Protocol
Os protocolos e uso de animais de laboratório foram aprovados pelos cuidados com os animais e uso comitês institucionais da Universidade de Yamanashi e Universidade de Waseda. Cuidados com os animais foi realizada de acordo com as diretrizes institucionais.
1. Preparação CPEC
- Preparar os seguintes aparelhos e materiais: um microscópio estéreo, de um modo preferido capaz de transmitir luz a partir do fundo; um par de fórceps Dumont relojoeiro (# 3 ou # 4), esterilizada por chama, tesouras operacionais em linha reta, esterilizada por chama; dois pratos de 10 centímetros de plástico estéreis contendo 20 ml de gelo-frio Leibovitz L-15 de forma; Pratos com fundo de vidro 35 milímetros contendo 2 ml RT Leibovitz meio L-15; Num copo de 100 ml contendo 70% de etanol; filhotes de rato recém-nascidos.
- Resumidamente mergulhe um rato neonatal em 70% de etanol e eutanásia rapidamente por decapitação usando a tesoura operacionais.
- Coloque a cabeça imediatamente em gelo frio Leibovitz L-15, na forma estéril 10 centímetros dish.
- Remover a pele dos calvária usando o par de pinças de relojoeiro, abriu o crânio para expor o cérebro, e depois cortar os nervos cranianos para isolar todo o cérebro.
- Transferir o cérebro para uma nova placa contendo gelada Leibovitz L-15 médio e observar ao microscópio estéreo, certificando-se que o cérebro está completamente imerso no meio.
- Defina o aspecto dorsal do cérebro voltado para cima, e orientar o cérebro para que os bulbos olfatórios residir na posição de três horas (para pessoas destras). Segure o cérebro suavemente com a pinça na mão esquerda.
- Usando a pinça de dissecação fina (Dumont # 3 ou # 4) na mão direita, corte do corpo caloso e debaixo do parênquima conectando os hemisférios cerebrais, ao longo da fissura longitudinal do cérebro.
- Com cuidado, empurre os hemisférios cerebrais longe para os lados laterais e expor a fissura transversa do cérebro.
- Separe os hemisférios por beliscar fora the parênquima entre o hemisfério e tálamo.
- Retire cuidadosamente o plexo coróide ventriculares laterais que é anexado para o lado lateral do hipocampo pelo Affixa lâmina.
- Transferir o plexo coróide isoladas para o prato fundo de vidro 35 milímetros contendo fresco Leibovitz meio L-15, e sobrepor o peso máximo (Lista de Materiais) com cuidado para segurar o tecido no lugar.
2. Imagens ao vivo da CPEC Cilia
- Confirmar ultravioleta adequada (UV) e filtro (s) inferida (IR) de corte para bloquear luz inferior a 400 nm e acima de 700 nm, e que a densidade neutro (ND) os filtros (25% e 6%), são inseridos no caminho da luz do microscópio invertido.
- Ajuste o foco da lente objetiva aproximadamente por olho, e então ajustar o condensador de modo que o centro e foco para estar de acordo com a iluminação Köhler. Inserir um contraste de interferência diferencial adequado (DIC) prisma, um elemento DIC, bem como elementos do analisador e polarizador na licaminho lutar para estar de acordo com a ótica DIC.
- Ajustar o contraste de vista pela posição do prisma DIC modo que a estrutura da superfície do tecido é mais reconhecível. Se todos os cílios das células alvo são móveis, uma visão clara dos cílios móveis não podem ser obtidos por olho por causa do seu movimento.
- Altere o caminho de luz para a câmera de vídeo e remova os filtros ND para aumentar o poder de luz.
- Use a câmera no modo de focagem para ajustar o campo de visão e foco. Durante focagem, em que as imagens de vídeo são exibidas em tempo real no monitor, uma visão clara dos cílios móveis não está disponível.
