. Juzgar el grado de osmification por el color de la muestra: cuando aldehídos se eliminan por completo, la muestra es de color negro.
- Lavar las muestras de tejidos después de la fijada extensamente con doble destiladad agua varias veces.
- Deshidratar las muestras por inmersión en concentraciones graduadas de etanol, por lo general 65%, 75%, 85%, 95%, 99%, y 100%, durante 10 min cada uno. Obtener etanol anhidro mediante la colocación de tamices moleculares en etanol 99,5% de una botella que acaba de adquirir. Repita deshidratación con etanol anhidro tres veces.
- Colocar las muestras deshidratadas en acetato de isoamilo, un reactivo de sustitución de secado de punto crítico, para 10 min. Repita este paso dos veces. Este reactivo se evapora rápidamente y la muestra puede convertirse en seco, lo que resulta en la destrucción por la tensión superficial. Por lo tanto, no secar la muestra por completo.
- Después de que el intercambio final de acetato de isoamilo, eliminar la mayor parte del disolvente, inmediatamente envolver el vial de vidrio abierto con papel de aluminio, y colocar el vial en hielo seco. Usando una aguja o unas pinzas finas, hacer varios agujeros en la lámina que cubre la boca del vial, de modo que el dióxido de carbono líquido fluye fácilmente en el vial en el secador de punto crítico. Continúe con el siguiente pasolo más rápido posible.
- En este paso, minimizar el arrastre de acetato de isoamilo en la cámara de la secadora, pero no dejes que la muestra se seque completamente antes de secado de punto crítico. Además, no deje la muestra en hielo seco durante un tiempo innecesariamente largo para evitar la formación de escarcha en el vial.
- La transferencia de los viales de vidrio envueltas en papel aluminio que contienen las muestras de tejido en el secador de punto crítico que asegura la estructura de la superficie del tejido permanece intacta, mientras que la eliminación de agua contenida en el tejido. La información detallada sobre el funcionamiento del secador de punto crítico puede obtenerse a partir de las instrucciones del fabricante.
- Maneje las muestras cuidadosamente con un palillo de dientes para minimizar el daño mecánico. Las muestras de tejido secas resultantes son frágiles. Montar las muestras en trozos de metal y escudo de oro-paladio usando una pulverización catódica de iones.
5. Observación por SEM
- Observe por SEM y grabar imágenes con una cámara digitalequipado para microscopio electrónico de barrido.
- Transferir datos de imagen digital a un PC para su análisis.
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Representative Results
Una visión general del flujo de trabajo se muestra en la Figura 1, incluyendo imágenes de los dispositivos.
Observaciones de movimiento vivo de CPECs
Película 1 muestra una película de CPECs aisladas a partir de un ratón perinatal, y la película 2 muestra una vista ampliada de las imágenes en la película 1. Debe tenerse en cuenta que las puntas ciliares individuales son menos claros en imágenes fijas en comparación con aquellos en las películas. La Figura 2 muestra seguimiento del movimiento de dos cilios con diferentes modos de movimiento, hacia atrás y hacia adelante y movimientos de rotación, a partir de los datos mostrados en Películas 1 y 2. La Figura 3 muestra un simple análisis de las trayectorias de los cilios, en el que la diferencia de fase en las dos coordenadas es obvio en el movimiento de rotación.
Análisis de CPEC trayectorias de punta ciliar
De métodos de cola para analizar cuantitativamente cada trayectoria se muestran en la Figura 4 con ilustraciones esquemáticas de las definiciones del ángulo θ latidos (A) y un diagrama de flujo del análisis con resultados representativos (B).
Para definir el ángulo θ paliza de trayectorias hacia atrás y adelante, adaptarse a las posiciones de la punta ciliar durante varios ciclos a una línea recta y = ax + b, y definir la dirección paliza como que a lo largo de la línea ajustada. Definir el ángulo de golpeo aquí como θ = Arco bronceado a. Debido a que a menudo línea de montaje falla para extraer la dirección en los casos de movimiento de rotación, encajar las trayectorias de rotación a una elipse, y definir la dirección que a lo largo del eje largo de la elipse equipada. Más precisamente, las posiciones de punta (x, y) durante múltiples ciclos de batido se ajustan a la función a continuación.
