Observasjon av Ciliary Bevegelse av Choroid Plexus Epitelceller Published: July 13, 2015 doi: 10.3791/52991

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Takafumi Inoue¹, Keishi Narita², Yuta Nonami¹, Hideki Nakamura¹, Sen Takeda²

¹Department of Life Science and Medical Bioscience, Faculty of Science and Engineering, Waseda University, ²Department of Anatomy and Cell Biology, Interdisciplinary Graduate School of Medicine & Engineering, University of Yamanashi

Protocol

Protokollene og bruk av forsøksdyr ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komiteer ved Universitetet i Yamanashi og Waseda University. Animal forsiktighet ble utført i samsvar med institusjonens retningslinjer.

1. CPEC Forberedelse

1. Fremstille de følgende apparatur og materialer: et stereomikroskop, fortrinnsvis i stand til å overføre lys fra bunnen; et par av urmaker tang (Dumont # 3 eller 4), flamme sterilisert, rette drifts saks, flamme-steriliseres; to sterile 10 cm plast retter som inneholder 20 ml iskald Leibovitz L-15 medium; 35 mm glassbunn retter som inneholder 2 ml RT Leibovitz L-15 medium; et 100 ml begerglass inneholdende 70% etanol; neonatale mus valper.
2. I korthet fordype en neonatal mus i 70% etanol og avlive raskt ved halshogging med drifts saks.
3. Plasser hodet umiddelbart i iskaldt Leibovitz L-15 medium i sterile 10 cm dish.
4. Fjern skinnet fra calvaria hjelp av par av urmaker tang, kutte åpne skallen for å avsløre hjernen, og deretter kutte hjernenerver å isolere hele hjernen.
5. Overfør hjernen til en ny rett som inneholder iskald Leibovitz L-15 medium og observere under stereomikroskop, og pass på at hjernen er helt oppslukt i mediet.
6. Sett dorsal del av hjernen som vender opp, og orientere hjernen slik at olfactory pærer ligge på tre posisjon (for høyrehendte personer). Hold hjernen forsiktig med pinsett i venstre hånd.
7. Ved hjelp av de fine disseksjon tang (Dumont # 3 eller 4) i høyre hånd, kutt corpus callosum og under parenkym koble hjernehemisfærene, langs lengde sprekken av storhjernen.
8. Trykk forsiktig hjernehemisfærene bort til side sider og avsløre de tverrgående cerebral fissur.
9. Separer halvkuler ved å klemme ut the parenchyma mellom halvkule og thalamus.
10. Dra forsiktig ut de laterale ventrikkel choroid plexus som er knyttet til den laterale siden av hippocampus ved lamina affixa.
11. Overfør de isolerte choroid plexus til 35 mm glassbunn fatet inneholder frisk Leibovitz L-15 medium og klæ en vekt (Materials List) forsiktig for å holde vev på plass.

2. Levende Imaging of CPEC Cilia

1. Bekrefte riktig ultrafiolett (UV) og utledes (IR) cut filter (e) for å blokkere lys som er kortere enn 400 nm og som er lengre enn 700 nm, og at nøytral tetthet (ND) filtre (25% og 6%) settes inn i lysbanen av invertert mikroskop.
2. Juster fokus på objektiv omtrent ved øyet, og deretter justere kondensatoren slik at sentrum og fokus for å samsvare med Köhler belysning. Sett en passende differensialinterferenskontrast (DIC) prisme, et DIC element, samt analysator og polarisatoren elementer i likjempe vei å samsvare med DIC optikk.
3. Juster kontrasten av visningen av DIC prisme stilling, slik at strukturen av vevet overflate er mest kjente. Dersom alle cilia av målcellene er bevegelige, kan et klart syn på bevegelige flimmerhårene ikke oppnås ved øyet på grunn av deres bevegelse.
4. Endre lysbanen til videokameraet, og fjerne ND filter for å øke lys kraft.
5. Bruk kameraet i fokus modus for å justere synsfeltet og fokus. Ved fokusering, der videobilder vises på sanntid på skjermen, er et klart syn på bevegelige flimmerhårene ikke tilgjengelig.
6. Bruk kameraet på 200 Hz med en eksponeringstid på 0,1 ms for ønsket periode (sekunder til minutter). Etter oppkjøpet av bildet stabelen, vil enkeltbilder viser klare ciliary strukturer. Hvis ciliary kantene er uklart, øke bildefrekvens, eller bruke en kortere eksponeringstid.
7. Spill bevegelse CPEC flimmerhårene innen 25-60 min etter eutanasi i LeibovitzL-15 medium.