- Use a câmera em 200 Hz com um tempo de exposição de 0,1 ms para o período desejado (segundos a minutos). Após a aquisição da pilha de imagens, quadros únicos irá exibir estruturas ciliares claras. Se bordas ciliares são borradas, aumentar a taxa de quadros ou use um tempo de exposição mais curto.
- Grave o movimento de CPEC cílios dentro de 25-60 minutos após a eutanásia em LeibovitzMeio L-15.
3. Análise do Movimento ciliar
- Controlar manualmente batendo padrões de cada cílio no monitor do computador. Marcar posições de ponta ciliar em cada quadro com o ponteiro do mouse, que são montados para informação trajetória de cada cílio. Ou analisar a informação trajetória utilizando o mesmo software ou exportar para outras aplicações mais gerais para uma análise mais aprofundada. A eficiência deste passo de análise é descrito na discussão.
- Classifique as trajetórias em dois modos de movimento, volta-e-vem de rotação, ou por olho.
- Calcula-se a frequência de batimento ciliar (CBF), utilizando a seguinte fórmula: [CBF = (número de quadros por segundo) / (número médio de imagens para um único batimento)] 14, que pode ser obtido a partir de um diagrama de ponta movimento ciliar (Figura 3 ). Repetir este cálculo para múltiplos ciclos de batimento ciliar, porque outra cílios na mesma célula pode interferir com o movimento de cada cilium, resultando em irregularidade.
- Para analisar a uniformidade angular do batimento ciliar eixos dentro de uma única célula, definem o ângulo θ batida para cada trajectória (Figura 4). Para trajetórias de vai-e-vem, se encaixam as posições da ponta dos cílios para uma linha reta, e definir θ como o ângulo da linha faz com eixo x. Para trajectórias de rotação, encaixam as posições de uma elipse, e definir θ como o ângulo do eixo maior da elipse faz com eixo x. Detalhes da instalação são descritos na secção de resultados representativos.
- Para obter uma descrição quantitativa de cada trajetória, calcular generalizada proporção AR. Resumidamente, rodar a trajectória por - θ e definir AR como a relação entre as larguras da distribuição ao longo - x e y -axes (Figura 4B). Detalhes são mostrados na seção Resultados Representante, ea interpretação, Significado ea limitação do parâmetro são descritos na discussão.
4. Preparação de Amostras para SEM
Nota: SEM é um importante método para avaliar o estado dos cílios em CPECs de uma forma abrangente. Para preparar as amostras para SEM, um procedimento padrão reportada anteriormente 15 é empregue com ligeiras modificações.
- Antes de dissecação do tecido a partir do cérebro, preparar o fixador em um frasco de vidro de 5 ml com uma tampa de polietileno. O fixador é constituído por 2% de paraformaldeído, glutaraldeído a 2,5% (metade da solução de Karnovsky 16) em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4.
- Dissecar o tecido do cérebro, tal como descrito no passo 1.
- Resumidamente enxaguar o tecido isolado com solução salina equilibrada de Hank (HBSS) numa nova placa e, em seguida, fixar o tecido no fixador no frasco de vidro, durante 1 h à temperatura ambiente. Use pipetas de transferência descartáveis e manipular os espécimes gently. Depois de enxaguar em HBSS, o tecido torna-se pegajosa.
- Para transferir as amostras para a solução fixadora, lentamente expulsar uma pequena quantidade de solução que continha o tecido a partir da pipeta de transferência como uma gota e adicionar ao fixador.
- Após a fixação, descartar o fixador e lavar o tecido com tampão fosfato de três vezes.
- Mergulha-se o tecido numa solução de sacarose a 10% para lavar os aldeídos restantes. Para assegurar a eliminação total de aldeídos, imergir as amostras na solução durante 10 min e, em seguida, repetir duas vezes com sacarose a 10% fresco. Este passo é importante para garantir a boa pós-fixação em etapas subseqüentes.
