Protocol
I protocolli e l'uso di animali da esperimento sono stati approvati dalla cura degli animali e l'uso dei comitati istituzionali presso l'Università di Yamanashi e Waseda University. La cura degli animali è stata eseguita in conformità con le linee guida istituzionali.
1. CPEC Preparazione
- Preparare i seguenti apparati e materiali: un microscopio stereo, preferibilmente in grado di trasmettere illuminazione dal basso; un paio di pinze da orologiaio (Dumont # 3 o # 4), sterilizzata fiamma, forbici operativi diritte, sterilizzato fiamma; due sterili piatti 10 centimetri di plastica contenenti 20 ml ghiacciata Leibovitz L-15; 35 millimetri piatti con fondo di vetro, contenenti 2 ml di RT Leibovitz L-15; un becher da 100 ml contenente 70% di etanolo; cuccioli neonatali mouse.
- Brevemente immergere un mouse neonatale in 70% di etanolo e eutanasia rapidamente decapitazione utilizzando le forbici operativi.
- Mettere subito la testa in gelida Leibovitz L-15 di media sterile 10 centimetri dish.
- Togliere la pelle dai calvaria utilizzando la coppia di pinze orologiaio, tagliare aprire il cranio per esporre il cervello, e quindi tagliare i nervi cranici per isolare tutto il cervello.
- Trasferire il cervello per un nuovo piatto contenente ghiacciata Leibovitz L-15 a medio e osservare al microscopio stereo, facendo in modo che il cervello è completamente immerso nel mezzo.
- Impostare la parte dorsale del cervello rivolto verso l'alto, e orientare il cervello in modo che i bulbi olfattivi risiedono nella posizione 03:00 (per le persone destri). Tenere il cervello leggermente con le pinzette nella mano sinistra.
- Utilizzando le pinze dissezione fini (Dumont # 3 o 4 #) nella mano destra, tagliare il corpo calloso e sotto il parenchima che collega gli emisferi cerebrali, lungo la fessura longitudinale del cervello.
- Spingere delicatamente gli emisferi cerebrali via ai fianchi laterali ed esporre la fessura cerebrale trasversale.
- Separare gli emisferi pizzicando fuori the parenchima tra l'emisfero e talamo.
- Estrarre delicatamente i laterali plesso coroideo ventricolari che è attaccato alla parte laterale dell'ippocampo dal Affixa lamina.
- Trasferire i isolati plesso coroideo al piatto fondo di vetro 35 millimetri contenente fresco Leibovitz L-15 di media, e sovrapporre un peso (Materials List) delicatamente per tenere il tessuto in luogo.
2. Immagini dal vivo di CPEC Cilia
- Verificare il corretto raggi ultravioletti (UV) e il filtro dedotto (IR) taglio (s) per bloccare luminosa inferiore a 400 nm e più di 700 nm, e che a densità neutra (ND) Filtri (25% e il 6%), sono inseriti nel percorso di luce del microscopio invertito.
- Regolare la messa a fuoco della lente obiettivo rudemente per occhio, e quindi regolare il condensatore in modo che il centro ed il fuoco per conformarsi alla illuminazione Köhler. Inserire un contrasto interferenziale differenziale appropriata (DIC) prisma, un elemento DIC, nonché analizzatore e polarizzatore elementi in lipercorso ght di conformarsi alle ottiche DIC.
- Regolare il contrasto di vista dalla posizione del prisma DIC modo che la struttura della superficie del tessuto è più riconoscibile. Se tutti cilia delle cellule bersaglio sono mobili, una chiara visione di ciglia motile non può essere ottenuta con occhio a causa del loro movimento.
- Modificare il percorso della luce per la videocamera, e rimuovere i filtri ND per aumentare la potenza della luce.
- Usare la fotocamera in modalità di messa a fuoco per regolare il campo visivo e messa a fuoco. Durante la messa a fuoco, in cui le immagini video vengono visualizzati in tempo reale sul monitor, una chiara visione di ciglia motilità non è disponibile.
