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Medicine

Orthotopique Implantation et périphérique des cellules immunitaires surveillance dans le modèle II-45 Syngénique Rat mésothéliome

doi: 10.3791/53019 Published: October 2, 2015

Summary

La génération d'un modèle de rat orthotopique du mésothéliome pleural malin par implantation des II-45 cellules de mésothéliome dans la cavité pleurale de rats immunitaires compétentes est présentée. Un procédé de cytométrie de flux pour analyser les sept sous-ensembles de cellules immunitaires chez ces animaux à partir d'un échantillon de sang 25 ul est également décrit.

Abstract

L'énorme regain d'intérêt dans les traitements à base immunitaire contre le cancer tels que les vaccins et les inhibiteurs de point de contrôle immunitaire, et une meilleure compréhension du rôle du microenvironnement de la tumeur dans la réponse au traitement, pointez sur la nécessité pour les modèles orthotopiques immunitaire compétentes pour les essais pré-cliniques collectivement de ces nouvelles thérapies. Cet article montre comment établir un modèle de rat immunitaire compétent orthotopique du mésothéliome pleural malin. Suivi progression de la maladie dans des modèles orthotopiques se confond interne par l'emplacement des tumeurs. Pour surveiller longitudinalement progression de la maladie et ses effets sur cellules immunitaires circulantes dans ce domaine et d'autres modèles de rats de cancer, un seul tube cytométrie de flux dosage ne nécessitant que 25 ul de sang entier est décrite. Ceci permet d'obtenir une quantification précise de sept paramètres immunitaires: les lymphocytes totaux, monocytes et neutrophiles, ainsi que les sous-ensembles de cellules T CD4 et CD8, les cellules B et les cellules tueuses naturelles. Différents sous-marinsets de ces paramètres sont utiles dans des circonstances et des modèles différents, avec le rapport des neutrophiles à des lymphocytes ayant la plus grande utilité pour le suivi de progression de la maladie dans le modèle de mésothéliome. Analyser les taux circulants de cellules immunitaires en utilisant cette méthode de tube unique peut également aider à surveiller la réponse aux traitements à base immunitaire et de comprendre les mécanismes sous-jacents menant à la réussite ou l'échec du traitement.

Introduction

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Le mésothéliome malin (MM) est une tumeur maligne agressive qui se pose à partir de cellules transformées dans la membrane (mésothélium) que les lignes les poumons et la cavité abdominale, le coeur et les organes génitaux internes, et est la tumeur primaire la plus fréquente de la cavité du poumon ou de la plèvre 1,2 . L'exposition aux fibres d'amiante représente 80% de tous les MM, et tandis que les interdictions sur utilisation de l'amiante ont été introduits il ya plusieurs décennies dans la plupart des pays occidentaux, son utilisation répandue dans la communauté a laissé un héritage mortel. L'Organisation mondiale de la santé a estimé que 107.000 personnes dans le monde meurent chaque année de maladies liées à l'amiante, avec des taux de mortalité continue d'augmenter. Une nouvelle vague d'incidence non professionnelle est également en train d'émerger et il ya peu de compréhension de quand, et à quel niveau ce sera à son maximum 3.

La majorité des gens atteints de MM sont diagnostiqués tardivement lorsque la chimiothérapie systémique représente une des seules options viables 4. Les plupart des effective chimiothérapie et de courant standard de soins "(pemetrexed association avec le cisplatine 5) a été identifié il ya plus de 10 ans. Cependant l'échec de ce traitement est inévitable et il n'y a pas des options de seconde ligne éprouvées, laissant les patients avec un pronostic sombre et la survie médiane de 12 mois seulement 2. Par conséquent, il ya un besoin non satisfait urgent de traitements plus efficaces. Malgré l'examen d'un certain nombre de nouvelles thérapies dans des essais cliniques aucune n'a abouti à des changements dans la pratique. Cela est dû en partie à la faible (5%) le transfert des résultats pré-cliniques, généralement effectuée dans des modèles de xénogreffe de souris, pour le réglage de la clinique 6-8. De tels modèles ne récapitulent pas fidèlement les aspects complexes du microenvironnement tumoral se produisant dans les zones non physiologiques, souvent en l'absence d'un système immunitaire fonctionnant 9.

Orthotopiques modèles syngéniques créent un environnement de la tumeur significativement plus réaliste que le commonly utilisé des modèles de xénogreffes sous-cutanées que les tumeurs se produisent dans l'emplacement physiologique correcte avec un système immunitaire 10,11 intacte. La grande taille du rat améliore son utilisation comme modèle de la maladie des rongeurs, en particulier dans les études sur les médicaments où le sang de série tire sont nécessaires pour évaluer la réponse au traitement et la toxicité 12. De plus, dans des modèles dans lesquels la surveillance de la maladie est la progression difficile en raison de l'emplacement des tumeurs (par exemple dans la cavité pleurale), la capacité de surveiller la progression de la maladie en utilisant des facteurs présents dans la circulation est extrêmement attrayant. La génération d'un modèle orthotopique syngénique de mésothéliome pleural en utilisant des rats immuno-compétentes est décrite. En outre, un procédé relativement simple et non invasif de surveillance de progression de la maladie en mesurant pleural cellules immunitaires circulantes est également décrite.