3. Analyse av Ciliary Motion

1. Manuelt spore slo mønstre av hver cilium på dataskjermen. Marker ciliær tippe stillinger i hver ramme med musepekeren, som er satt sammen for bane informasjon om hver cilium. Enten analysere banen informasjon ved hjelp av den samme programvaren eller eksportere til andre mer generelle applikasjoner for videre analyse. Effektiviteten av denne analysen trinnet er beskrevet i diskusjonen.
2. Klassifisere de baner i to moduser av bevegelse, back-og-tilbake eller roterende, av øyet.
3. Beregn Ciliary vibrerende frekvens (CBF) ved hjelp av følgende formel: [CBF = (antall rammer per sekund) / (gjennomsnittlig antall rammer for et enkelt slag)] ^14, som kan fås fra en stråle spiss bevegelse diagram (figur 3 ). Gjenta denne beregningen for flere ciliær oppmalings sykluser, fordi andre cilia på samme celle kan forstyrre bevegelsen til hvert cilium, noe som resulterer i uregelmessighet.
4. For å analysere den vinkelmessige ensartethet av stråle slå akser innenfor en enkelt celle, definerer det bankende vinkel θ for hver bane (figur 4). For back-og-tilbake baner, passe posisjonene flimmerhårene tips til en rett linje, og definere θ som vinkelen linjen gjør med x -aksen. For rotasjons baner, passer posisjonene til en ellipse, og definerer θ som vinkelen den store akse av ellipsen danner med x -aksen. Nærmere opplysninger om montering er beskrevet i representative resultater delen.
5. For kvantitativ beskrivelse av hver bane, beregne generalisert størrelsesforholdet AR. Kort fortalt dreier banen etter - θ og definere AR som forholdet mellom bredder på fordelingen langs x - og y -axes (Figur 4B). Detaljer er vist i den representative resultater delen, og tolkningen, Betydning, og begrensning av parameteren er beskrevet i diskusjonen.

4. Prøvepreparering for SEM

Merk: SEM er en viktig metode for å evaluere status for flimmerhårene på CPECs på en helhetlig måte. For å forberede prøver for SEM, rapporterte en standard prosedyre tidligere ¹⁵ er ansatt med små modifikasjoner.

1. Før dissekere vev fra hjernen, forberede fiksativ i en 5 ml hetteglass med en polyetylen cap. Fiksativ består av 2% paraformaldehyd, 2,5% glutaraldehyd (halv Karnovsky løsning ¹⁶⁾ i 0,1 M fosfatbuffer, pH 7,4.
2. Dissekere vev ut fra hjernen, som beskrevet i trinn 1.
3. I korthet skylle den isolerte vev med Hanks balanserte saltløsning (HBSS) i en ny form og deretter løse vev i fiksativ i hetteglass i 1 time ved romtemperatur. Bruk engangsoverføring pipetter og håndtere prøvene gently. Etter skylling i HBSS, blir vevet klebrig.
   1. For å overføre prøvene inn i fiksativ løsning, sakte utvise en liten mengde løsning som inneholder vev fra overføringspipetten som en dråpe og legge til fiksativ.
4. Etter fiksering forkaste fiksativ og skyll vev med fosfatbuffer tre ganger.
5. Dyppe vevet i en 10% sukroseløsning for å vaske ut den resterende aldehyder. For å sikre fullstendig eliminering av aldehyder, dyppe prøvene i løsningen i 10 min og deretter gjentas to ganger med frisk 10% sukrose. Dette trinn er viktig for å oppnå riktig etterfiksering i påfølgende trinn.
6. Dyppe vevet i en oppløsning av 1% osmiumtetroksyd i fosfatbuffer i 30 min og deretter plassere på is for post-fiksering. Bedømme graden av osmification av prøven farge: når aldehyder er fullstendig fjernet, er prøven svart.
7. Vask etter fast vevsprøver mye med dobbelt destillert,d vann flere ganger.
8. Dehydrere prøvene ved nedsenking i graderte konsentrasjoner etanol, vanligvis 65%, 75%, 85%, 95%, 99% og 100%, i 10 minutter hver. Skaff vannfri etanol ved å plassere molekylære sikter til 99,5% etanol fra en nyinnkjøpt flaske. Gjenta dehydrering med vannfri etanol tre ganger.
9. Plasser dehydrert prøvene i isoamylacetat, en substitusjons reagens for kritiske punkt tørking i 10 min. Gjenta dette trinnet to ganger. Dette reagenset fordamper hurtig og prøven kan bli tørr, noe som resulterer i ødeleggelse av overflatespenning. Derfor må du ikke tørke prøven helt.
10. Etter den siste utveksling av isoamylacetat, fjerne det meste av løsningsmidlet, straks vikle den åpne hetteglass med aluminiumsfolie, og plasserer ampullen på tørris. Ved hjelp av en nål eller fin pinsett, lage flere hull i folien som dekker munningen av flasken, slik at flytende karbondioksid strømmer lett inn i beholderen i det kritiske punktet tørketrommel. Fortsett til neste trinnså fort som mulig.
11. I dette trinnet, minimere overføring av isoamylacetat inn i kammeret av tørketrommelen, men ikke la prøven tørke skikkelig kritisk punkt tørking. I tillegg må du ikke la prøven på tørris for en unødvendig lang tid for å unngå dannelse av rim på hetteglasset.
12. Overfør folie-innpakket hetteglass inneholdende vevsprøver til det kritiske punkt tørketrommel som sikrer at overflatestrukturen av vevet forblir intakt under fjerning av vann som finnes i vevet. Detaljert informasjon om drift av kritiske punktet hårføner kan fås fra produsentens instruksjoner.
13. Håndter prøvene forsiktig med en tannpirker for å minimere mekanisk skade. De resulterende tørkede Vevsprøvene er skjøre. Monter prøvene på metall stubber og frakk med gull-palladium ved hjelp av et ion frese.