- Usare la fotocamera a 200 Hz con un tempo di esposizione di 0,1 ms per il periodo desiderato (secondi a minuti). Dopo l'acquisizione della pila di immagini, singoli fotogrammi visualizzeranno strutture ciliari chiare. Se i bordi ciliari sono sfocate, di aumentare la frequenza dei fotogrammi o utilizzare un tempo di esposizione più breve.
- Registrare il movimento di CPEC ciglia entro 25-60 minuti dopo l'eutanasia in LeibovitzL-15.
3. Analisi del Movimento ciliare
- Tenere traccia manualmente battendo i modelli di ogni ciglio sul monitor del computer. Segna posizioni punta ciliare in ogni fotogramma con il puntatore del mouse, che vengono assemblati per informazioni traiettoria di ogni ciglio. O analizzare le informazioni traiettoria con lo stesso software o esportare in altre applicazioni più generali per ulteriori analisi. L'efficienza di questa fase di analisi è descritto nella discussione.
- Classificare le traiettorie in due modalità di movimento, avanti e indietro o di rotazione, a occhio.
- Calcolare la frequenza battito ciliare (CBF) utilizzando la seguente formula: [CBF = (numero di fotogrammi al secondo) / (numero medio di frame per un singolo battito)] 14, che può essere ottenuto da un diagramma di moto punta ciliare (Figura 3 ). Ripetere questo calcolo per più cicli battito ciliare, perché altra cilia sulla stessa cella può interferire con il movimento di ciascun cilium, con conseguente irregolarità.
- Per analizzare l'uniformità angolare del battito ciliare assi all'interno di una singola cella, definire l'angolo θ battitura per ogni traiettoria (Figura 4). Per traiettorie indietro e indietro, misura le posizioni della punta cilia a una linea retta, e definire θ come l'angolo del segmento fa con asse x. Per traiettorie rotazionali, montare le posizioni ad un'ellisse, e definire θ come l'angolo l'asse maggiore dell'ellisse fa con asse x. I dettagli del montaggio sono descritti nella sezione risultati rappresentativi.
- Per una descrizione quantitativa di ogni traiettoria, calcolare generalizzata proporzioni AR. Brevemente, ruotare la traiettoria - θ e definire AR come il rapporto tra le larghezze della distribuzione lungo x - e -axes y (Figura 4B). I dettagli sono indicati nella sezione risultati rappresentativi, e l'interpretazione, Significato, e la limitazione del parametro sono descritti nella discussione.
4. Preparazione del campione per SEM
Nota: SEM è un metodo importante per valutare lo stato delle ciglia su CPECs in modo globale. Per preparare campioni per SEM, una procedura standard riportato in precedenza 15 viene impiegato con lievi modifiche.
- Prima sezionare il tessuto dal cervello, preparare il fissativo in una fiala di vetro da 5 ml con tappo in polietilene. Il fissativo contiene il 2% paraformaldeide, glutaraldeide al 2,5% (metà soluzione Karnovsky 16) in tampone fosfato 0,1 M, pH 7,4.
- Sezionare il tessuto dal cervello come descritto al punto 1.
- Brevemente sciacquare il tessuto isolato con la soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) in un nuovo piatto e quindi fissare il tessuto nella fissante nella fiala di vetro per 1 ora a temperatura ambiente. Utilizzare pipette monouso e trattare i campioni gente. Dopo lavaggio in HBSS, il tessuto diventa appiccicoso.
- Per trasferire i campioni nella soluzione fissativo, lentamente espellere una piccola quantità di soluzione contenente il tessuto dalla pipetta di trasferimento come una gocciolina e aggiungere al fissativo.
- Dopo la fissazione, scartare il fissativo e lavare il tessuto con tampone fosfato tre volte.
- Immergere il tessuto in una soluzione di saccarosio al 10% per lavare i restanti aldeidi. Per assicurare l'eliminazione completa aldeidi, immergere i campioni nella soluzione per 10 minuti e quindi ripetere due volte con fresca 10% di saccarosio. Questo passaggio è importante per una buona post-fissazione in fasi successive.