- Mergulha-se o tecido numa solução de 1% de tetróxido de ósmio em tampão de fosfato durante 30 min e, em seguida, colocar em gelo para pós-fixação. Julgar o grau de osmification pela cor da amostra: quando os aldeídos são completamente removidas, a amostra é preto.
- Lave as amostras pós-fixadas de tecido extensivamente com duplo Distilled água várias vezes.
- Desidratar as amostras por imersão em concentrações graduadas de etanol, geralmente 65%, 75%, 85%, 95%, 99%, e 100%, durante 10 min cada. Obtenção de etanol anidro, colocando peneiras moleculares em etanol 99,5% de uma garrafa recém-adquirido. Repita desidratação com etanol anidro três vezes.
- Coloque as amostras desidratadas em acetato de isoamilo, um reagente para a substituição ponto crítico de secagem, durante 10 min. Repita esta etapa duas vezes. Este reagente e evapora-se rapidamente a amostra pode tornar-se seca, resultando na destruição pela tensão superficial. Portanto, não secar a amostra completamente.
- Após a última troca de acetato de isoamilo, remover a maior parte do solvente, imediatamente embrulhar o frasco de vidro aberta com uma folha de alumínio e coloque o frasco em gelo seco. Utilizando uma agulha ou uma pinça fina, fazer vários orifícios na folha que cobre a boca do frasco, de modo que o dióxido de carbono líquido flui facilmente para dentro do frasco no secador de ponto crítico. Prossiga para a próxima etapao mais rápido possível.
- Nesta etapa, minimizar a transição de acetato de isoamilo na câmara do secador, mas não deixe que a amostra secar completamente antes de secar ponto crítico. Além disso, não deixe a amostra em gelo seco para um desnecessariamente muito tempo para evitar a formação de geada no frasco.
- Transferir os frascos de vidro envolto com folha de alumínio contendo as amostras de tecido em secador de ponto crítico a que assegura a estrutura da superfície do tecido permanece intacta, enquanto a remoção da água contida no tecido. Informações pormenorizadas sobre a operação do secador de ponto crítico pode ser obtido a partir de instruções do fabricante.
- Lidar com as amostras cuidadosamente usando um palito para minimizar danos mecânicos. As amostras de tecidos secos resultantes são frágeis. Monte as amostras em bases metálicas e revestimento com ouro-paládio usando uma pulverização catódica de íons.
5. Observação por SEM
- Observe por SEM e gravar imagens com uma câmera digitalequipado com microscópio eletrônico de varredura.
- Transferir os dados de imagem digitais para um PC para análise.
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Representative Results
Uma visão geral do fluxo de trabalho é mostrado na Figura 1, incluindo imagens dos dispositivos.
Observações de movimento ao vivo de CPECs
Filme 1 mostra um filme de CPECs isoladas de um rato perinatal, e Filme 2 mostra uma visão expandida das imagens em filme 1. Deve-se notar que as pontas ciliares individuais são menos claras nas imagens fixas comparados com os dos filmes. A Figura 2 mostra acompanhamento do movimento de dois cílios com diferentes modos de movimento, volta-e-vem e movimentos rotacionais, a partir dos dados mostrados em Filmes 1 e 2. A Figura 3 mostra uma simples análise das trajetórias dos cílios, em que a diferença de fase nas duas coordenadas é óbvio no movimento rotacional.
Análise de CPEC trajectórias ponta ciliar
De métodos de cauda para analisar quantitativamente cada trajectória são mostrados na Figura 4, com ilustrações esquemáticas de definições do ângulo batimento θ (A) e um diagrama de fluxo da análise com resultados representativos (B).
Para definir o ângulo θ surra por trajetórias de vai-e-vem, se encaixam as posições da ponta ciliar durante vários ciclos a uma linha reta y = ax + b, e definir a direção surra como que ao longo da linha equipada. Definir o ângulo surra aqui como θ = Arc tan um. Devido linha de montagem muitas vezes não consegue extrair o sentido, em casos de movimento de rotação, encaixam as trajectórias de rotação para uma elipse, e definir a direcção a que ao longo do eixo maior da elipse equipada. Mais precisamente, as posições da ponta (x, y) durante vários ciclos de batimento está equipado para a função abaixo.