5. Observasjon av SEM

1. Observere ved SEM og ta bilder med et digitalt kamerarustet til scanning elektronmikroskop.
2. Overføre digitale bildedata til en PC for analyse.

Representative Results

En oversikt over arbeidsflyten er vist i figur 1, omfattende bilder av enhetene.

Live-motion observasjoner av CPECs

Movie 1 viser en film av CPECs isolert fra en perinatal mus, og Movie 2 viser en utvidet visning av bildene i Movie 1. Det bør bemerkes at enkelte ciliary tips er mindre tydelig i stillbilder sammenlignet med de i filmer. Figur 2 viser sporing av bevegelse av to cilia med forskjellige moduser av bevegelse, frem-og-tilbake og dreiebevegelser, fra dataene som er vist i filmer 1 og 2. Figur 3 viser en enkel analyse av baner av flimmerhårene, hvor faseforskjellen i de to koordinatene er åpenbart i rotasjonsbevegelse.

Analyse av CPEC ciliær tippe baner

De tailed metoder for å kvantitativt analysere hver bane er vist i figur 4 med skjematiske illustrasjoner av det bankende vinkel θ definisjoner (A) og et flytskjema for analyse med representative resultater (B).

Å definere juling vinkelen θ for back-og-tilbake baner, passe posisjonene til strålespissen under flere sykluser til en rett linje y = ax + b, og definere det bankende retning som at langs utstyrt linje. Definer juling vinkel her som θ = Arc tan en. Fordi linjen montering ofte unnlater å trekke retning i tilfeller av rotasjonsbevegelse, passer rotasjonsbaner til en ellipse, og definerer den retning som den langs den lange aksen til ellipsen montert. Mer presist, blir spissen posisjonene (x, y) i løpet av flere sykluser oppmalings montert på funksjonen nedenfor.
1.jpg "width =" 310 "/>

hvor

Ellipsen montering involverer fem sittende parametere: x _0, y _0, a, b, og θ. X - og Y -spatial koordinatene til senteret for ellipsen x er ₀ og y _0, respektivt. Den større og mindre radier av ellipsen er a og b, henholdsvis. Vinkel θ er den vinkelen som den store akse danner med x -aksen, eller det vibrerende vinkel. En skjematisk fremstilling av disse parametre er vist i den høyre panel i figur 4A. Beslaget er utført ved hjelp av Igor Pro programvare ved å definere den eksplisitte funksjon som er beskrevet ovenfor. Så, et histogram juling vinkel θ for alle cilier observered i samme celle er plottet som en sirkulær histogram (figur 2 i Narita et al. ^8). Frekvensen er normalisert til antall analyserte ciliary tips. Det skal bemerkes at hver cilium er tolket til å ha to θ verdier i den sirkulære histogrammet, f.eks π / 4 og 3π / 4, som fører til symmetrisk fordeling av retningen.