- Immergere il tessuto in una soluzione di 1% tetrossido di osmio in tampone fosfato per 30 min e poi posto su ghiaccio per post-fissazione. Giudicare il grado di osmification dal colore del campione: quando aldeidi vengono completamente rimossi, il campione è nero.
- Lavare i campioni di tessuto post- fisso a lungo con doppio distilled acqua più volte.
- Disidratare i campioni di immersione in concentrazioni graduati di etanolo, generalmente 65%, 75%, 85%, 95%, 99% e 100%, per 10 minuti ciascuno. Ottenere etanolo anidro inserendo setacci molecolari in 99,5% di etanolo da una bottiglia appena acquistato. Ripetere disidratazione con etanolo anidro tre volte.
- Porre i campioni disidratati in acetato di isoamile, un reagente di sostituzione per punto essiccazione critico, per 10 min. Ripetere questa operazione due volte. Questo reagente evapora rapidamente e il campione può diventare secca, con conseguente distruzione dalla tensione superficiale. Pertanto, non asciugare completamente il campione.
- Dopo l'ultimo scambio di acetato isoamile, rimuovere la maggior parte del solvente, immediatamente avvolgere la fiala di vetro aperto con un foglio di alluminio, e posizionare il flacone in ghiaccio secco. Utilizzando un ago o una pinza sottile, fare diversi fori nella pellicola che copre la bocca del flacone, in modo che l'anidride carbonica liquida scorre facilmente nel flaconcino nel punto dryer critica. Passare alla fase successivail più rapidamente possibile.
- In questa fase, ridurre al minimo il riporto di acetato isoamile nella camera del phon, ma non lasciare che il campione asciughi completamente prima del punto di essiccazione critico. Inoltre, non lasciare il campione sul ghiaccio secco per un tempo inutilmente lungo per evitare la formazione di brina sulla fiala.
- Trasferire le fiale di vetro imballati in pellicola contenenti i campioni di tessuto nel punto dryer critico che assicura la struttura superficiale del tessuto rimane intatto mentre l'acqua contenuta nella rimozione del tessuto. Informazioni dettagliate sul funzionamento del punto asciugatrice critica può essere ottenuto dalle istruzioni del produttore.
- Maneggiare con cura i campioni con uno stuzzicadenti per ridurre al minimo i danni meccanici. I campioni di tessuto derivanti secche sono fragili. Montare i campioni sul stub metallo e cappotto d'oro-palladio utilizzando una polverizzazione ionica.
5. Osservazione al SEM
- Osservare da SEM e registrare immagini con una fotocamera digitaleattrezzato per microscopio elettronico a scansione.
- Trasferire i dati delle immagini digitali ad un PC per l'analisi.
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Representative Results
Una panoramica del flusso di lavoro è mostrata in Figura 1, comprese le immagini dei dispositivi.
Osservazioni dal vivo di movimento di CPECs
Film 1 mostra un film di CPECs isolati da un topo perinatale e film 2 mostra una vista espansa delle immagini in film 1. Va notato che i singoli suggerimenti ciliari sono meno chiari in immagini fisse rispetto a quelli in film. La Figura 2 mostra tracciamento del moto di due cilia con diverse modalità di movimento, avanti e indietro e movimenti di rotazione, dai dati riportati in Film 1 e 2. Figura 3 mostra una semplice analisi delle traiettorie del cilia, in cui la differenza di fase nelle due coordinate è evidente nel movimento di rotazione.
Analisi di CPEC traiettorie punta ciliare
De tailed metodi per analizzare quantitativamente ciascuna traiettoria sono mostrate in Figura 4 con illustrazioni schematiche definizioni l'angolo θ battito (A) e un diagramma di flusso dell'analisi con risultati rappresentativi (B).