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Protocol

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Toutes les procédures impliquant des animaux ont été effectuées en conformité avec les recommandations du Code australien de pratiques pour le soin et l'utilisation des animaux à des fins scientifiques. Le protocole de cette étude a été approuvée par le Comité de protection des animaux et de l'hôpital Royal North Shore éthique. Femme rats Fischer 344 (F344, 150-200 g) ont été maintenus à l'installation Kearns, Kolling Institut dans des conditions standard (12 h cycles lumière / obscurité et l'accès libre à la nourriture et de l'eau).

Remarque: Un organigramme pour toutes les procédures expérimentales est présentée dans la figure 1.

1. Préparation des cellules pour implantation

  1. Le mésothéliome de rat ligne de culture II-45 cellulaire (aussi connu comme l'IL-45; dérivée par l'introduction péritonéale de l'amiante crocidolite) dans du RPMI 1640 (RPMI) médias complété avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS) et de grandir dans des conditions standard (37 ° C incubateur humidifié avec 5% de CO 2). Maintapar passage dans et sous-culture à environ 1:50 deux fois par semaine dans un flacon de 2 75 cm.
  2. Préparer les réactifs pour la culture cellulaire et des parties aliquotes chaud à 37 ° C. Réactifs nécessaires comprennent médias libres sériques RPMI (AFD), RPMI avec 10% de FBS, tampon phosphate salin (PBS) et 0,5% de trypsine-EDTA.
  3. Cellules de culture pour l'implantation à environ 70-80% de confluence. Ceci assure qu'ils sont dans la phase de croissance linéaire.
  4. Récolte des cellules en éliminant le support, lavage une fois avec 5 ml de PBS stérile, puis en ajoutant 3 ml de 0,5% de trypsine-EDTA.
  5. Flacons Retour à l'incubateur pendant environ 5 minutes jusqu'à ce que toutes les cellules deviennent non-adhérent.
  6. Une fois que les cellules sont non adhérente, ajouter 3 ml de RPMI avec 10% de FBS pour inactiver la trypsine. Recueillir et cellules de centrifugation à 300 g pendant 3 min.
  7. Laver le culot cellulaire dans 10 ml de GDF et centrifuger à 300 g pendant 3 min.
  8. Laver culot cellulaire à nouveau avec 10 ml de GDF et centrifuger comme ci-dessus.
  9. Reprendre les cellules dans 10 ml de GDF et d'effectuer un nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre ou instruments similaires.
  10. Diluer les cellules de sorte que 100 ul contient la quantité de cellules à implanter.
    Remarque: la croissance de la tumeur a été démontrée à une dose aussi faible que 100 cellules dans 100 pi, mais une dose standard est de 500.000 cellules dans 100 pi.
  11. Préparer suffisamment de cellules dans un milieu pour le nombre de rats à être implanté (par exemple, 100 ul / rat), ainsi que d'au moins 0,5 ml supplémentaire pour compenser les pertes de l'amorçage et le volume mort de l'aiguille.
  12. Préparer suffisamment de GDF (sans cellules) pour être implanté dans des rats de contrôle (par exemple, 100 pl / rat), majoré d'au moins 0,5 ml supplémentaire.
    Remarque: Les cellules et GDF sont maintenant prêts pour l'implantation. Ils doivent être maintenus à 37 o C et implantés dans les 2 heures de la récolte pour maintenir la viabilité.

2. In vivo implantation de cellules

  1. Placez le rat F344 (> 13 semaines d'âge) dans la chambre d'induction et anesthésier utilisant 1,4% inhalation isoflurane (ou la méthode en usage dans l'installation). Une fois que le rat semble être endormie mouvement à partir de la chambre à un cône de nez (avec 1,4% d'isoflurane qui coule), placez-le sur le dos, la poitrine vers le haut (vue ventrale). Ceci permet aux organes internes de régler l'écart de la cavité thoracique. Vérifiez réflexes selon les protocoles institutionnels pour assurer le rat est totalement anesthésié.
  2. Rasez la zone de droite regio costalis (poitrine) pour enlever la fourrure.
  3. Nettoyer la zone rasée avec 80% v / v d'éthanol.
  4. Identifier le site d'injection: sur le côté droit, trouver le 2ème glande crânienne départ. Le site d'injection est de 0,5 cm proximale à cela, entre la 3e et 4e côtes à partir de l'extrémité caudale de la cage thoracique. (Figure 2A).
  5. Mélanger délicatement les cellules II-45 pour remettre en suspension. Aspirez lentement la suspension de cellules (ou GDF pour les rats de contrôle) dans 1 ml &# 160; seringue sans aiguille attachée. Si une aiguille est fixée pour le dessin de cellules il y a le potentiel de se développer le long des cellules de la ligne d'injection à aiguille. Joindre une 23G x 1 ¼ needle. Premier l'aiguille et enlever les bulles d'air.
  6. Une fois la seringue et l'aiguille sont amorcées, placer à 20 mm de long et de 5 mm de diamètre entretoise sur l'arbre de l'aiguille. Ceci est utilisé pour empêcher l'aiguille de pénétrer trop profondément dans la cavité pleurale au cours de l'injection. Environ 5 mm-12 mm de l'aiguille exposée est suffisante pour la pénétration à travers les côtes sans endommager les organes.
  7. Insérer lentement l'aiguille entre les côtes, reculer sur la seringue pour assurer un vaisseau sanguin n'a pas été perforé (pas de sang devrait apparaître dans la seringue), puis injecter 100 cellules ul ou GDF. (Figure 2B).
  8. Retirez l'aiguille et rouler doucement le rat de gauche à droite pour répandre cellules dans la cavité thoracique.
  9. Placez le rat dans une cage et vérifier pour la récupération. The rat devrait être éveillé au sein de 1 min et de commencer à se déplacer.
  10. Répétez l'opération pour chaque rat en utilisant une nouvelle aiguille. Réutilisation de la même aiguille se traduira par la croissance des cellules le long de la conduite d'injection de l'aiguille.
  11. Surveiller le bien-être des animaux quotidienne.
  12. Euthanasier les animaux à extrémités éthique définis comme régi par le comité institutionnel de l'éthique animale. Les critères éthiques pour les rats dans ces expériences étaient perte de poids de plus de 10% ou la respiration difficile.