For å definere generalisert sideforhold AR, blir posisjonene til strålespissen i løpet av flere sykluser rotert ved - θ (figur 4B). Ifølge rotasjon, både rygg-og-tilbake og rotasjonsbaner bli fordelt omtrent parallelt til x -aksen, hvor bredden på fordelings A og B, langs x- og y-akser, henholdsvis, er definert som halvparten av forskjellen mellom minimum og maksimum. Derfor er disse parametrene er mer relevant for store og små radier av ellipsen, a og b. Ar er da definert som forholdet mellom A og B ved AR = B / A.

Observasjoner av årehinnen plexus epitel etter SEM

SEM tillater observasjon av den fine overflatestruktur av prøver. Tilstedeværelsen av flimmerhårene på CPECs bekreftes gjennom hele utviklings tidsforløpet. Fremveksten av flere flimmerhårene på CPECs er observert av embryonale dag (E) 13, kort tid etter årehinnen plexus utvikling begynner i sideventriklene rundt E11. På dette stadiet er cellene er små med en variabel umoden utseende, og ciliare tips peker mot forskjellige retninger. På E15, er en dusk av multippel cilia etablert på toppen av den apikale overflate, som står ut fra de omkringliggende mikrovilli. På postnatal dag (P) 2, er mange flimmerhårene fast på en bøyd posisjon, noe som reflekterer stråle motilitet observert av levende avbildning. Ved P14, de fleste cellene har flere cilier som er ikke-motile, samt mikrovilli w ed en finere tekstur sammenlignet med de tidligere stadier. Figur 5 viser SEM bilder av CPECs med flimmerhårene på disse stadiene. Basert på de filmene som er vist i figur 1 og Movie 1, er det åpenbart at motile flimmerhårene blir lett gjenkjent av levende avbildning. Imidlertid er det vanskelig å skille ikke-motile cilia av DIC mikroskopi. Derfor er SEM uunnværlig for å forstå generelle ciliary stater.

Fig. 1: Oversikt over arbeidsflyten (a) med stereomikroskop. (B) Inverted mikroskop utstyrt med et ladet-coupled device (CCD) kamera. (C) computerskjermen under analysen. (D) Ion frese. (E) Prøve for SEM. (F) Scanning elektronmikroskop.

Film 1.pload / 52991 / Figure_2.mov "target =" _ blank "> Movie av ovenfra CPECs og flimmerhårene fra en P2 mus valp i high-speed video mikroskopi. På grunn av uregelmessig overflate av årehinnen plexus vev, inneholder dette snapshot . både i fokus og ut av fokus flyene Området i sekstenmeteren utvidet og vist i Movie 2 Skala:. 2 mikrometer.

Movie 2. Movie av den utvidede visningen av vevsprøve i Movie 1. Slo cilier viste enten roterende eller back-og-tilbake bevegelser. Skala: 1 mikrometer.

Figur 2:. Tilberedning av banen CPEC flimmerhårene fra time-lapse bilder i Movie 2 (A) Cilia med back-og-tilbake bevegelse (øverst) og rotasjonsbevegelse (nederst). DIC bilder fra filmen data presenteres på 50 ms intervaller (1-8, Skala: 1 mikrometer). Posisjonen til målet strålespissen er merket med en pilspiss. (B) De baner (stiplet) og posisjoner ciliary tips (fargede sirkler) som vises i bildene kledde.

Figur 3:. To moduser av CPEC ciliær tips bevegelse rekonstituert fra filmdata Representative ciliær tippe bevegelser, back-og-tilbake bevegelse (A) og rotasjonsbevegelse (B), over flere sykluser presenteres som baner (topp, skala barer: 0,5 um). Tid kurs av x- og y-koordinatene til spissposisjonen er plottet, henholdsvis (i midten). For å demonstrere en faseforskyvning mellom de to koordinatene, x- og y-koordinatene ble normalisert til [-1,1] og kledde (nederst, røde og blå linjer, henholdsvis).

igur 6 "src =" / files / ftp_upload / 52991 / 52991fig6.jpg "/>
Figur 4: Skjematisk illustrasjoner beskriver analyse av ciliary tippe baner (A) Definisjoner av det bank vinkelen θ for back-og-tilbake (venstre panel) og roterende (høyre panel) baner.. Parametere i formelen beskriver utstyrt ellipse, a, b, x _0, og y _0, vises i panelet til høyre. (B) Flytskjema for montering analyse av banene for å definere det bankende vinkel θ og AR. Faktiske resultatene av montering av de representative baner er presentert i høyre panel.