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dónde 
El accesorio elipse implica cinco parámetros de ajuste: x 0, y 0, a, b, y θ. Las x - y coordenadas -spatial Y del centro de la elipse son x 0 ey 0, respectivamente. Los radios mayor y menor de la elipse son A y B, respectivamente. Ángulo θ es el ángulo que el eje mayor hace con el eje x, o el ángulo de latir. Una representación esquemática de estos parámetros se muestra en el panel derecho de la Figura 4A. El montaje se lleva a cabo utilizando el software Igor Pro mediante la definición de la función explícita descrito anteriormente. Entonces, un histograma de vencer θ ángulo para todos los cilios observard en la misma celda se representa como un histograma circular (Figura 2 en Narita et al. 8). La frecuencia se normaliza con el número de consejos ciliares analizados. Cabe señalar que cada cilio se interpreta para tener dos θ valores en el histograma circular, por ejemplo, π / 4 y 3π / 4, que conduce a distribución simétrica de la dirección.
Para definir generalizada relación de aspecto AR, las posiciones de la punta ciliar durante múltiples ciclos se hacen girar por - θ (Figura 4B). De acuerdo con la rotación, tanto hacia atrás y hacia adelante y las trayectorias de rotación convertido distribuyen aproximadamente paralela al eje x, en la que las anchuras de distribución A y B, a lo largo de los ejes x e y ejes, respectivamente, se definen como medio de la diferencia entre el mínimo y el máximo. Por lo tanto, estos parámetros son más relevantes para los radios mayor y menor de la elipse, a y b. AR continuación, se define como la relación entre A y B por AR = B / A.
Observaciones de epitelio del plexo coroideo por SEM
SEM permite la observación de la estructura de superficie fina de especímenes. La presencia de los cilios en CPECs se confirma en todo el curso de tiempo de desarrollo. La aparición de múltiples cilios en CPECs se observa por día embrionario (E) 13, poco después del desarrollo del plexo coroideo comienza en los ventrículos laterales alrededor de E11. En esta etapa, las células son pequeñas con un aspecto inmaduro variables, y las puntas ciliares están apuntando hacia varias direcciones. En E15, un mechón de múltiples cilios se establece en la parte superior de la superficie apical, que se encontraba fuera de las microvellosidades de los alrededores. En el día postnatal (P) 2, muchos cilios se fijan en una posición doblada, lo que refleja la motilidad ciliar observado por imágenes en vivo. A P14, la mayoría de las células poseen múltiples cilios que son no móviles, así como microvellosidades w ITH una textura más fina en comparación con las etapas anteriores. La Figura 5 muestra imágenes de SEM de CPECs con cilios en estas etapas. Basado en las películas que se muestran en la Figura 1 y de la película 1, es obvio que cilios móviles se reconocen fácilmente por imágenes en vivo. Sin embargo, es difícil distinguir los cilios no móvil por microscopía DIC. En consecuencia, SEM es indispensable para entender los estados ciliares generales.
Figura 1:. Visión general del flujo de trabajo (a) microscopio estéreo. (B) microscopio invertido equipado con un dispositivo de carga acoplada (CCD) de la cámara. (C) La pantalla del ordenador durante el análisis. (D) de pulverización de iones. (E) de muestras para SEM. Microscopio electrónico (f) Scanning.
Película 1.pload / 52991 / Figure_2.mov "target =" _ blank "> Película de la vista superior de CPECs y los cilios de un cachorro P2 ratón en microscopía de vídeo de alta velocidad. Debido a la superficie irregular del tejido plexo coroideo, esta instantánea contiene . tanto de enfoque y fuera de foco aviones El área en la caja se expande y se muestra en la película 2 Barra de escala:. 2 micras.
Película 2. Película de la vista ampliada de la muestra de tejido en Movie 1. Vencer a los cilios mostró movimientos de rotación o bien copia y adelante. Barra de escala: 1 m.