3. veine de la queue de prélèvement sanguin

  1. Si le sang doit être collecté immédiatement après l'implantation des cellules, gardez le rat anesthésié. Si l'échantillonnage de sang à un autre point de temps, anesthésier la rat en utilisant 1,4% inhalation isoflurane. Vérifiez réflexes selon les protocoles institutionnels pour assurer le rat est totalement anesthésié.
  2. Placez le rat sur le côté et localiser un veine de la queue latérale.
  3. Stériliser la queue avec 80% d'éthanol et étiqueter un 0,5 ml EDTA ctube de ollection.
  4. Pour recueillir le sang, toujours commencer à l'extrémité caudale de la queue (environ un tiers du chemin long). Ceci permet de nouvelles tentatives plus proche de l'extrémité crânienne de la queue dans le cas où la première tentative échoue. Jamais rééchantillonner caudale car cela peut causer un caillot de sang.
  5. Positionner un 23G x 1 ¼ needle parallèle à la veine latérale et faites-le glisser dans la veine à un angle faible de sorte qu'il pénètre d'environ 10 mm (figure 3A).
  6. Remarque: Si la veine a été percé avec succès le sang sera visible dans l'extrémité de fixation de l'aiguille (figure 3B).
  7. Une goutte de sang se forme sur la queue au niveau du site de la ponction de l'aiguille. Recueillir ce sang à l'aide d'une pipette et le transfert dans les étiquetées 0,5 ml (ou plus petit) tube de collecte de l'EDTA. Pour le dosage des cellules immunitaires 25 ul est suffisante. Appliquer de la gaze avec une pression à la perforation site jusqu'à ce que le saignement cesse.
  8. Flick le tube de sang de mélanger le sang et de l'EDTA à PRévénement de coagulation. Conserver le temps entre le prélèvement de sang et le mélange avec l'EDTA aussi court que possible pour empêcher la coagulation.
  9. Lors de la collecte du sang à partir de plusieurs rats magasins échantillons EDTA-sang dans un rack à température ambiante jusqu'à l'analyse. De traitement du sang dans les 2 heures de la collecte.

4. Préparation d'échantillons pour des cellules immunitaires profilage à l'aide de la méthode fondée sur la Perle

Note: Cette méthode de plate-forme unique repose sur l'utilisation des tubes de comptage absolu disponibles dans le commerce qui ont connu un certain nombre de billes pour chaque échantillon. Ces tubes contiennent des granulés lyophilisés qui se dissolvent lors de la préparation de l'échantillon, en libérant les perles. Les perles sont marquées par fluorescence et par gating sur la population de billes, les chiffres absolus peuvent être calculés.

  1. Vérifiez que le EDTA échantillon de sang entier est bien mélangé en le plaçant sur un mélangeur rotatif lente pendant plusieurs minutes. Etiqueter un tube de comptage absolu pour chaque échantillon. Un culot contenant les perles devrait être visible sous til support de bille de métal au fond du tube.
  2. Transférer 25 ul de sang entier dans un tube EDTA de comptage absolu marqué. Le culot de bille va se dissoudre lors de l'addition du sang.
  3. Pour chaque tube ajouter 20 ul d'anti-rat T / B / Natural Killer (NK) cellule cocktail, 10 pi d'anti-rat CD8a PE, 10 pi d'anti-rat CD4 (domaine 1) FITC et 10 pi d'anti-rat CD45 PE / Cy7 (figure 4A). Les fluorophores sont définis dans le Tableau 1.
  4. Centrifuger brièvement le tube (300 xg) pour assurer les anticorps et les cellules sont dans le fond du tube et non pas collées sur le côté du tube. Vortex pour mélanger et incuber pendant 15 min à température ambiante.
  5. Pour lyser les globules rouges d'ajouter 400 ul de Tris 10 mM, 0,15 M de tampon chlorure d'ammonium (pH 7,5) et vortex pour mélanger. Lyse est complète lorsque l'échantillon apparaît translucide et non trouble (figures 4B et C). Défaut de lyser l'échantillon complètement conduira à augmenterd arrière-plan et faussement élevés compte lors de l'analyse par cytométrie en flux.

5. cytométrie en flux traitement des échantillons

Remarque: Effectuez une couleur 4 cytomètre de flux.