Figur 5: SEM bilde av flimmerhårene. Representative SEM mikrografer av CPECs på E13, E15, P2 og P14. Under tiden selvfølgelig økt CPECs i størrelse, og utviklet microvilli og flimmerhårene på den apikale overflaten. En dusk av flimmerhårene på E13 er likevel å skaffe bevegelighet. Ved P2, når forholdet mellom cilia med motilitet nådd det høyeste punkt, er mange bøyde cilia observert. På P14, flimmerhårene miste bevegelighet. Skala: 5 mikrometer.

Discussion

Perspektiver av denne metoden

Selv om den teknikk som er beskrevet her, ikke gir en mer detaljert analyse av cilia enn tidligere publiserte fremgangsmåter, er betydningen av denne teknikk ligger i enkelheten i systemet og kostnadseffektivitet, som lett kan anvendes på enhver form for screening ciliær motilitet ex vivo. Spesielt gir TI Workbench et enkelt og brukervennlig grensesnitt som gjør det mulig for forskere å observere og analysere ciliær motilitet lettere. Effektive automatiske sporingsmetoder er ikke utviklet for objekter med lav kontrast som unstained flimmerhårene i video-forsterket kontrast-DIC. Selv om metoden for å spore ciliary bevegelse er manuell i denne teknikken, er hvor mye innsats i ciliær bevegelsessporing analyse optimalt redusert i forhold til bruk av generelle formål programvarepakker for bildeanalyse.

Prøve disseksjon

For å forberede ex CPEC vivo prøver, rask og skånsom manipulasjoner er nødvendig for å opprettholde levedyktigheten av vev, som sikrer motilitet av cilia ex vivo. Fordi forurensning av erytrocytter utydelig innen observasjon, er skånsom men intrikate skylling av dissekert vev med fosfat saltløsning anbefales på det sterkeste. For å unngå blødning, må det utvises forsiktighet for å unngå å rive bakre årehinnen pulsåren som kan identifiseres som en fremtredende rødlig trådliknende struktur følges til lamina affixa av kolloid plexus.

Mikroskop

Et invertert mikroskop utstyrt med DIC optikk og en høy kraftoverføring lyskilde er en forutsetning for denne metoden. Fordi kvikksølv lamper er vanligvis ute av stand til ofte slå av og på, er det nødvendig med en lukker foran lampehuset. Enten en manuell eller elektrisk lukkeren kan brukes for dette formål. For å beskytte prøver og observatørens øyne from UV og IR-lys, blir optiske filtre som kreves for å tillate bare synlig lys (400-700 båndpass eller en kombinasjon av UV og IR-filter). ND filtre er også nødvendig å endre lys kraft som varierer i henhold til situasjonen: overvåking av øyet, å fokusere med et videokamera, og høyhastighets intervallopptak. Et objektiv med høy numerisk apertur er nødvendig for en høy oppløsning. Det er en viss avstand mellom toppen av dekkglass og navet på grunn av morfologien og tykkelsen av vevet. Derfor er en nedsenking i vann linse i stedet for en olje nedsenking linse foretrukket for bedre bildekvalitet. Vibrasjon isolasjon er også nødvendig å gi stabile bildestakker. Luft dumper-type bord er nyttige for dette formål, men enklere demping av mikroskopet ved å sette inn tennisballer under mikroskopet med en jevn tabell kan også fungere.

Videokamera

En CCD-kamera i stand til på least 200 bilder / sek er nødvendig for å spore bevegelsen av cilia. I løpet av det siste tiåret har CCD-kameraer med raskere bildefrekvens enn standard video rate (25-30 Hz) blir tilgjengelige på mye lavere kostnader. Kameraer i stand til å utsette kortere tider enn rammeintervall er nyttige for å redusere uskarphet på grunn av bevegelsen av cilia uten å øke mengden av data. En eksponeringstid på 0,1 ms og en 5 ms rammeintervall (200 Hz) er minimumskravene for å få ciliary bilder av CPECs med tilstrekkelig kvalitet.