Figura 2:. Reconstitución de la trayectoria de CPEC cilios de las imágenes con lapso de tiempo en la película 2 (A), Cilia con el movimiento hacia atrás y hacia adelante (arriba) y el movimiento de rotación (abajo). DIC imágenes de los datos de la película se presentan en 50 mseg intervalos (1-8, barra de escala: 1 m). La posición de la punta ciliar objetivo se indica mediante una punta de flecha. (B) Las trayectorias (línea punteada) y las posiciones de consejos ciliares (círculos de colores) que se muestran en las imágenes se superponen.
Figura 3:. Dos modos de movimiento de la punta ciliar CPEC reconstituida a partir de datos de la película movimientos punta ciliar representativos, el movimiento hacia atrás y hacia adelante (A) y el movimiento de rotación (B), a lo largo de múltiples ciclos se presentan como trayectorias (arriba, barras de escala: 0.5 m). Cursos de tiempo de x e y coordenadas de la posición de la punta se representan, respectivamente (en el centro). Para demostrar un cambio de fase entre las dos coordenadas, x e y coordenadas se normalizaron a [-1,1] y superpuestos (parte inferior, las líneas rojas y azules, respectivamente).
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Figura 4: ilustraciones esquemáticas que describen el análisis de las trayectorias de punta ciliares (A) Definiciones de la θ ángulo de golpeo de ida y vuelta (panel izquierdo) y (panel derecho) trayectorias de rotación.. Los parámetros en la fórmula que describe la elipse equipada, a, b, x 0, ey 0, se muestran en el panel derecho. (B) Diagrama de flujo del análisis apropiado de las trayectorias para definir el ángulo θ paliza y AR. Los resultados reales de la instalación de las trayectorias representativas se presentan en los paneles de la derecha.
Figura 5: Imagen SEM de los cilios. Representativos micrografías SEM de CPECs en E13, E15, P2, y P14. Durante el curso de tiempo, CPECs aumentaron de tamaño, y desarrollaron microvilli y cilios en la superficie apical. Un mechón de cilios en E13 es todavía para adquirir la motilidad. En P2, cuando la relación de los cilios con la motilidad alcanzó el punto más alto, se observan muchos cilios dobladas. En P14, cilios pierden motilidad. Barra de escala: 5 micras.
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Discussion
Perspectivas de este método
Aunque la técnica descrita aquí no proporciona un análisis más detallado de los cilios que los métodos publicados anteriormente, la importancia de esta técnica reside en la simplicidad del sistema y la eficacia de costes, que se puede aplicar fácilmente a cualquier tipo de detección de la motilidad ciliar ex vivo. En particular, TI Workbench proporciona una interfaz simple y fácil de usar que permite a los investigadores observar y analizar la motilidad ciliar más fácilmente. Métodos de seguimiento automatizados eficaces no se han desarrollado para los objetos de bajo contraste, tales como los cilios sin mancha en el video mejorado contraste-DIC. Aunque el método para seguir el movimiento ciliar es manual en esta técnica, la cantidad de esfuerzo en el análisis de seguimiento de movimiento ciliar de manera óptima se reduce en comparación con el uso de paquetes de software generales propósito para el análisis de imagen.
La disección de la muestra
Para preparar ex muestras vivo CPEC, manipulaciones rápidas y suaves son necesarios para preservar la viabilidad de los tejidos, lo que asegura la motilidad de los cilios ex vivo. Debido a la contaminación por los eritrocitos difumina el campo de observación, se recomienda fuertemente suave pero intrincada de enjuague del tejido diseccionado con tampón fosfato salino. Para evitar el sangrado, se debe tener cuidado para evitar que se rompa la arteria coroidea posterior que puede ser identificado como una estructura de hilo de color rojizo prominente adherido a la lámina Affixa del plexo coloide.