  1. Ouvrez le logiciel en mode d'acquisition et un nouveau modèle avec 8 parcelles comme le montre la Figure 5.
  2. Réglez les paramètres de l'instrument à ceux énumérés dans le tableau 1 et mettre en place la porte R1 (FITC [FL-1] par rapport APC [FL-4]), Figure 5ai) pour compter les perles fluorescentes. Les autres portes ne sont pas aussi important à ce stade de l'acquisition, mais seront nécessaires pour l'analyse. Les perles de comptage absolu utilisé dans ce protocole contiennent des colorants fluorescents et peuvent être détectés dans un canal bien sont les plus faibles dans le canal bleu.
  3. En utilisant un échantillon de sang de commande préparée, vortex et ensuite charger sur le cytomètre et courir à une vitesse faible (12 pi / min) sur le mode de configuration afin portes d'acquisition de données peuvent être ajustés.
  4. Réglez l'acquisition derecueillir 10.000 événements dans la porte de perles R1.
  5. Mettre en place un dossier pour enregistrer les données et de définir le nombre de fichiers et l'étiquette exemple de fichier dans le menu d'acquisition.
  6. Charger l'échantillon à analyser sur le cytomètre et a fixé le taux à moyen (35 pi / min) Débit. Exécutez chaque échantillon au même débit. Le débit peut avoir besoin d'être modifiée à faible (12 pi / min) ou élevée (60 pi / min), mais moyen est généralement appropriée. A ce rythme, il faut environ 90 à 120 secondes à acquérir 10.000 événements billes pour chaque échantillon.
  7. Une fois que l'échantillon est chargé regarder les diagrammes de dispersion à faire en sorte que les événements apparaissent dans la grille de perles R1. Initialement il peut y avoir une certaine instabilité dans la pression de l'échantillon provoquant la dérive dans les diagrammes de dispersion. Attendre que ce se stabiliser.
  8. Une fois stabilisé, cliquez sur acquérir et permettre échantillon de fonctionner. Une fois que le cytomètre a terminé l'acquisition de 10.000 événements perles dans le cytomètre R1 va cesser d'acquérir et de sauvegarder toutes les données.
  9. Retirer l'échantillon et jetez écouler tuêtre. Le cytomètre est maintenant prêt pour l'échantillon suivant. Exécutez tous les échantillons et ensuite procéder au mode d'analyse.

6. immunitaire analyse cellulaire

Remarque: les stratégies de blocage et d'algèbre de Boole sont utilisés pour définir la population de chaque cellule. Algèbre booléenne est une méthode d'analyse logique sur la base qui permet plusieurs opérations sur un seul définition. Le logiciel d'analyse du cytomètre de flux (par exemple, BD CELLQuest) permet l'utilisation de l'algèbre de Boole. Les équations sont utilisés activement pour tenir compte de la réactivité négative importante qui aide dans la définition de la cellule pour identifier plus précisément chaque population de cellules. «Régions» sont utilisés pour définir une «porte». Les régions définissent un espace à 2 dimensions alors que les portes peuvent être constituées de nombreuses régions connectées par des opérateurs algébriques (+, *, -, défini dans le Tableau 2).

  1. Mettez le logiciel en mode d'analyse. Un modèle d'analyse doit être généré pour correspondre
  2. Analyser chaque fichier individuel (ie, chaque échantillon individuel) séparément. Mettre en place des portes R1 à R9 et à ensuite mettre en place les algorithmes pour chaque type cellulaire tel que défini dans le tableau 2 (également représenté sur la figure 5).
  3. Utiliser les statistiques cellulaires compteur pour calculer populations de cellules individuelles définies par les portes et les algorithmes (tableau 2 et figure 5). Les algorithmes ajuster automatiquement le nombre de cellules dans les statistiques de la cellule contre.
  4. Calculer des sous-ensembles de cellules en utilisant l'équation suivante:
    Equation 1
    Note: Nombre d'événements cellulaires comptés (par exemple, les événements de cellules T CD4) est énumérée en utilisant l'équation ci-dessus pour donner le nombre de cellules par ml de sang. Des exemples sont montrés sur la figure 5.

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Representative Results

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La méthode utilisée dans ce document pour la génération d'un modèle orthotopique du mésothéliome pleural en utilisant des cellules II-45 a donné lieu à des animaux succombant à mésothéliome dans un délai reproductible et rapide, sans rats meurent en raison de la méthode d'implantation. Le titrage du nombre de cellules implantées déterminé que 1x 10 3 cellules a été le nombre minimum requis pour un modèle entièrement pénétrant (100% de la prise de greffe). Le nombre différent de cellules implantées chez les rats a changé au cours du temps de la maladie qui apparaît sans affecter la sévérité de la maladie. Les animaux qui ont reçu 1 x 10 3, 1 x 10 4 et 5 x 10 5 cellules atteint éthique paramètres définis par jours 40, 30 et 20 jours respectivement (figure 6).

Le sang a été recueilli à partir de rats environ deux fois par semaine sans complications observées lié à la collection. Il est important de noter que pas plus de 10% du volume total de sang (ouenviron 2 ml) doivent être collectés dans une période de 2 semaines. Un essai de cytométrie de flux qui combine stratégies de déclenchement et de l'algèbre de Boole a été créé pour identifier les lymphocytes, les neutrophiles et les monocytes et les sous-ensembles de lymphocytes T, T CD4, CD8 T, cellules B et NK. La moyenne et l'intervalle pour chaque type de cellule a été créé en utilisant des rats de contrôle (n = 5) et a été comparée à la moyenne et la gamme de II-45 rats implantés au point final (tableau 3). Endpoint valeurs ont d'abord été comparés afin de déterminer si les différences existaient dans nombre de cellules immunitaires entre les animaux sains et malades. En comparaison à des rats témoins sains, les lymphocytes totaux, les cellules T CD4, les lymphocytes B et les cellules NK ont diminué en II-45 rats implantés au point final alors que les monocytes, les neutrophiles et les neutrophiles à taux de lymphocytes (NLR) a augmenté.