Per definire l'angolo θ pestaggio per traiettorie indietro e indietro, misura le posizioni della punta ciliare durante più cicli per una retta y = ax + b, e definire la direzione pestaggio come quello lungo la linea montato. Definire l'angolo di battitura qui come θ = Arc tan a. Poiché spesso raccordo linea riesce ad estrarre la direzione in caso di movimento rotatorio, montare le traiettorie rotazionali ad un'ellisse, e definire la direzione di quella lungo l'asse maggiore dell'ellisse montato. Più precisamente, le posizioni punta (x, y) durante molteplici cicli di battitura sono fissati alla funzione qui sotto.
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dove 
Il raccordo ellisse prevede cinque parametri di adattamento: x 0, y 0, a, b, e θ. I - x ed y coordinate -spatial del centro dell'ellisse sono x 0 e y 0, rispettivamente. I raggi maggiore e minore dell'ellisse sono A e B, rispettivamente. Angolo θ è l'angolo che l'asse maggiore fa con l'asse x, o l'angolo di battitura. Una rappresentazione schematica di questi parametri è mostrato nel pannello di destra della Figura 4A. Il montaggio viene effettuato utilizzando software Igor Pro definendo la funzione esplicita sopra descritta. Poi, un istogramma di battere l'angolo θ per tutte le cilia osservared nella stessa cella viene tracciata come un istogramma circolare (figura 2 in Narita et al. 8). La frequenza è normalizzata al numero di punte ciliari analizzati. Va notato che ogni cilium è interpretato avere due θ valori nell'istogramma circolare, ad esempio π / 4 e 3π / 4, portando ad una distribuzione simmetrica della direzione.
Per definire generalizzata proporzioni AR, le posizioni della punta ciliare durante cicli multipli vengono ruotate di - θ (Figura 4B). Secondo la rotazione, sia avanti e indietro e traiettorie di rotazione diventano distribuiti approssimativamente parallelo alla asse x, in cui la larghezza della distribuzione A e B, lungo gli assi x ed y, rispettivamente, sono definiti come mezzo di la differenza tra il valore minimo e massimo. Pertanto, questi parametri sono più rilevanti ai raggi maggiore e minore dell'ellisse, ae b. AR viene quindi definito come il rapporto tra A e B by AR = B / A.
Le osservazioni della coroide plesso epitelio di SEM
SEM permette l'osservazione della struttura superficiale ammenda di esemplari. La presenza di cilia su CPECs è confermato nel corso tempo evolutivo. L'emergere di ciglia multipla su CPECs viene osservato dal giorno embrionale (E) 13, poco dopo lo sviluppo plesso coroideo inizia nei ventricoli laterali intorno E11. In questa fase, le celle sono piccole con un aspetto immaturo variabili, e le punte ciliari puntano verso varie direzioni. A E15, un ciuffo di ciglia multipla è stabilito sulla parte superiore della superficie apicale, che sono in piedi fuori dalla microvilli circostanti. Al giorno postnatale (P) 2, molte ciglia sono fissati a una posizione piegata, che riflette la motilità ciliare osservato da immagini dal vivo. A P14, la maggior parte delle cellule possiedono più cilia che sono non mobili nonché microvilli w esimo una texture più fine rispetto alle fasi precedenti. Figura 5 mostra le immagini SEM di CPECs con ciglia in queste fasi. Sulla base dei film mostrato in Figura 1 e Film 1, è ovvio che le ciglia motili sono facilmente riconoscibili per l'imaging dal vivo. Tuttavia, è difficile distinguere cilia non mobili mediante microscopia DIC. Di conseguenza, SEM è indispensabile per capire gli stati ciliari complessivi.
Figura 1:. Panoramica del flusso di lavoro (a) Microscopio stereo. (B) Microscopio invertito dotato di un dispositivo di carica (CCD) fotocamera. (C) dello schermo del computer durante l'analisi. (D) Ion polverizzazione. (E) dei campioni per SEM. Microscopio elettronico (f) Scansione.
Movie 1.PLOAD / 52991 / Figure_2.mov "target =" _ blank "> Movie della vista dall'alto di CPECs e ciglia da un cucciolo del mouse P2 in microscopia video ad alta velocità. A causa della superficie irregolare del tessuto plesso coroideo, questa istantanea contiene . sia in-focus e gli aerei out-of-focus La zona nell'area di rigore ampliato e mostrato in Movie 2 bar Scala:. 2 micron.