Microscopio
Un microscopio invertido equipado con óptica DIC y una fuente de luz de transmisión de alta potencia es esencial para este método. Debido a que las lámparas de mercurio son generalmente incapaces de cambiar con frecuencia encendido y apagado, un obturador en frente de la carcasa de la lámpara es necesario. Cualquiera de un obturador manual o eléctrica se puede utilizar para este propósito. Para proteger las muestras y los ojos del observador frUV om y la luz IR, se requieren filtros de luz para permitir sólo la luz visible (400-700 paso de banda o una combinación de los rayos UV y filtros de corte IR). Filtros ND son también necesarias para modificar la potencia de la luz que varía en función de la situación: la supervisión por el ojo, centrándose con una cámara de vídeo y grabación de lapso de tiempo de alta velocidad. Una lente de objetivo con una apertura numérica alta es necesaria para una alta resolución. Hay una cierta distancia entre la parte superior del cubreobjetos y el punto focal debido a la morfología y el espesor del tejido. Por lo tanto, se prefiere una lente de inmersión en agua en lugar de una lente de inmersión en aceite para una mejor calidad de imagen. Aislamiento de la vibración también es necesario para producir pilas de imágenes estables. Mesas de aire de tipo dumper son útiles para este propósito, pero más simple de amortiguación del microscopio mediante la inserción de pelotas de tenis debajo de la base del microscopio con una mesa constante también puede funcionar.
Cámara de video
Una cámara CCD capaz de por lo least 200 cuadros / seg es necesario para seguir el movimiento de los cilios. Durante la última década, las cámaras CCD con velocidades de cuadro más rápido que la tasa de vídeo estándar (25-30 Hz) se han convertido en disponible a costos mucho más bajos. Modelos de cámara capaz de exponer tiempos más cortos que el intervalo de trama son útiles para reducir el empañar debido al movimiento de los cilios sin aumentar la cantidad de datos. Un tiempo de exposición de 0,1 ms y un intervalo de marco 5 ms (200 Hz) son las condiciones mínimas para la obtención de imágenes ciliares de CPECs con calidad suficiente.
Software
El análisis para rastrear el movimiento de cada cilio es mucho tiempo, especialmente cuando se utilizan paquetes de software de propósito general para análisis de imagen para realizar un seguimiento de cada punta ciliar. La reducción de los pasos de las tareas repetidas, como el clic del ratón en la posición de la punta ciliar en el monitor, la selección de un menú para registrar la posición se hace clic, y al hacer clic en un botón para pasar al siguiente cuadro de imagen, se traduce en una re significativaproducción de tiempo y esfuerzo. En este estudio, se añadió una rutina especial para el software TI Workbench medida. En el modo de seguimiento ciliar del software TI Workbench, el usuario sigue el siguiente bucle simple operación de dos pasos: mover el puntero del ratón a la punta ciliar y pulsando una tecla de flecha en el teclado para avanzar en la trama, que no requiere mover el puntero del ratón o de los ojos del usuario para cambiar (a los menús y botones en la pantalla del ordenador) de los consejos ciliares en la pantalla del ordenador. El software mantiene un registro de las posiciones de punta ciliares, muestra la trayectoria registrada para ayudar al usuario, y crea una tabla de información de movimiento ciliar para su posterior análisis. La mayoría del software de propósito general para el análisis de imágenes permite que las macros de programación para el procesamiento por lotes de este tipo de tareas repetidas. Se recomienda encarecidamente Dicha programación personalizada para reducir medidas repetidas.
Análisis de trayectorias
La extracción de la trajectoriES se llevó a cabo usando el software TI Workbench a medida, como se describe anteriormente. También se llevaron a cabo análisis relativamente simple y de procesamiento de imagen usando el mismo software. Para los análisis de ajuste, la trayectoria de cada punta ciliar fue transferido al software Igor Pro. Otro software de análisis avanzado, como MATLAB también se puede utilizar para este propósito.