Pour déterminer si ces paramètres de cellules immunitaires également modifiés avec progression de la maladie et ainsi pourraient être utilisés comme marqueurs de substitution fou la surveillance des maladies, des échantillons longitudinaux ont également été comparées (Figure 7). Le paramètre longitudinale plus informative était NLR avec des augmentations détectées jusqu'à 7 jours avant paramètres éthiques (figure 7A). Pour les rats avec des cellules haute dose, élevés NLR ont été détectés entre le jour 7 et le jour 12 après l'implantation, alors que pour les rats avec des cellules à faible dose, le NLR a commencé à augmenter entre le jour 18 et 22. Le nombre total de lymphocytes ont diminué avec la progression de la maladie chez les rats avec un plus le modèle au cours du temps de la maladie (dose de cellules à faible: 1 x10 4, figure 7B). Cette diminution était pas évidente chez les rats avec un cours à temps rapide (dose élevée de cellules: 5 x10 5). Les monocytes sont restés à des niveaux normaux jusqu'à ce que le terminal de collecte où grossièrement augmentation de la numération ont été souvent observés (figure 7C). Les autres chefs de cellules immunitaires (neutrophiles, NK, lymphocytes B et les cellules T CD4 et CD8) étaient plus variables et donc moins instructif.


Figure 1. Organigramme de la procédure expérimentale. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Situation et site d'implantation. Le rat est d'abord anesthésiés, placé sur son dos et l'costale regio zone de droite (de la poitrine) est rasée pour enlever la fourrure. Sur le côté droit, la 2 ème mamelon du haut est identifié et le site d'injection est situé 0,5 cm proximale à cela, entre le 3 ème et 4 ème côtes à partir du bas de la cage thoracique (A). Une entretoise est ensuite placé sur l'aiguille et la seringue préparée pour empêcher l'aiguille pénétrer trop profondément dans l'pleural cavité et 100 pi de cellules ou de GDF est injecté (B). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. technique d'échantillonnage pour la collecte de sang de la queue. Position A 23G x 1 ¼ needle parallèle à la nervure latérale (A). Faites glisser l'aiguille dans la veine à un angle faible, environ 10 mm de profondeur, et il y maintenez pendant quelques secondes jusqu'à ce que le sang est visible (B) puis retirez l'aiguille. Prélever le sang en utilisant une pipette (C). Si nécessaire caresser doucement veine de la queue pour assurer le sang continue à couler. Pipette sang dans un tube de collecte 0,5 ml de EDTA (D), le mélange que vous allez pour empêcher la coagulation. arge.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. L'étiquetage de l'échantillon de sang dans un tube de comptage absolu pour analyse par cytométrie en flux. Blood (25 ul) et les anticorps sont ajoutés à un tube de comptage absolue (A). Le tube est ensuite agité par tourbillonnement et mis en incubation pendant 15 min à température ambiante. Avant l'addition d'un tampon de chlorure d'ammonium pour lyser les globules rouges du sang, l'échantillon apparaît trouble ou opaque (B). Une fois lysées, l'échantillon semble translucide et est prêt pour la cytométrie de flux (C). S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 5. Stratégie Gating pour cytométrie de flux. Un ensemble de données 6-dimensionnelle peut identifier les lymphocytes, les neutrophiles et les monocytes et les sous-ensembles de lymphocytes T, T CD4, CD8 T, cellules B et NK. Les stratégies et les algorithmes de déclenchement définies intègrent à la fois la réactivité négative et positive qui définissent chaque type de cellule permettant une identification spécifique. Le nombre de perles dans chaque tube de comptage absolu (qui se trouve sur la pochette pour chaque tube) est enregistrée pour chaque échantillon et est nécessaire pour calculer le nombre de cellules par ml de sang pour chaque sous-ensemble comme indiqué. L'algorithme de déclenchement complète pour chaque sous-ensemble de cellules est indiquée à droite des parcelles d'analyse. (AI) Perles (R1) sont initialement comptabilisés par FITC (FL-1) par rapport à l'APC (FL-4). Acquisition est réglé à environ 10 000 événements (9960 pour cet exemple). (Aii) Debris (R2) est identifié par le FSC par rapport SSC et retiré de tous les g ultérieureCLASSEMENT. (Bi) À la suite de l'enlèvement des débris (R2) FSC contre SSC différencie population de globules blancs dans les lymphocytes (R3), les monocytes (R4) et des neutrophiles (R5). (Bii) Les populations de cellules identifiés dans (Bi) sont confirmées en utilisant leucocyte commune antigène CD45 sur les PE / Cy7 (FL-3) par rapport à la SSC. (Biii) La population de lymphocytes (R3) est en outre différencier en cellules T (R6) en utilisant CD3 déclenchement sur ​​APC (FL-4) par rapport SSC. ( cellules Biv) T CD8 sont des lymphocytes (R3) différenciées en cellules T (R6) qui expriment également CD8a (R9) et sont fermée sur PE (FL-2) en fonction du SSC. (Ci) les cellules B et les cellules NK sont définis comme des lymphocytes ( R3) qui sont CD3 négative. Les cellules B (R7) se différencient à partir de cellules NK comme ils expriment CD45RA et sont déclenchés par APC (FL-4) par rapport à FITC (FL-1). Cellules (Cii) T CD4 sont définis comme des lymphocytes (R3) qui CD3 co-express (cellules T, R6) etCD4 (R8) mais ne pas exprimer un quelconque des autres marqueurs utilisés. Ils sont différenciés en utilisant FITC (FL-1) par rapport à PE (FL-2) déclenchement. Les cellules NK sont définies comme toute lymphocytes restante qui n'a pas déjà été définie qui exprime également CD161a. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6. courbe de survie de rats implantés avec différentes doses de cellules II-45 mésothéliome. Des groupes de rats ont été implantés avec pleurally 5 x 10 5 (n = 6), 1 x 10 4 (n = 2), 1 x 10 3 ( n = 2) ou 1 x 10 2 (n = 4) II-45 cellules de mésothéliome dans un volume de 100 pi, puis suivis jusqu'à ce critère éthique quand ils ont été euthanasiés. La survie a été tracée à l'aide du log-rank (Mantel-Cox) Méthode Gehan-Breslow-Wilcoxon. p>