Movie 2. Movie della visione allargata del campione di tessuto in Movie 1. Battere ciglia ha mostrato movimenti sia di rotazione o di back-e-via. Scala bar: 1 micron.
Figura 2:. Ricostituzione della traiettoria di CPEC cilia dalle immagini time-lapse in Film 2 (A) Cilia con movimento avanti e indietro (in alto) e movimento di rotazione (in basso). DIC immagini dai dati di film sono presentati in 50 msec intervalli (1-8, bar scala: 1 micron). La posizione della punta destinazione ciliare è indicato da una freccia. (B) Le traiettorie (linea tratteggiata) e le posizioni delle punte ciliari (cerchi colorati) mostrati nelle immagini sono sovrapposte.
Figura 3:. Due modalità di movimento CPEC punta ciliare ricostituita a partire dai dati di film movimenti punta ciliare rappresentativi, movimento avanti e indietro (A) e il movimento di rotazione (B), oltre cicli multipli sono presentati come traiettorie (top, barre di scala: 0.5 micron). Andamento nel tempo della xey coordinate della posizione della punta sono tracciati, rispettivamente (al centro). Per dimostrare un sfasamento tra le due coordinate, xey coordinate sono stati normalizzati per [-1,1] e sovrapposti (in basso, le linee rosse e blu, rispettivamente).
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Figura 4: illustrazioni schematiche che descrivono l'analisi delle traiettorie ciliari punta (A) Definizioni dell'angolo θ pestaggio per avanti e indietro (pannello di sinistra) e rotazione (pannello di destra) traiettorie.. Parametri nella formula che descrive l'ellisse montato, a, b, x 0, y 0, sono mostrati nel pannello di destra. (B) Diagramma di flusso dell'analisi montaggio delle traiettorie per definire l'angolo θ battitura e AR. I risultati effettivi degli apparecchi delle traiettorie rappresentativi sono presentati in pannelli di destra.
Figura 5: Immagine SEM di ciglia. Rappresentante micrografie SEM di CPECs a E13, E15, P2 e P14. Nel corso del tempo, CPECs di maggiori dimensioni, e sviluppati microvilli e cilia sulla superficie apicale. Un ciuffo di ciglia a E13 è ancora acquisire la motilità. A P2, quando il rapporto di ciglia con motilità raggiunto il punto più alto, si osservano molte ciglia piegate. A P14, ciglia perdono motilità. Scala bar: 5 micron.
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Discussion
Prospettive di questo metodo
Sebbene la tecnica qui descritta non fornisce un'analisi più dettagliata delle ciglia rispetto ai metodi precedentemente pubblicati, il significato di questa tecnica risiede nella semplicità del sistema ed economicità, che può essere facilmente applicato a qualsiasi tipo di screening di motilità ciliare ex vivo. In particolare, TI Workbench fornisce un'interfaccia semplice e user-friendly che consente ai ricercatori di osservare e analizzare la motilità ciliare più facilmente. Efficaci metodi di monitoraggio automatici non sono stati sviluppati per gli oggetti a basso contrasto, come le ciglia senza macchia in video-enhanced contrasto DIC. Anche se il metodo per tracciare il movimento ciliare è manuale in questa tecnica, la quantità di sforzo in ciliare analisi di motion tracking in modo ottimale ridotta rispetto all'uso di software di uso generale per l'analisi delle immagini.
Dissezione del campione
Per preparare ex campioni vivo CPEC, manipolazioni rapide e delicate sono necessari per preservare la vitalità dei tessuti, che garantisce la motilità delle ciglia ex vivo. Perché contaminazione da eritrociti offusca il campo di osservazione, gentile ma intricato lavaggio del tessuto sezionato con tampone fosfato è fortemente raccomandato. Per evitare il sanguinamento, la cura deve essere esercitata per evitare di strappare coroide dell'arteria posteriore che può essere identificato come una struttura filiforme rossastro prominente aderito alla lamina Affixa del plesso colloidale.