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Onde 
O encaixe elipse envolve cinco parâmetros de ajuste: x 0, y 0, a, b, e θ. As coordenadas x e - -spatial y do centro da elipse são x 0 e y 0, respectivamente. Os raios maior e menor da elipse são a e b, respectivamente. Θ ângulo é o ângulo que o eixo maior faz com o eixo x, ou o ângulo de bater. Uma representação esquemática destes parâmetros é apresentado no painel da direita da Figura 4A. A montagem é realizada utilizando o software Igor Pro definindo a função explícita descrito acima. Em seguida, um histograma de bater ângulo θ para todos os cílios observard na mesma célula é representada como um histograma circular (Figura 2 em Narita et al. 8). A frequência é normalizada para o número de pontas ciliares analisados. Deve notar-se que cada cílio é interpretado a ter dois valores θ no histograma circular, por exemplo π / 4 e 3π / 4, levando à distribuição simétrica da direcção.
Para definir generalizada relação de aspecto AR, as posições da ponta ciliar durante múltiplos ciclos são rodados por - θ (Figura 4B). De acordo com a rotação, tanto para trás e para a frente e trajectórias de rotação ser distribuídas aproximadamente paralelo ao eixo x, em que as larguras de distribuição, A e B ao longo da xey eixos, respectivamente, são definidos como metade a diferença entre o valor mínimo e máximo. Por isso, estes parâmetros são mais relevantes para a maior e menor raios da elipse, a e b. AR é então definido como a razão entre A e B por AR = B / A.
Observações de plexo coróide epitélio por SEM
SEM permite a observação da estrutura de superfície fina de espécimes. A presença de cílios em CPECs é confirmado ao longo do decurso de tempo do desenvolvimento. O surgimento de cílios múltipla em CPECs é observado por dia embrionário (E) 13, logo após o desenvolvimento do plexo coróide começa nos ventrículos laterais ao redor E11. Nesse estágio, as células são pequenas, com uma aparência imatura variável, e as pontas ciliares estão apontando para várias direções. Em E15, um tufo de cílios múltipla é estabelecida na parte superior da superfície apical, que estão em pé para fora a partir das microvilosidades circundantes. No dia pós-natal (P) 2, muitos cílios são fixos numa posição dobrada, o que reflecte a motilidade ciliar observada por imagiologia vivo. Em P14, a maioria das células possuem múltiplos cílios que são não-móveis, bem como microvilosidades w om uma textura mais fina em comparação com as fases anteriores. A Figura 5 mostra as imagens MEV de CPECs com cílios nestas etapas. Com base nos filmes mostrados na Figura 1 e um filme, é óbvio que os cílios móveis são facilmente reconhecidos por imagens ao vivo. No entanto, é difícil distinguir os cílios não-móveis por microscopia DIC. Consequentemente, SEM é indispensável para compreender os estados ciliares globais.
Figura 1:. Visão geral do fluxo de trabalho (a) microscópio estéreo. (B) microscópio invertido equipado com uma câmera dispositivo de carga acoplada (CCD). (C) O ecrã de computador durante a análise. (D) por crepitação de iões. (E) Specimen para SEM. Microscópio eletrônico (f) Scanning.
Filme 1.pload / 52991 / "target =" _ blank Figure_2.mov "> Filme da vista superior de CPECs e os cílios de um filhote de cachorro do mouse P2 em microscopia de vídeo de alta velocidade. Devido à superfície irregular do tecido do plexo coróide, esse instantâneo contém . tanto em foco e fora de foco aviões A área na caixa é expandido e mostrado no Movie 2 Barra de escala:. 2 um.
Filme 2. Filme da visão ampliada da amostra de tecido em um filme. batendo os cílios apresentaram movimentos rotacionais quer ou back-e-vem. Barra de escala: 1 um.
