Protocol
Alle dyreforsøg er blevet godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg.
1. Mus Forberedelse
- Brug mus i ~ 20 g i kropsvægt eller over ~ 6 uger i alderen for kirurgi.
- Før indgrebet, giver en mus laboratoriefoder og vand ad libitum og ajourfører på et 00:12 timers lys-mørke-cyklus.
- Barbere det kirurgiske område med en hårklipper. Bedøver mus ved intraperitoneal injektion af 80 mg / kg ketamin og 12 mg / kg xylazin. Denne dosis sætter mus i søvn i et par minutter og giver tilstrækkelige anæstesi for følgende kirurgiske procedurer.
- Bekræft ordentlig bedøvelse baseret på fraværet af hornhinde refleks og lemmer tilbagetrækning når trædepuden er klemt. Anvend smørende oftalmologiske salve på øjnene for at forhindre tørhed.
- Sterilisere huden med betadinopløsning.
2. gastrisk refluks Model (figur 1B)
- Lav en øvremidtliniesnit på ~ 2 cm startende fra xiphoid peger på anus.
- Åbne op bughulen gennem midterlinjen. Fjern formet som et sværd til at øge eksponeringen med en saks.
- Separat og skæres bindevævet mellem leveren og maven. Ligere og skære fartøjet bundt mellem milt og fundus med henblik på helt frigøre fundus.
- Drej fundus lidt til venstre og udsætte den venstre side af gastroøsofageal krydset i marken. Foretag en 5 mm længdesnit på musklen langs den distale esophagus ved hjælp af en skarp saks for at blotlægge epitel.
- Skar epithelet langs samme retning (snit 1, figur 1B). Lav tre indsnit på formaven (indsnit 2, 3 og 4, figur 1B) at afskære de fleste af formaven med skarpe drift saks. Hvis maven ikke er tom, forsigtigt fjerne maveindhold.
- Placer en 8-0 prolene Suture (med en tilspidsning punkt nål) gennem punkt en (på spiserøret), og punkt et "(på formaven) med præcis slimhinde til mucosale opposition. Ligeledes sted suturer gennem punkt b og punkt b ', og andre par af punkter, hhv. Jævnt plads disse suturer 3-4 mm fra hinanden.
- Vaske bughulen med normalt saltvand til at rense blodet og maveindhold. Luk bugvæggen med silkesuturer og huden med metalclips.
3. Blandet reflux Model (figur 1C)
- Følg trin 2.1 til 2.4 for at eksponere gastroøsofageal krydset.
- Forsigtigt adskille den dorsale side af spiserøret fra blodkarrene bag spiserøret. Pass en lille vatpind mellem spiserøret og blodkar.
Bemærk: Bomuld kan være delvist fjernes fra spidsen for at reducere dens størrelse. Denne vatpind tjener to formål, at løfte op i spiserøret og beskytte blodkarrene. - Lav to 5 mm langsgående incmelserne hver på gastroøsofageal krydset og den proximale ende af duodenum ved siden af pylorus med skarpe drifts- saks. For snittet på tolvfingertarmen, undgå blodkar og placere på den anti-mesenterial grænse.
- Anastomose indsnit med nøjagtig slimhinde til mucosale modstand med afbrudte 8-0 prolene suturer. Normalt placerer 3-4 suturer på dorsalsiden og 2-3 suturer på forsiden.
- Fjern bomuld spids. Vaske bughulen med normalt saltvand og lukke bugvæggen og huden.
4. duodenal reflux Model (figur 1D)
- Følg trin 3,1-3,4 at generere blandet reflux.
- Løft forsigtigt maven for at blotlægge sin bagside. En lap af leveren kan være omfattet af bindevæv mellem leveren og bagsiden af maven. Skær forsigtigt bindevævet, korrekt beskytte leveren, og udsætte blodkarrene på den dorsale side af spiserøret.
- Liger ogsender blodkarrene. Ligere og skære spiserøret ved gastroøsofageal krydset.
- Ligere duodenum på pylorus. Ligere og skære mesenteriet. Fjerne hele mavesækken.
- Vaske bughulen med normalt saltvand. Luk bugvæggen og huden.
5. Post-kirurgisk behandling
- Efter operationen opretholde kroppens temperatur med en varmepude. Først efter at genvinde brystleje placere musene tilbage med andre dyr.
- Giv antibiotika og smertestillende for at forebygge infektion og lindre smerte. Injicer Baytril (10 mg / kg, ip, qd, 3 dage) for at forhindre infektion og buprenorphinhydrochlorid (0,05 mg / kg, sc, bud. I to dage) som smertestillende. Fasten er ikke nødvendig efter operationen.