Microscopio
Un microscopio invertito equipaggiato con ottica DIC e una sorgente luminosa trasmissione ad alta potenza è essenziale per questo metodo. Poiché le lampade al mercurio sono generalmente incapaci di frequente accensione e lo spegnimento, un otturatore di fronte l'alloggiamento della lampada è necessario. O un otturatore manuale o elettrico può essere utilizzato per questo scopo. Per proteggere i campioni e gli occhi fr dell'osservatoreom UV e luce IR, filtri ottici sono necessari per consentire solo la luce visibile (400-700 banda passante o una combinazione di filtri IR e UV). Filtri ND sono necessari per modificare la potenza della luce che varia a seconda della situazione anche: monitoraggio da parte dell'occhio, messa a fuoco con una videocamera, e ad alta velocità di registrazione time-lapse. Una lente obiettivo con elevata apertura numerica è necessaria per una risoluzione elevata. C'è una certa distanza tra la parte superiore del vetrino e il punto focale causa della morfologia e lo spessore del tessuto. Pertanto, una lente immersione in acqua piuttosto che un obiettivo a immersione in olio è preferito per una migliore qualità dell'immagine. Isolamento delle vibrazioni è anche necessario produrre pile di immagini stabili. Tavoli Air dumper tipo sono utili per questo scopo, ma semplice ammortizzazione del microscopio inserendo palle da tennis sotto la base del microscopio con un tavolo stabile può anche funzionare.
Videocamera
Una telecamera CCD capace di almst 200 fotogrammi / sec è necessario per tracciare il movimento delle ciglia. Negli ultimi dieci anni, le telecamere CCD con frame rate più veloci rispetto al tasso standard video (25-30 Hz) si sono resi disponibili a costi molto più bassi. Modelli fotocamera in grado di tempi più brevi rispetto esporre l'intervallo del fotogramma sono utili per ridurre la sfocatura dovuta al movimento delle ciglia senza aumentare la quantità di dati. Un tempo di esposizione di 0,1 ms e un intervallo di telaio 5 msec (200 Hz) sono le condizioni minime per ottenere immagini ciliari CPECs con una qualità sufficiente.
Software
L'analisi per tracciare il movimento di ogni ciglio richiede molto tempo, specialmente quando i pacchetti software di uso generale per l'analisi delle immagini vengono utilizzati per tenere traccia ogni punta ciliare. Ridurre le fasi di attività ripetute, come mouse cliccando sulla posizione della punta ciliare sul monitor, la selezione di un menu per registrare la posizione cliccata, e facendo clic su un pulsante per passare al fotogramma successivo dell'immagine, si traduce in un significativo reproduzione di tempo e fatica. In questo studio, una routine speciale è stata aggiunta al software TI Workbench su misura. Nella modalità di tracciamento ciliare del software TI Workbench, l'utente continua a loop la seguente operazione in due fasi semplice: spostando il puntatore del mouse alla punta ciliare e premendo un tasto freccia sulla tastiera per avanzare il telaio, che non richiede il movimento puntatore del mouse o gli occhi dell'utente per spostare (a menu e pulsanti sullo schermo del computer) dalle punte ciliari sullo schermo del computer. Il software registra i posizioni punta ciliari, mostra la traiettoria registrata per assistere l'utente, e crea una tabella di informazioni sul movimento ciliare per ulteriori analisi. Maggior parte dei software di uso generale per l'analisi delle immagini consente di macro di programmazione per l'elaborazione batch di tali compiti ripetuti. Tale programmazione personalizzato per ridurre passaggi ripetuti è fortemente raccomandato.
Analisi delle traiettorie
Estrazione del trajectories è stata effettuata utilizzando il software TI Workbench su misura, come descritto sopra. Un'analisi relativamente semplice e di elaborazione delle immagini sono stati effettuati con lo stesso software. Per le analisi di montaggio, la traiettoria di ogni punta ciliare è stato trasferito al software Igor Pro. Altri software di analisi avanzato come MATLAB può essere usato anche per questo scopo.