Figura 2: (A) Cilia com o movimento de vai-e-vem (em cima) e movimento de rotação (em baixo) Reconstituição da trajetória de CPEC cílios a partir das imagens de lapso de tempo em Filme 2.. DIC imagens a partir dos dados de filmes são apresentados em 50 ms intervalos (1-8, barra de escala: 1 m). A posição da ponta da ciliar alvo é indicado por uma ponta de seta. (B), as trajectórias (linha tracejada) e posições de dicas ciliares (círculos coloridos) mostrados nas imagens são sobrepostas.
Figura 3:. Dois modos de movimento CPEC ponta ciliar reconstituídas a partir de dados do filme movimentos ponta ciliar representativos, o movimento de vai-e-vem (A) e movimento de rotação (B), ao longo de vários ciclos são apresentados como trajetórias (topo, barras de escala: 0,5 m). Os períodos de coordenadas x e y da posição da ponta são representados, respectivamente (meio). Para demonstrar uma fase de mudança entre as duas coordenadas, coordenadas x e y foram normalizados para [-1,1] eo revestiu (parte inferior, linhas vermelhas e azuis, respectivamente).
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Figura 4: ilustrações esquemáticos que descrevem a análise das trajetórias ponta ciliares (A) Definições do ângulo θ bater para trás e para a frente (painel esquerdo) e rotacional (painel direito) trajetórias.. Os parâmetros da fórmula que descrevem a elipse equipada, a, b, x 0, y 0 e, estão apresentados no painel da direita. (B) Fluxograma da análise apropriada das trajetórias para definir o ângulo θ espancamento e AR. Os resultados reais da montagem das trajectórias representativas são apresentadas nos painéis direitos.
Figura 5: Imagem SEM de cílios. Micrografias SEM representativos de CPECs na E13, E15, P2 e P14. Durante o decorrer do tempo, CPECs aumentado de tamanho, e desenvolveu microvilli e cílios na superfície apical. Um tufo de cílios em E13 ainda é a aquisição de motilidade. No P2, quando a proporção de cílios com motilidade atingido o ponto mais alto, diversos cílios dobrados são observados. No P14, cílios perder a mobilidade. Barra de escala: 5 um.
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Discussion
Perspectivas deste método
Embora a técnica aqui descrita não proporciona uma análise mais detalhada dos cílios do que os métodos previamente publicados, o significado desta técnica reside na simplicidade do sistema e relação custo-eficácia, que pode ser facilmente aplicado a qualquer tipo de rastreio de motilidade ciliar ex vivo. Em particular, TI Workbench fornece uma interface simples e fácil de usar que permite aos pesquisadores observar e analisar a motilidade ciliar mais facilmente. Métodos de rastreamento eficaz automatizado de não ter sido desenvolvido para objetos de baixo contraste, tais como cílios unstained em contraste com vídeo-DIC. Embora o método para rastrear o movimento ciliar é manual nesta técnica, a quantidade de esforço na análise de rastreamento de movimento ciliar é otimamente reduzido em comparação com o uso de pacotes de software em geral finalidade para a análise de imagens.
Dissecção Amostra
Para preparar ex amostras vivo CPEC, manipulações rápidas e suaves são necessárias para preservar a viabilidade dos tecidos, o que garante a motilidade dos cílios ex vivo. Porque a contaminação por eritrócitos desfoca o campo de observação, lavagem suave, mas intrincado do tecido dissecado com tampão fosfato salino é fortemente recomendado. Para evitar sangramento, os cuidados devem ser tomados para evitar rasgar a artéria coróide posterior que possa ser identificado como uma estrutura como fio, avermelhada proeminente aderido à lâmina Affixa do plexo colóide.