Programvare

Analysen å spore bevegelsene til hver cilium er tidkrevende, spesielt når generelle formål programvarepakker for bildeanalyse brukes til å spore hver ciliary tips. Redusere trinnene gjentatte oppgaver, for eksempel mus klikke på strålespissen posisjon på skjermen, velge en meny for å registrere klikket posisjon, og klikke på en knapp for å flytte til neste bilde ramme, resulterer i en betydelig reduksjon av tid og krefter. I denne studien ble en spesiell rutine lagt til skreddersydde TI Workbench programvare. I strålesporingsmodus i TI Workbench programvaren, holder brukeren looping følgende enkle totrinnsoperasjon: flytter musepekeren til strålespissen og trykke på en piltast på tastaturet for å avansere rammen, som ikke krever å flytte musepekeren eller brukerens øyne å skifte (til menyer og knapper på skjermen) fra ciliary tips på dataskjermen. Programvaren holder styr på ciliary tippe posisjoner, viser den registrerte bane å hjelpe brukeren, og skaper en tabell over ciliær motion informasjon for videre analyse. Mest generelle formål programvare for bildeanalyse tillater programing makroer for batch prosessering av slike gjentatte oppgaver. Slike tilpasset programmering for å redusere gjentatte trinn anbefales sterkt.

Analyse av baner

Utvinning av trajectories ble utført ved hjelp av skreddersydde TI Workbench programvaren, som beskrevet ovenfor. Forholdsvis enkel analyse og bildebehandling ble også utført ved bruk av samme programvare. For montering analyser, ble banen hver ciliær tips overført til Igor Pro-programvaren. Andre avanserte analyseprogramvare som MATLAB kan også brukes for dette formål.

I denne studien, på grunn av vanskeligheter med å kategorisere baner i back-og-tilbake eller rotasjons baner, ble de baner klassifisert av øyet på en blindet måte, noe som ble bekreftet av en annen observatør, noe som resulterer i konsekvent klassifisering. Likevel ville mer matematisk strenge tiltak for å kategorisere de baner uten noen mulig vilkårlighet være å foretrekke. Ellipse montering av baner ser ut til å være ideelt, noe som kan kvantifisere omfanget av elliptisitet som størrelsesforholdet av montert ellipse () i både back-og-tilbake og roterende bevegelser. Men, Var et forsøk på å bruke fordelingen av størrelsesforholdet for å definere en terskelverdi for klassifisering ineffektiv. Beslaget ofte mislyktes for back-og-tilbake baner, parametrene ofte ikke klarte å konvergere, og konvergerte montering var tilsynelatende illusorisk. Derfor ellipse utrustning ble ikke vedtatt å automatisk kategorisere baner eller kvantifisere elliptisitet av hver bane. Beslaget ble utført for å ekstrahere det bankende retning av rotasjons flytte tips som den store aksen til ellipsen montert.

I denne studien ble AR foreslått å kvantifisere den grad at en bane avviker fra en ideell lineær back-og-tilbake bevegelse. Parameteren er forholdet mellom bredden av fordelingen vinkelrett på retningen til den vibrerende langs retningen. Verdien bør være null når banen er en rett linje, og man når banen er en sirkel, som ligner sideforholdet til ellipsen er nevnt ovenfor.

I praksis kan skaffe den AR-verdien være relativt enkelt ved å rotere bane, slik at det vibrerende retning blir parallell med x -aksen (figur 4B). Denne kvantifisering fører til betydelig forskjellige verdier for de to bevegelsesformer, noe som tyder på potensiell bruk av parameteren ikke bare å kvantifisere egenskapene til hver bane, men også i mer grundig klassifisere baner. Imidlertid bør det bemerkes at oppmalings retningen i seg selv allerede er et resultat av forskjellige monteringsfremgangsmåter for de to modi i den aktuelle metode.

Ytterligere forbedring av analysen, slik som en mer avansert passende algoritme, kan løse problemene med mulig vilkårlighet.