Nel corso di studio, a causa delle difficoltà di categorizzare le traiettorie in avanti e indietro o traiettorie di rotazione, le traiettorie sono stati classificati ad occhio in cieco, che sono state confermate da un altro osservatore, con conseguente classificazione coerente. Tuttavia, più matematicamente rigoroso misure per categorizzare le traiettorie senza possibilità di arbitrio sarebbe preferibile. Ellisse montaggio delle traiettorie sembra essere ideale, che potrebbe quantificare l'entità della ellitticità come le proporzioni dell'ellisse attrezzata () sia in avanti e indietro e movimenti di rotazione. Tuttavia, Un tentativo di utilizzare la distribuzione del rapporto di aspetto per definire un valore di soglia per la classificazione era inefficace. Il raccordo spesso fallito per traiettorie indietro e indietro, i parametri non è riuscito spesso a convergere, e il raccordo convergenti era apparentemente illusorio. Pertanto, il montaggio ellisse non è stato adottato per classificare automaticamente le traiettorie o quantificare l'ellitticità di ogni traiettoria. Il montaggio è stato effettuato per estrarre direzione battito punte rotazionale movimento come l'asse maggiore dell'ellisse montato.
In questo studio, AR è stato proposto per quantificare la misura in cui una traiettoria devia da un lineare ideale movimento di va e vieni. Il parametro è il rapporto tra la larghezza della distribuzione perpendicolare alla direzione battitura a quella lungo la direzione. Il valore dovrebbe essere zero quando la traiettoria è una linea retta, e uno quando la traiettoria è un cerchio, simile al formato dell'ellisse di cui sopra.
In pratica, ottenendo il valore AR può essere relativamente facile ruotando la traiettoria, in modo che la direzione di battitura diventa parallela alla asse x (Figura 4B). Tale quantificazione porta a valori notevolmente distinti per le due modalità di movimento, che suggerisce l'uso potenziale del parametro non solo per quantificare le caratteristiche di ogni traiettoria, ma anche per classificare più rigorosamente le traiettorie. Tuttavia, va notato che la direzione battito stessa è già il risultato di processi di montaggio distinti per le due modalità del metodo corrente.
Ulteriore miglioramento dell'analisi, ad esempio un algoritmo di raccordo più avanzata, potrebbe risolvere i problemi di possibile arbitrarietà.
Un aspetto riguardante l'ellitticità della traiettoria è che il battito di ogni cilium CPEC non possa essere in atto nel piano che è rigorosamente perpendicolare al x - y
Preparazione per SEM
Durante la preparazione per l'osservazione SEM, ci sono diversi punti importanti che assicurano l'acquisizione di immagini di alta qualità. Innanzitutto, post-fissazione con tetrossido di osmio deve essere eseguita accuratamente, comprese pre-lavaggio con una soluzione di saccarosio al 10%. Senza un adeguato fissaggio dalla procedura osmification, i passi successivi non possono mantenere o ripristinare la condizione dei campioni, portando ad una qualità inferiore della preparazione. Perché fissativi aldeide stanno riducendo gli agenti, eventuali aldeidi rimanenti all'interno del campione inibiscono l'attività di tetrossido di osmio, un forte reattivo ossidante. Per assicurare l'eliminazione di aldeidi superflue nei campioni, lavaggio accurato con la soluzione di saccarosio è un imperativo. Nei casi di po subottimalest-fissaggio, il colore del campione non cambia dal marrone al nero. In secondo luogo, il volume di tetrossido di osmio deve essere almeno 50 volte più grande di quella del campione. Altrimenti, la fissazione sufficiente non può essere previsto. In terzo luogo, è importante evitare l'essiccazione completa dei campioni, in particolare durante il processo di disidratazione che impiega etanolo altamente puro e acetato isoamilico. Essiccazione del campione distrugge le strutture superficiali fini come cilia, con conseguente scarsa qualità delle immagini.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione. Questo lavoro si propone di riferire metodologia dettagliata per osservare la motilità delle ciglia in isolate tessuti plesso coroide. Novità scientifiche sono stati riportati in studi precedenti 1,8.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Required reagents | |||