En el estudio actual, debido a las dificultades en la categorización de las trayectorias hacia atrás y hacia adelante o trayectorias de rotación, las trayectorias se clasificaron por el ojo de una manera ciega, que se confirmó por otro observador, lo que resulta en la clasificación consistente. Sin embargo, más matemáticamente rigurosa medidas para categorizar las trayectorias sin ninguna posible arbitrariedad sería preferible. Elipse apropiado de las trayectorias parece ser ideal, lo que podría cuantificar el grado de elipticidad como la relación de aspecto de la elipse equipada () en tanto atrás y hacia adelante y los movimientos de rotación. Sin embargo, Un intento de utilizar la distribución de la relación de aspecto para definir un valor umbral para la clasificación fue ineficaz. El accesorio menudo fracasado por trayectorias hacia atrás y adelante, los parámetros falló con frecuencia a converger, y el accesorio convergido al parecer ilusorio. Por lo tanto, apropiado elipse no fue adoptada para clasificar automáticamente las trayectorias o cuantificar la elipticidad de cada trayectoria. El accesorio se llevó a cabo para extraer la dirección latidos de consejos de rotación en movimiento como el eje mayor de la elipse equipada.
En el estudio actual, AR fue propuesto para cuantificar la medida en que una trayectoria se desvía de un lineal ideales de ida y vuelta de movimiento. El parámetro es la relación de la anchura de la distribución perpendicular a la dirección de golpeo para que a lo largo de la dirección. El valor debe ser cero cuando la trayectoria es una línea recta, y uno cuando la trayectoria es un círculo, se asemeja a la relación de aspecto de la elipse se ha mencionado anteriormente.
En la práctica, obtener el valor AR puede ser relativamente fácil mediante la rotación de la trayectoria, de modo que la dirección de golpeo se convierte en paralelo a eje x (Figura 4B). Esta cuantificación lleva a valores considerablemente distintos para los dos modos de movimiento, lo que sugiere el uso potencial del parámetro no sólo para cuantificar las características de cada trayectoria, sino también para clasificar más rigurosamente las trayectorias. Sin embargo, cabe señalar que la propia dirección latiendo ya es el resultado de distintos procesos de montaje para los dos modos en el método actual.
La mejora adicional del análisis, tal como un algoritmo de ajuste más avanzado, podría resolver los problemas de la posible arbitrariedad.
Un aspecto en cuanto a la elipticidad de la trayectoria es que los latidos de cada cilio CPEC no puede estar ocurriendo en el plano estrictamente perpendicular a la x - y
Preparación para el SEM
Durante la preparación para la observación SEM, hay varios puntos importantes que garantizan la adquisición de imágenes de alta calidad. En primer lugar, después de la fijación por tetróxido de osmio debe realizarse cuidadosamente, incluyendo pre-lavado con una solución de sacarosa al 10%. Sin fijación adecuada por el procedimiento osmification, los pasos posteriores no pueden mantener o restablecer la condición de los especímenes, que conduce a una menor calidad de la preparación. Debido fijadores de aldehído son agentes reductores, cualquier aldehídos restantes dentro de la muestra inhiben la actividad de tetróxido de osmio, un reactivo oxidante fuerte. Para garantizar la eliminación de aldehídos superfluos en las muestras, lavado cuidadoso con la solución de sacarosa es imprescindible. En los casos de po subóptimast-fijación, el color de la muestra no cambia de marrón a negro. En segundo lugar, el volumen de tetróxido de osmio debe ser al menos 50 veces mayor que el de la muestra. De lo contrario, suficiente fijación no se puede esperar. En tercer lugar, es importante para evitar el secado completo de las muestras, en particular durante el proceso de deshidratación que emplea etanol altamente puro y acetato de isoamilo. El secado de la muestra destruye las estructuras finas superficiales como los cilios, lo que resulta en imágenes pobres.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia. Este documento tiene por objeto informar metodología detallada para observar la motilidad de los cilios en los tejidos del plexo coroideo aisladas. Novedades científicas se han reportado en estudios anteriores 1,8.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Required reagents | |||