Figure 7
Figure 7. longitudinale circulant nombre de cellules immunitaires de rats atteints de mésothéliome par rapport à la moyenne et la gamme pour les rats témoins en bonne santé. Le contrôle sain signifie pour chaque type de cellule est montré comme un ininterrompue ligne noire horizontale (valeur est indiquée sur l'axe des ordonnées droit de chaque graphique) et la gamme est représenté par la zone grisée. L'axe des Y montre les comptages par ul de sang pour le type de cellule déterminée, ou la valeur de NLR. L'axe des X représente l'évolution temporelle de la progression de la maladie, où jour 0 est le jour de l'implantation. Les résultats longitudinaux pour 2 rats implantés avec 1 x 10 4 cellules (A, B) et 2 rats implantés avec 5 x 10 5 cellules (C, D) sont affichés. (A) NLR, (B) le nombre de lymphocytes totaux, (C) nombre de monocytes.ge.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Détecteur Fluorophore Détails Tension Mode
FSC --- --- E00 Linear
SSC --- --- 450 Linear
FL-1 FITC 533/30 nm 670 Connexion
FL-2 PE 585/40 nm 675 Connexion
FL-3 PE / Cy7 670nm (longue passe) 600 Connexion
FL-4 APC 675/25 nm 735 Connexion

Tableau 1: Tension réglages du détecteur de débit pour cytoacquisition de données métrique en utilisant une couleur 4 cytomètre de flux. Amplitude de gain est fixé à 1 pour tous les détecteurs. FSC: diffusion vers l'avant, SSC: dispersion latérale, FITC: isothyocyanante fluorescéine, PE: Phycoérythrine, APC: allophycocyanine.

Cellulaire sous-ensemble Marqueurs cellulaires Gating Algorithme
Perles R1
Debris R2
Cellules (Pan-leucocytes) CD45 + -R2
Lymphocytes CD45 + FSC par rapport SSC R3 * -R2
Monocytes CD45 + FSC par rapport SSC R4 * -R2
Les neutrophiles CD45 + FSC par rapport SSC R5 * -R2
Cellules T (au total) CD45 + / CD3 + * * R6 R3 -R2
T CD8 CE positiflls CD45 + / CD3 + / CD8a + R9 * R6 * * R3 -R2
Cellules B CD45 + / CD3 / CD45RA + R7 * * R3 -R2
Les cellules CD4 T positif CD45 + / CD3 + / CD4 + R8 R6 * * * R3 - (R7 * * R3 -R2)
Cellules tueuses naturelles CD45 + / CD3 / CD161a + R3 * - [(R2 + R6) + (R7 * -R2 R3 *)]

Tableau 2: marqueurs cellulaires et des algorithmes de déclenchement pour caractériser chaque sous-ensemble de cellules immunitaires Pour l'algorithme de déclenchement, le symbole «+» signifie «ou» et permet à deux populations distinctes d'être ajoutés ensemble, même si leurs réactions ne se chevauchent pas.. Le symbole «-» signifie «non» et peut soustraire un population de l'intérieur une autre population définie ou l'inverse d'une population décrite précédemment. Le symbole «*» signifie «et» et définit un espace qui est présent seulement quand deux réactions se chevauchent. Sous-ensembles de cellules immunitaires Les rats témoins (n ​​= 5) II-45 rats implantés au point final (n = 4) Signifier Gamme Signifier Gamme Total des lymphocytes 165,7 111,5 à 207,0 97,9 54,4 à 137,0 Les lymphocytes T CD4 72,9 45,4 à 111,4 38,4 De 25,6 à 50,0 Lymphocytes T CD8 36,6 De 26,0 à 48,3 32,1 16,1 à 46 Lymphocytes B 56,6 De 36,0 à 83,9 24,7 De 11,2 à 36,0 Les cellules NK 9.3 3,1 à 15,7 4.0 1,34 à 7,7 Monocytes 27,1 De 12,7 à 39,0 373.3 42,4 à 575,8 Les neutrophiles 51,4 De 24,3 à 87,0 159,2 51,1 à 366,0 NLR 0,3 0,18 à 0,42 1.8 0,94 à 2,66

Tableau 3:. La moyenne et la plage de cellules immunitaires chez les rats témoins sains (n = 5) et II-45 rats implantés au point final (n = 4) Résultats par ul de sang sont présentés.