Microscópio
Um microscópio invertido equipado com óptica de DIC e uma fonte de luz de transmissão de alta potência é essencial para o presente método. Porque as lâmpadas de mercúrio são geralmente incapazes de freqüentemente ligar e desligar, um obturador em frente do compartimento da lâmpada é necessário. Ou um obturador manual ou eléctrico pode ser utilizado para este fim. Para proteger as amostras e os olhos do observador from luz UV e IV, são necessários filtros ópticos para permitir que apenas a luz visível (400-700 passa-banda ou de uma combinação de filtros UV e de corte IV). Filtros ND também são necessários para alterar a potência de luz que difere de acordo com a situação: monitoramento por olho, focalizando com uma câmera de vídeo, e de alta velocidade de gravação de lapso de tempo. Uma lente objectiva com uma abertura numérica elevada é necessária para uma elevada resolução. Há uma certa distância entre a parte superior da lamela e o ponto focal devido à morfologia e espessura do tecido. Portanto, uma lente de imersão em água, em vez de uma lente de imersão em óleo é preferido para uma melhor qualidade de imagem. Isolamento de vibração também é necessário para produzir pilhas de imagens estáveis. Mesas de ar do tipo de descarregador são úteis para este fim, mas mais simples amortecimento do microscópio através da inserção de bolas de ténis por baixo da base do microscópio com uma tabela estacionário pode também trabalhar.
Câmera de vídeo
Uma câmera CCD capaz de pelo least 200 frames / seg é necessário para controlar o movimento dos cílios. Durante a última década, câmeras CCD com taxas de quadro mais rápidas do que a taxa de vídeo padrão (25-30 Hz) tornaram-se disponíveis a custos muito mais baixos. Modelos de câmaras capazes de tempos mais curtos do que expor o intervalo de quadro são úteis para reduzir a desfocagem devida ao movimento ciliar, sem aumentar a quantidade de dados. Um tempo de exposição de 0,1 ms e um intervalo de quadro 5 ms (200 Hz) são condições mínimas para a obtenção de imagens ciliares de CPECs com qualidade suficiente.
Programas
A análise para controlar o movimento de cada cílio é demorado, especialmente quando os pacotes de software em geral finalidade de análise de imagem são usados para rastrear cada ponta ciliar. Reduzir os passos de tarefas repetidas, como clicar do mouse na posição ponta ciliar no monitor, selecionando um menu para gravar a posição clicada, e clicar em um botão para mover para o próximo quadro imagem, resulta em uma significativa redução de tempo e esforço. Neste estudo, uma rotina especial foi adicionado ao software TI Workbench feito por encomenda. No modo de rastreamento ciliar do software TI Workbench, o usuário mantém looping a seguinte operação simples de duas etapas: mover o ponteiro do mouse para a ponta ciliar e pressionando uma tecla de seta no teclado para avançar o quadro, que não necessita de mover o ponteiro do mouse ou os olhos do usuário de mudar (para menus e botões na tela do computador) a partir das dicas ciliares na tela do computador. O software controla as posições da ponta ciliares, mostra a trajetória registrada para auxiliar o usuário, e cria uma tabela de informações ciliar movimento para análise posterior. Software objetivo mais geral para análise de imagem permite macros de programação para processamento em lote de tais tarefas repetidas. Tal programação personalizada para reduzir passos repetidos é fortemente recomendado.
Análise das trajetórias
A extracção da trajectoriES foi realizada utilizando o software TI Workbench feito por medida, tal como descrito acima. Análise relativamente simples de processamento de imagem e também foram realizados usando o mesmo software. Para as análises de montagem, a trajetória de cada ponta ciliar foi transferido para Igor software Pro. Outros software de análise de ponta, tal como MATLAB também pode ser utilizado para este fim.