| for live cell imaging | |||
| ethanol | Wako Chemicals | 057-00456 | |
| Leibovitz L-15 medium | Life Technologies | 11415-064 | |
| for SEM preparation | |||
| ethanol | Wako Chemicals | 057-00456 | |
| Hank's balanced salt solution | Life Technologies | 14170112 | |
| paraformaldehyde | Merck | 1040051000 | |
| glutaraldehyde | Nacalai tesque | 17003-05 | |
| isoamyl acetate | Nacalai tesque | 02710-95 | |
| Molecular Sieves 4A 1/8 | Wako Chemicals | 130-08655 | for preparation of anhydrous ethanol |
| phosphate buffer saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| phosphate buffer, 0.1 M | To make 100 ml, mix 19.0 ml of 0.1 M NaH2PO4 and 81.0 ml of 0.1 M Na2HPO4 | ||
| monosodium phosphate (dihydrate) | Nacalai tesque | 31718-15 | |
| disodium phosphate (anhydrous) | Nacalai tesque | 31801-05 | |
| suclose | Nacalai tesque | 30406-25 | |
| osmium tetroxide | Nisshin EM | 300 | |
| dry ice | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools and materials for dissection | |||
| for both live imaging and SEM preparation | |||
| stereo microscope | Olympus | SZX7 | |
| flat paper towel | |||
| Φ10 cm plastic dish | |||
| 100 ml beaker | |||
| straight operating scissors | Sansyo | S-2B | |
| watchmaker forceps | Dumont | No.DU-3 or -4, INOX | |
| for live cell imaging | |||
| glass bottom dish | Matsunami Glass | D110300 | |
| for SEM preparation | |||
| alminum foil | |||
| 5 ml glass vial with a polyethylene cap | Nichiden Rika-Glass | PS-5A | |
| transfer pipette | Samco Scientific | SM251-1S | for specimen tranfer |
| toothpick | for specimen transfer | ||
| ion sputter with gold-palladium | Hitachi | E-1030 | |
| critical point dryer | Hitachi | HCP-2 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopic equipment and materials | |||
| for live cell imaging | |||
| inverted microscope | Olympus | IX81 | |
| 100 W mercury lump housing and power supply | Olympus | U-ULH and BH2-RFL-T3 | |
| 100 W mercury lamp | Ushio | USH103D | |
| DIC condenser, n.a. 0.55 | Olympus | IX-LWUCD | |
| electrrical shutter | Vincent Associates | VS35S22M1R3-24 and VMM-D1 | manual shutter can be used. |
| band-pass filter (400-700 nm, Φ45 mm) | Koshin Kagaku | C10-110621-1 | |
| ND filter (Φ45 mm) | Olympus | 45ND6, 45ND25 | combination of 25% and 6% ND filters are used |
| objective lens (water immersion) with DIC element | Olympus | UApo 40XW/340, n.a., 1.15 with IX-DPAO40 | |
| high-speed video camera | Allied Vision Technologies | GE680 | ≥200 Hz frame rate and 1 msec expose time |
| image acquisition / analysis software | in-hous software | TI Workbench | capable of acquisition at high frame rates. |
| PC for camera control / analysis | Apple | Mac Pro | |
| vibration isolation table | Meiritsu Seiki | AD0806 | |
| weight for tissue | Warner Instruments | slice anchor kits | It can be made with nylon mesh glued to a U-shape squashed Φ0.5 mm platinum wire. |
| cover glass (alternative weight for tissue) | Matsunami | made-to-order | A cover glass can be used as a tissue weight. |
| for SEM | |||
| inverted microscope | Olympus | IX81 | |
| scanning electron microscope | JEOL | JSM-6510 | |
References
- Nonami, Y., Narita, K., Nakamura, H., Inoue, T., Takeda, S. Developmental changes in ciliary motility on choroid plexus epithelial cells during the perinatal period. Cytoskeleton. 70 (12), 797-803 (2013).
- Bisgrove, B. W., Yost, H. J. The roles of cilia in developmental disorders and disease. Development. 133 (21), 4131-4143 (2006).
- Fliegauf, M., Benzing, T., Omran, H. When cilia go bad: cilia defects and ciliopathies. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (11), 880-893 (2007).
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