Et flydende eller blød kost kan gives. - Vurdere den generelle helbredstilstand på daglige basis.If musene viser følgende tegn (dramatiske vægttab> 15%, mangel på appetite, vokalisation, udledning fra mund, næse eller øjne, foroverbøjet gestus, inaktivitet, unormal grooming aktivitet), aflive musene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De fleste mus (> 95%) kan overleve operationen. Under den perioperative periode, de førende dødsårsager omfatter overdosis af anæstesi, blødning og ukendte årsager.
Fire uger efter operationen,> 90% mus med gastrisk refluks eller blandet refluks og> 80% mus med duodenal refluks kan overleve. I denne periode, mus primært dør af esophageal striktur og manglende evne til at spise. Disse mus viser tegn på alvorlig stress (bøjet kropsholdning, inaktivitet, opkastning, indsunkne øjne, vokalisering, etc.) og skal aflives. Medicinsk behandling med antibiotika og infusion normalt kan ikke gemme disse mus fra at dø. Mus normalt mister deres kropsvægt af et par gram efter operationen, især dem med duodenal tilbagesvaling. Alligevel legemsvægt vil komme og øge senere.
Fyrre uger efter operationen, kan> 80% mus med gastrisk og blandet reflux og> 70% mus med duodenal tilbagesvaling overleve. During denne periode, kan nogle mus dø af underernæring eller ukendte årsager. Vi har holdt mus i 80 uger efter operationen. Generelt, er de stadig meget aktive og sunde 9.
Efter fire uger efter kirurgi, arkitektur esophageal epitel blive beskadiget mere eller mindre af tilbagesvaling. Under mikroskop, bliver epitelet tykkere og papilla forlænges. Hyperproliferation af epitelceller og infiltration af inflammatoriske celler (f.eks, neutrofiler, mastceller og eosinofiler) er tydelige tegn på esophagitis (figur 2). Cytokiner i esophageal epitel (f.eks IL1β, IL6 og IL8) er forhøjet specielt ved tilstedeværelse af ulcus reflux 11. Under transmission elektron mikroskop, dilateret intercellulære rum afspejler svækkelse af epitelbarriere funktion 12. Funktion-kloge, trans-epitel elektrisk modstand er faldet drastisk, især i tilstedeværelse af duodenal reflux.
Figur 1: (A) Anatomi af den øvre fordøjelseskanal i mus (forfra og fra siden); (B) gastrisk refluks (set fra siden); (C) Blandet reflux (set forfra); (D) Duodenal refluks (set forfra).
Figur 2: Histologi af muse esophageal epitel uden tilbagesvaling (A) eller med gastrisk tilbagesvaling (B), blandet tilbagesvaling (C), duodenal tilbagesvaling (D). Scale bar = 50 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er etableret forskellige kirurgiske modeller til at efterligne gastriske, duodenale og blandet reflux hos gnavere. Disse tre fremgangsmåder beskrevet her er velegnede til langvarige forsøg med rimelige priser for postoperativ overlevelse. En forsker med kirurgisk erfaring bør være i stand til at forstå teknikken efter en kort periode med praksis.
Blødning kan skyldes intraperitoneal injektion af anæstetika før operation, laceration af leveren under adskillelse af bindevævet mellem leveren og maven, og utilsigtet beskadigelse af blodkarrene. Dette bør undgås så meget som muligt. Batteridrevet mini-cautery kan anvendes til at standse blødning, hvis det er relevant. Overdreven strækning bør undgås så meget som muligt, når organer og væv er manipuleret. Spidserne af pincetten kan vikles med bomuld eller vatpind kan bruges som spisepinde at erstatte pincet. Musen spiserøret har to lag eller to & #8220, rør ", ydre rødlig" muskel rør "og indre hvidlig" epitel rør ". Når et snit er foretaget på spiserøret, skal skæres op begge lag. Suturer skal være jævnt fordelt med nøjagtige slimhinde til mucosale opposition. Lækage kan skyldes en lang afstand mellem suturerne, mens forsnævring kan udvikle på grund af en smal afstand mellem suturer. Dog kan forsnævring blokere passagen af fødevarer og forårsage postoperativ død, mens svag lækage kan fastsættes ved lokal vedhæftning og fibrøs reaktion og dermed er normalt ikke livstruende.