No estudo atual, devido à dificuldade de categorizar as trajetórias em vai-e-vem ou trajetórias de rotação, as trajetórias foram classificados pelo olho de um modo cego, que foram confirmados por outro observador, resultando em uma classificação coerente. No entanto, mais matematicamente rigorosa medidas para categorizar as trajetórias sem qualquer arbitrariedade possível seria preferível. Elipse encaixe das trajectórias parece ser ideal, o que pode quantificar a extensão da elipticidade como a razão entre a elipse equipada () tanto para trás e para a frente e os movimentos rotacionais aspecto. Porém, Uma tentativa de usar a distribuição da relação de aspecto para definir um valor de limiar para a classificação era ineficaz. A montagem muitas vezes falhou por trajetórias de vai-e-vem, os parâmetros freqüentemente falhou para convergência e na concepção convergiram foi aparentemente ilusório. Portanto, montagem elipse não foi adotada para categorizar automaticamente as trajetórias ou quantificar a elipticidade de cada trajetória. A montagem foi realizado para extrair a direcção de batimento dicas rotativamente em movimento enquanto o eixo maior da elipse equipada.
No estudo actual, AR foi proposto para quantificar a medida em que uma trajectória de desviar de uma linear ideal vai-e-vem de movimento. O parâmetro é a razão entre a largura de distribuição perpendicular à direcção de batimento para que ao longo da direcção. O valor deve ser zero quando a trajectória é uma linha recta, e uma em que a trajectória é um círculo, assemelhando-se a razão entre a elipse aspecto mencionado acima.
Na prática, a obtenção do valor de AR pode ser relativamente fácil através da rotação da trajectória, de modo que se torna a direcção paralela à batida eixo x (Figura 4B). Esta quantificação conduz a valores significativamente diferentes para os dois modos de movimento, o que sugere o uso potencial do parâmetro não só para quantificar as características de cada percurso, mas também para qualificar mais rigorosamente as trajectórias. No entanto, deve notar-se que a própria direcção batida já é o resultado de processos de montagem diferentes para os dois modos no método actual.
Uma nova melhoria da análise, tal como um algoritmo de ajuste mais avançada, pode resolver os problemas de possível arbitrariedade.
Um aspecto sobre a elipticidade da trajetória é que a batida de cada cílio CPEC não pode estar ocorrendo no plano estritamente perpendicular ao X - Y
Preparação para SEM
Durante a preparação para a observação SEM, há vários pontos importantes que garantem a aquisição de imagens de alta qualidade. Em primeiro lugar, a pós-fixação por tetróxido de ósmio deve ser realizada cuidadosamente, incluindo pré-lavagem com uma solução de sacarose a 10%. Sem fixação adequada pelo procedimento osmification, os passos subsequentes não podem manter ou restaurar a condição de os espécimes, levando a uma diminuição da qualidade da preparação. Porque fixadores aldeído são agentes redutores, quaisquer aldeídos permanecendo dentro da amostra inibem a actividade de tetróxido de ósmio, um reagente de oxidação forte. Para assegurar a eliminação de aldeídos supérfluos em amostras, lavagem cuidadosa com a solução de sacarose é um imperativo. Em casos de po subóptimar-fixação, a cor da amostra não muda de castanho para preto. Em segundo lugar, o volume de tetróxido de ósmio deve ser pelo menos 50 vezes maior do que a da amostra. Caso contrário, a fixação suficiente não se pode esperar. Em terceiro lugar, é importante para evitar a secagem completa das amostras, em particular durante o processo de desidratação, que emprega etanol altamente puro e acetato de isoamilo. A secagem da amostra destrói as estruturas superficiais finos, tais como cílios, resultando em imagens pobres.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes. Este trabalho tem como objetivo relatar metodologia detalhada para observar a motilidade ciliar em tecidos isolados do plexo coróide. Novidades científicas têm sido relatados em estudos anteriores 1,8.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Required reagents | |||