Et aspekt vedrørende elliptisitet av banen er at det vibrerende av hver CPEC cilium ikke kan finne sted i det plan som er strengt tatt vinkelrett på x - y

Forberedelse til SEM

Under forberedelsene til SEM observasjon, er det flere viktige punkter som sikrer kjøpet av høy kvalitet. Først må post-fiksering av osmiumtetroksid utføres nøye, inkludert pre-vask med en 10% sukroseløsning. Uten riktig fiksering av osmification prosedyren, kan de etterfølgende trinnene ikke opprettholde eller gjenopprette den tilstanden av prøvene, som fører til en lavere kvalitet av preparatet. Fordi aldehyd fiksativ blir reduksjonsmidler, eventuelt gjenværende aldehyder i prøven hemme aktiviteten av osmiumtetroksyd, en sterk oksyderende reagens. For å sikre eliminering av overflødige aldehyder i prøvene, er forsiktig vask med sukroseløsning imperativ. I tilfeller av suboptimal post-fiksering, ikke farge av prøven ikke endre seg fra brunt til svart. For det andre, må volumet av osmiumtetroksid være minst 50 ganger større enn den for prøven. Ellers kan tilstrekkelig fiksering ikke forventes. For det tredje er det viktig å unngå fullstendig tørking av prøvene, spesielt under dehydrering prosessen som anvender meget ren etanol og isoamylacetat. Tørking av prøven ødelegger de fine overflatestrukturer slik som cilia, noe som resulterer i dårlige bilder.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Required reagents
for live cell imaging
ethanol	Wako Chemicals	057-00456
Leibovitz L-15 medium	Life Technologies	11415-064
for SEM preparation
ethanol	Wako Chemicals	057-00456
Hank's balanced salt solution	Life Technologies	14170112
paraformaldehyde	Merck	1040051000
glutaraldehyde	Nacalai tesque	17003-05
isoamyl acetate	Nacalai tesque	02710-95
Molecular Sieves 4A 1/8	Wako Chemicals	130-08655	for preparation of anhydrous ethanol
phosphate buffer saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408
phosphate buffer, 0.1 M			To make 100 ml, mix 19.0 ml of 0.1 M NaH2PO4 and 81.0 ml of 0.1 M Na2HPO4
monosodium phosphate (dihydrate)	Nacalai tesque	31718-15
disodium phosphate (anhydrous)	Nacalai tesque	31801-05
suclose	Nacalai tesque	30406-25
osmium tetroxide	Nisshin EM	300
dry ice

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tools and materials for dissection
for both live imaging and SEM preparation
stereo microscope	Olympus	SZX7
flat paper towel
Φ10 cm plastic dish
100 ml beaker
straight operating scissors	Sansyo	S-2B
watchmaker forceps	Dumont	No.DU-3 or -4, INOX
for live cell imaging
glass bottom dish	Matsunami Glass	D110300
for SEM preparation
alminum foil
5 ml glass vial with a polyethylene cap	Nichiden Rika-Glass	PS-5A
transfer pipette	Samco Scientific	SM251-1S	for specimen tranfer
toothpick			for specimen transfer
ion sputter with gold-palladium	Hitachi	E-1030
critical point dryer	Hitachi	HCP-2

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopic equipment and materials
for live cell imaging
inverted microscope	Olympus	IX81
100 W mercury lump housing and power supply	Olympus	U-ULH and BH2-RFL-T3
100 W mercury lamp	Ushio	USH103D
DIC condenser, n.a. 0.55	Olympus	IX-LWUCD
electrrical shutter	Vincent Associates	VS35S22M1R3-24 and VMM-D1	manual shutter can be used.
band-pass filter (400-700 nm, Φ45 mm)	Koshin Kagaku	C10-110621-1
ND filter (Φ45 mm)	Olympus	45ND6, 45ND25	combination of 25% and 6% ND filters are used
objective lens (water immersion) with DIC element	Olympus	UApo 40XW/340, n.a., 1.15 with IX-DPAO40
high-speed video camera	Allied Vision Technologies	GE680	≥200 Hz frame rate and 1 msec expose time
image acquisition / analysis software	in-hous software	TI Workbench	capable of acquisition at high frame rates.
PC for camera control / analysis	Apple	Mac Pro
vibration isolation table	Meiritsu Seiki	AD0806
weight for tissue	Warner Instruments	slice anchor kits	It can be made with nylon mesh glued to a U-shape squashed Φ0.5 mm platinum wire.
cover glass (alternative weight for tissue)	Matsunami	made-to-order	A cover glass can be used as a tissue weight.
for SEM
inverted microscope	Olympus	IX81
scanning electron microscope	JEOL	JSM-6510