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Discussion

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Cet article détaille une méthode pour la génération d'un modèle orthotopique syngénique de rat de mésothéliome pleural et une méthode simple pour surveiller la progression de la maladie grâce à un échantillonnage de sang longitudinale.

Le modèle II-45 a été développé par l'exposition des rats Fischer 344 aux fibres d'amiante 13. Bien que cette exposition représente les vrais dynamique des interactions du système hôte-amiante-immune pour le mésothéliome pathogenèse, il a un temps de latence de long (en années pour générer) et peuvent être dangereux pour les chercheurs en raison de l'exposition potentielle aux fibres d'amiante. Implantation orthotopique de cellules II-45 dans la cavité pleurale des animaux fournit un modèle sûr et rapide de la progression du cancer qui imite la maladie chez un hôte humain immunisé-11 compétente. Toutefois, les méthodes et les principes exacts à adhérer à au cours de ces procédures expérimentales ne sont pas bien définis. La procédure décrit les résultats dans un modèle hautement reproductible qui est relarelativement indépendante de l'expérience de l'opérateur. Les étapes essentielles sont: 1, II-45 récolte les cellules en phase de croissance exponentielle et un comptage précis de cellules viables; 2, le positionnement correct du site d'implantation et d'assurer l'aiguille ne pénètre pas trop profondément et perforer les poumons ou endommager le coeur, et 3, maintenir et surveiller le bien-être des animaux.

La lignée cellulaire II-45 est en croissance rapide et nécessite repiquage tous les 3 à 4 jours de culture, donc lors de la préparation pour l'implantation, les cellules doivent être sous-culture et la croissance surveillée quotidiennement. Les cellules doivent être récoltées et comptées lors de la phase de croissance exponentielle, soit environ 70% de confluence. Remise en suspension des cellules dans des milieux exempts de sérum plutôt que PBS réduit le stress sur les cellules tout en comptant la préparation et à l'implantation. Numérations cellulaires précises sont cruciales pour la reproductibilité, en particulier lorsque le dosage avec le nombre de cellules faibles (par exemple, 100 à 1000). Le susla pension doit être homogène et composé de cellules individuelles (pas de bouquets). Un volume de 100 ul de l'implantation permet un dosage précis sans nuire à l'expansion du poumon à travers excessive de liquide dans la cavité pleurale. Les principales étapes sont à l'implantation et le positionnement correct de limiter la pénétration de l'aiguille à une profondeur de pas plus de 12 mm. Le positionnement correct de l'aiguille au niveau du site d'injection est extrêmement important de veiller à ce que les cellules sont implantées dans la cavité pleurale et non dans la cavité peritoneale. Implantation incorrecte cellules trop faible peut provoquer des tumeurs de mésothéliome en croissance à travers le diaphragme, dans le foie et la cavité péritonéale. La restriction de la profondeur de pénétration de l'aiguille est également extrêmement important pour prévenir la mortalité à la suite de dommages aux organes internes. Cette restriction peut être obtenu par l'utilisation d'un élément d'espacement sur une longue aiguille (comme représenté) ou l'utilisation d'une aiguille plus courte d'une longueur d'arbre de 5 mm à 12 mm. Dans nos mains, pas d'événements indésirables sont survenuslors de l'implantation des cellules. Il est également essentiel de remplacer l'aiguille après chaque implantation. Ne pas le faire peut entraîner des tumeurs à croissance hors de la cavité de la poitrine le long de la ligne d'injection. Une telle croissance à l'extérieur de la cavité pleurale est due à des cellules résiduelles sur la tige d'aiguille et peut se traduire par la survie prolongée.

En nos mains, ce modèle a un taux de 100% de la prise de greffe de la tumeur lors de l'administration de ≥ 1 x 10 3 cellules. Progression de la maladie dans le modèle de mésothéliome II-45 est très rapide, moins de 40 jours où 1 x 10 4 cellules sont implantées et moins de 20 jours pour une dose de 5 x 10 5 cellules. Cela peut limiter l'utilité de ce modèle pour les essais pré-cliniques de certaines thérapies. Les cellules II-45, tandis que pas disponibles dans le commerce peuvent être achetés avec la permission de l'auteur 13. Cependant, les mêmes techniques et les principes implantation peuvent également être appliqués à d'autres lignées cellulaires de mésothéliome de rat disponibles de repos de la ligne de celluleitories lorsqu'ils sont appariés avec les souches de rats syngéniques pertinents. La dose optimale de cellule peut varier en fonction de la lignée cellulaire et devra être déterminé pour chaque ligne.

Surveillance de progression de la maladie et le bien-être des animaux est difficile, car les tumeurs sont interne et ne peuvent pas être surveillés par la taille. Nous avons donc cherché à développer une méthode de surveillance des animaux qui pourrait prédire la détérioration de leur état comme une augmentation de la NLR ou tout autre changement dans les marqueurs de cellules immunitaires avant que les symptômes physiques sont devenus visibles. L'écran de sang développé utilise seulement 25 pi de sang périphérique de telle sorte que l'échantillonnage régulier peut être effectué avec la détresse minimal pour l'animal. La technique d'échantillonnage décrit exige de la pratique d'acquérir l'expertise nécessaire. Cependant, une fois maîtrisé, il est rapide et peu invasive.