Der er flere kritisk generelle principper at følge i protokollen. Varigheden af kirurgi bør afkortes, hvis muligt (ca. 20-30 min i laboratoriet). Fastende før og efter operationen er unødvendig. Faktisk længerevarende faste (> 1 dag) kan være skadelig. Kirurgi er bedst udføres af en kirurg. En assistent kan hjælpe bedøver mus og levere Surggiske materialer. Et mikroskop er ikke nødvendig, medmindre kirurgen er blevet ordentligt uddannet i mikrokirurgi. Ellers varigheden af operationen tendens til at være længere end nødvendigt og dermed postoperative overlevelse kan være potentielt værre.
Disse procedurer er blevet anvendt i tidligere udgivelser, og har genereret et tilfredsstillende resultat. Anvendelse af vildtype og genetisk modificerede mus, demonstrerede vi, at NFKB og Nrf2 veje reguleret barrierefunktion esophageal epitel under gastroøsofageal refluks 11,12. Men vi var ikke i stand til at producere altfavnende Barretts øsofagus eller adenokarcinom i disse mus i stedet spredt mucinøse celler og pladecellekræft blev induceret 9. Histologiske forskelle mellem mus spiserøret og menneskelig spiserøret kan være iboende begrænsninger ved disse kirurgiske modeller i forskning i Barretts øsofagus og esophageal adenocarcinom.
Vi mener, at disse surgical modeller er nyttige til undersøgelser af GERD. Funktioner af gener og molekylære veje kan belyses at forstå de molekylære mekanismer i GERD og udvikle mekanisme-baseret behandling. Når de anvendes til fremstilling af Barretts øsofagus og esophageal adenocarcinom, vil være behov for genetiske modifikationer i kombination med tilbagesvaling kirurgi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #1 Forceps Dumostar Tip | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Bonn Scissors 3.5" Straight 15 mm Sharp/Sharp Tungsten Carbide Blades | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Operating Scissors 5.5" Straight Sharp/Sharp SureCut | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| 4-0 Silk Black Braid 100 Yard Spool | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Surgeon's Needle 1/2 Circle Cutting Edge Size 12 (25 mm Chord Length) Pack 12 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Halsey Needle Holder 5" Smooth | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Micro Needle Holder 5.125" Curved Lock .6 mm | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Reflex 9 mm Wound Clip Applier | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Reflex 9 mm Wound Clips Box Of 100 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| PRONOVA Poly (hexafluoropropylene-VDF) Suture 8-0 | Ethicon US, LLC | ||
| Ringer's solution | Henry Schein, Inc. | ||
| ketamine | Henry Schein, Inc. | ||
| xylazine | Henry Schein, Inc. |
References
- Kandulski, A., Malfertheiner, P. Gastroesophageal reflux disease--from reflux episodes to mucosal inflammation. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9 (1), 15-22 (2012).
- Orlando, R. C. The integrity of the esophageal mucosa. Balance between offensive and defensive mechanisms. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 24 (6), 873-882 (2010).
- Stairs, D. B., Kong, J., Lynch, J. P. Cdx genes, inflammation, and the pathogenesis of intestinal metaplasia. Prog Mol Biol Transl Sci. 96, 231-270 (2010).
- Spechler, S. J., Fitzgerald, R. C., Prasad, G. A., History Wang, K. K. molecular mechanisms, and endoscopic treatment of Barrett's esophagus. Gastroenterology. 138 (3), 854-869 (2010).
- Fang, Y., et al. Cellular origins and molecular mechanisms of Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma. Ann N Y Acad Sci. 1300, 187-199 (2013).
- Garman, K. S., Orlando, R. C., Chen, X. Review: Experimental models for Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (11), G1231-G1243 (2012).
- Baruah, A., et al. Translational research on Barrett's esophagus. Ann N Y Acad Sci. 1325, 170-186 (2014).
- Lechpammer, M., et al. Flavopiridol reduces malignant transformation of the esophageal mucosa in p27 knockout mice. Oncogene. 24 (10), 1683-1688 (2005).
- Hao, J., Liu, B., Yang, C. S., Chen, X. Gastroesophageal reflux leads to esophageal cancer in a surgical model with mice. BMC Gastroenterol. 9, 59 (2009).
- Mari, L., et al. A pSMAD/CDX2 complex is essential for the intestinalization of epithelial metaplasia. Cell Rep. 7 (4), 1197-1210 (2014).
- Fang, Y., et al. Gastroesophageal reflux activates the NF-kappaB pathway and impairs esophageal barrier function in mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (1), G58-G65 (2013).
- Chen, H., et al. Nrf2 deficiency impairs the barrier function of mouse oesophageal epithelium. Gut. 63 (5), 711-719 (2014).