| for live cell imaging | |||
| ethanol | Wako Chemicals | 057-00456 | |
| Leibovitz L-15 medium | Life Technologies | 11415-064 | |
| for SEM preparation | |||
| ethanol | Wako Chemicals | 057-00456 | |
| Hank's balanced salt solution | Life Technologies | 14170112 | |
| paraformaldehyde | Merck | 1040051000 | |
| glutaraldehyde | Nacalai tesque | 17003-05 | |
| isoamyl acetate | Nacalai tesque | 02710-95 | |
| Molecular Sieves 4A 1/8 | Wako Chemicals | 130-08655 | for preparation of anhydrous ethanol |
| phosphate buffer saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| phosphate buffer, 0.1 M | To make 100 ml, mix 19.0 ml of 0.1 M NaH2PO4 and 81.0 ml of 0.1 M Na2HPO4 | ||
| monosodium phosphate (dihydrate) | Nacalai tesque | 31718-15 | |
| disodium phosphate (anhydrous) | Nacalai tesque | 31801-05 | |
| suclose | Nacalai tesque | 30406-25 | |
| osmium tetroxide | Nisshin EM | 300 | |
| dry ice | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools and materials for dissection | |||
| for both live imaging and SEM preparation | |||
| stereo microscope | Olympus | SZX7 | |
| flat paper towel | |||
| Φ10 cm plastic dish | |||
| 100 ml beaker | |||
| straight operating scissors | Sansyo | S-2B | |
| watchmaker forceps | Dumont | No.DU-3 or -4, INOX | |
| for live cell imaging | |||
| glass bottom dish | Matsunami Glass | D110300 | |
| for SEM preparation | |||
| alminum foil | |||
| 5 ml glass vial with a polyethylene cap | Nichiden Rika-Glass | PS-5A | |
| transfer pipette | Samco Scientific | SM251-1S | for specimen tranfer |
| toothpick | for specimen transfer | ||
| ion sputter with gold-palladium | Hitachi | E-1030 | |
| critical point dryer | Hitachi | HCP-2 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopic equipment and materials | |||
| for live cell imaging | |||
| inverted microscope | Olympus | IX81 | |
| 100 W mercury lump housing and power supply | Olympus | U-ULH and BH2-RFL-T3 | |
| 100 W mercury lamp | Ushio | USH103D | |
| DIC condenser, n.a. 0.55 | Olympus | IX-LWUCD | |
| electrrical shutter | Vincent Associates | VS35S22M1R3-24 and VMM-D1 | manual shutter can be used. |
| band-pass filter (400-700 nm, Φ45 mm) | Koshin Kagaku | C10-110621-1 | |
| ND filter (Φ45 mm) | Olympus | 45ND6, 45ND25 | combination of 25% and 6% ND filters are used |
| objective lens (water immersion) with DIC element | Olympus | UApo 40XW/340, n.a., 1.15 with IX-DPAO40 | |
| high-speed video camera | Allied Vision Technologies | GE680 | ≥200 Hz frame rate and 1 msec expose time |
| image acquisition / analysis software | in-hous software | TI Workbench | capable of acquisition at high frame rates. |
| PC for camera control / analysis | Apple | Mac Pro | |
| vibration isolation table | Meiritsu Seiki | AD0806 | |
| weight for tissue | Warner Instruments | slice anchor kits | It can be made with nylon mesh glued to a U-shape squashed Φ0.5 mm platinum wire. |
| cover glass (alternative weight for tissue) | Matsunami | made-to-order | A cover glass can be used as a tissue weight. |
| for SEM | |||
| inverted microscope | Olympus | IX81 | |
| scanning electron microscope | JEOL | JSM-6510 | |
References
- Nonami, Y., Narita, K., Nakamura, H., Inoue, T., Takeda, S. Developmental changes in ciliary motility on choroid plexus epithelial cells during the perinatal period. Cytoskeleton. 70 (12), 797-803 (2013).
- Bisgrove, B. W., Yost, H. J. The roles of cilia in developmental disorders and disease. Development. 133 (21), 4131-4143 (2006).
- Fliegauf, M., Benzing, T., Omran, H. When cilia go bad: cilia defects and ciliopathies. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (11), 880-893 (2007).
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