| for live cell imaging | |||
| ethanol | Wako Chemicals | 057-00456 | |
| Leibovitz L-15 medium | Life Technologies | 11415-064 | |
| for SEM preparation | |||
| ethanol | Wako Chemicals | 057-00456 | |
| Hank's balanced salt solution | Life Technologies | 14170112 | |
| paraformaldehyde | Merck | 1040051000 | |
| glutaraldehyde | Nacalai tesque | 17003-05 | |
| isoamyl acetate | Nacalai tesque | 02710-95 | |
| Molecular Sieves 4A 1/8 | Wako Chemicals | 130-08655 | for preparation of anhydrous ethanol |
| phosphate buffer saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| phosphate buffer, 0.1 M | To make 100 ml, mix 19.0 ml of 0.1 M NaH2PO4 and 81.0 ml of 0.1 M Na2HPO4 | ||
| monosodium phosphate (dihydrate) | Nacalai tesque | 31718-15 | |
| disodium phosphate (anhydrous) | Nacalai tesque | 31801-05 | |
| suclose | Nacalai tesque | 30406-25 | |
| osmium tetroxide | Nisshin EM | 300 | |
| dry ice | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools and materials for dissection | |||
| for both live imaging and SEM preparation | |||
| stereo microscope | Olympus | SZX7 | |
| flat paper towel | |||
| Φ10 cm plastic dish | |||
| 100 ml beaker | |||
| straight operating scissors | Sansyo | S-2B | |
| watchmaker forceps | Dumont | No.DU-3 or -4, INOX | |
| for live cell imaging | |||
| glass bottom dish | Matsunami Glass | D110300 | |
| for SEM preparation | |||
| alminum foil | |||
| 5 ml glass vial with a polyethylene cap | Nichiden Rika-Glass | PS-5A | |
| transfer pipette | Samco Scientific | SM251-1S | for specimen tranfer |
| toothpick | for specimen transfer | ||
| ion sputter with gold-palladium | Hitachi | E-1030 | |
| critical point dryer | Hitachi | HCP-2 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopic equipment and materials | |||
| for live cell imaging | |||
| inverted microscope | Olympus | IX81 | |
| 100 W mercury lump housing and power supply | Olympus | U-ULH and BH2-RFL-T3 | |
| 100 W mercury lamp | Ushio | USH103D | |
| DIC condenser, n.a. 0.55 | Olympus | IX-LWUCD | |
| electrrical shutter | Vincent Associates | VS35S22M1R3-24 and VMM-D1 | manual shutter can be used. |
| band-pass filter (400-700 nm, Φ45 mm) | Koshin Kagaku | C10-110621-1 | |
| ND filter (Φ45 mm) | Olympus | 45ND6, 45ND25 | combination of 25% and 6% ND filters are used |
| objective lens (water immersion) with DIC element | Olympus | UApo 40XW/340, n.a., 1.15 with IX-DPAO40 | |
| high-speed video camera | Allied Vision Technologies | GE680 | ≥200 Hz frame rate and 1 msec expose time |
| image acquisition / analysis software | in-hous software | TI Workbench | capable of acquisition at high frame rates. |
| PC for camera control / analysis | Apple | Mac Pro | |
| vibration isolation table | Meiritsu Seiki | AD0806 | |
| weight for tissue | Warner Instruments | slice anchor kits | It can be made with nylon mesh glued to a U-shape squashed Φ0.5 mm platinum wire. |
| cover glass (alternative weight for tissue) | Matsunami | made-to-order | A cover glass can be used as a tissue weight. |
| for SEM | |||
| inverted microscope | Olympus | IX81 | |
| scanning electron microscope | JEOL | JSM-6510 | |
References
- Nonami, Y., Narita, K., Nakamura, H., Inoue, T., Takeda, S. Developmental changes in ciliary motility on choroid plexus epithelial cells during the perinatal period. Cytoskeleton. 70 (12), 797-803 (2013).
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