Une étape critique dans l'analyse du sang pour empêcher la coagulation de l'échantillon de sang par un transfert rapide à un tube d'EDTA. Échantillons coagulésdoivent être jetés comme les comptages seront inexactes. Une autre étape importante est la lyse des globules rouges avant l'analyse cellulaire. Si les globules rouges ne sont pas entièrement lysées, le fond sera augmenté faussement élever les chefs d'accusation. Bien que la configuration initiale des tracés de points et de déclenchement consomme de temps, une fois les paramètres et modèle sont enregistrées, le test nécessite peu d'ajustement. La stratégie de déclenchement employé utilise une approche algébrique booléenne multi-paramètre à un dépouillement des données. En utilisant des combinaisons connues de exclusif et partagé antigènes les algorithmes pour chaque ligne de la stratégie de grille définir le type de cellules discrètes dans cette matrice de données à six dimensions 14. Ceci, couplé avec une précision constante de la technologie à base de bourrelet ratiométrique 15 à 17 présente l'avantage de permettre le dénombrement de chaque type de cellule définie comme étant à la fois une proportion de cellules et un comptage absolu par ul.

Il est de plus en plus reconnu que le système immunitaire pétablit un rôle important dans la pathogenèse du cancer 18. Tant la défaillance du système immunitaire à reconnaître et détruire les cellules malignes et la suppression des cellules immunitaires par des tumeurs peut conduire à la croissance tumorale incontrôlée. Ainsi, l'inclusion d'un microenvironnement de la tumeur immunitaire compétent est une considération critique lors de la modélisation cancer et est un avantage majeur de modèles de cancer syngéniques. Ces modèles immuno-compétente de créer un environnement réaliste et cliniquement pertinente de la croissance tumorale et l'interaction immunitaire, qui est déficiente dans les modèles xénogéniques.

Les paramètres immunitaires identifiés dans cette étude qui a accompagné la progression de la maladie, à savoir, le nombre de lymphocytes, le nombre de monocytes et de la NLR, ont également été montré une corrélation avec un mauvais pronostic dans le mésothéliome humaine 19-21 fournissant des preuves de la pertinence du modèle et le test sanguin . Dans les modèles présentés, l'utilité clinique de la surveillance des paramètres immunitaires augmenté esprith au cours du temps plus longue (plus faible dose) et peut être encore améliorée par un échantillonnage plus fréquent à des stades ultérieurs de la maladie. Bien que ce document met l'accent sur un modèle de mésothéliome, la capacité de surveiller la progression de la tumeur grâce à un échantillonnage de sang périphérique peut être utilisé pour tous les modèles de cancer syngéniques. En outre, le dosage peut également être utilisé pour évaluer la réponse immunitaire à différentes thérapies. Auparavant, nous avons utilisé ce dosage pour surveiller la réponse à une thérapie anti-cancer vaccin dans un modèle de gliome syngéniques (9L) 22. Dans cette étude, les cellules T CD4 et CD8 ont été les marqueurs les plus informatifs. Nous avons également utilisé cet essai et le modèle de mésothéliome II-45 pour identifier les différences dans la réponse immunitaire à des tumeurs résistantes aux médicaments chimiothérapeutiques différents 11. Dans cette étude, tous les paramètres à l'exception des cellules T CD8 ont montré des différences significatives. Le suivi longitudinal lors de progression de la maladie décrit ici met en évidence le potentiel de différents paramètres de cellule immunitaire Corporter la progression du cancer et le bien-être des animaux au moment d'entreprendre la modélisation syngénique orthotopique de cancer chez les rats.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
EDTA Collection tube (0.5 ml) Greiner Bio One GmbH 450480
Rat T/B/NK Cell cocktail BD Pharmingen 558509 anti-Rat CD3  APC (IgM clone 1F4), anti-Rat CD45RA Fitc (IgG1 clone OX-33), anti-Rat CD161a PE (IgG1 Clone 10/78)
anti-RAT CD8a PE  Biolegend 200608 (IgG1vClone G28)
anti-Rat CD4 FITC (Domain 1)  Biolegend 203406 (IgG1 Clone OX-38)
anti-Rat CD45 PE/Cy7  Biolegend 202214 (IgG1 Clone OX-1)
TruCount Tubes Becton Dickinson 340334 Box of 50 absolute counting tubes
RPMI 1640 media Life Technologies 11875-119
foetal bovine serum (FBS) Scientifix FBS500-S (lot# 010101-1)
trypsin-EDTA Life Technologies 15400-054
PBS tablets Medicago AB 09-9400-100
23Gx1¼ Needle Becton Dickinson 302008
1 ml Syringe Becton Dickinson 302 100
Fischer 344 Rat Animal Resources Centre, Perth Australia F344
I.S.O (Isoflurane USP) Veterinary Companys Australia (VCA)  B7058
II-45 Rat Mesothelioma line Zurich University Note: The cell line was given as a gift and is not commercially available at the ATCC
FACSCalibur 4 color Becton Dickinson 342975
TRIS-HCL SIGMA T3253
Ammonium Chloride SIGMA 9718
Anaesthetic Machine (The stinger) Advanced Anaesthesia specialists #00449

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References

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Orthotopique Implantation et périphérique des cellules immunitaires surveillance dans le modèle II-45 Syngénique Rat mésothéliome
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Weir, C. J., Hudson, A. L., Peters, L., Howell, V. M. Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model. J. Vis. Exp. (104), e53019, doi:10.3791/53019 (2015).More

Weir, C. J., Hudson, A. L., Peters, L., Howell, V. M. Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model. J. Vis. Exp. (104), e53019, doi:10.3791/53019 (2015).

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