Abstract
يتم إجراء اختبار الحساسية للمضادات الميكروبات (AST) لتقييم النشاط في المختبر من العوامل المضادة للجراثيم ضد البكتيريا المختلفة. وتستخدم النتائج AST، والتي يتم التعبير عنها تركيزات المثبطة الدنيا (البلدان المتوسطة الدخل) في مجال البحوث للتنمية المضادة للميكروبات ورصد تطور المقاومة والإعداد السريرية لتوجيه العلاج المضادة للميكروبات. Dalbavancin هو عامل lipoglycopeptide شبه الاصطناعية المضادة للميكروبات التي وافق مايو 2014 من قبل إدارة الغذاء والدواء (FDA) لعلاج الجلد وبنية الجلد الالتهابات البكتيرية الحادة التي تسببها الكائنات موجبة الجرام. ميزة dalbavancin على العلاجات المضادة للالعنقوديات الحالية لنصف العمر الطويل، والذي يسمح لجرعات مرة واحدة أسبوعيا. Dalbavancin ديه نشاط ضد المكورات العنقودية الذهبية (بما في ذلك مثسلين عرضة S. الذهبية [MSSA] ومقاومة للميثيسيلين S. الذهبية [MRSA])، المخثرة سلبية المكورات العنقودية،
Introduction
Dalbavancin هو lipoglycopeptide شبه الاصطناعية التي وافقت عليها ادارة الاغذية والعقاقير مايو 2014 لعلاج الجلد وبنية الجلد الالتهابات البكتيرية الحادة التي تسببها الكائنات إيجابية الجرام 1. الهدف الأساسي من تفاصيل هذه الطريقة في شكل شريط فيديو هو توفير توجيهات واضحة إلى المختبر والبحوث السريرية العلماء لاختبار النتائج والإبلاغ عنها dalbavancin قابلية دقيقة وقابلة للتكرار.
يتم تنفيذ تقرير لعامل مضاد للميكروبات MIC بالطرق التجارية بشكل روتيني في مختبرات السريرية لتقييم النشاط في المختبر وكيلا ضد البكتيريا المسببة للأمراض. الطريقة الموصوفة هنا هو طريقة microdilution مرق على النحو الموصى به من قبل CLSI وISO 2،3،4. منذ dalbavancin طرق قابلية التجارية غير متوفرة حاليا (في ذلك الوقت من هذا المنشور) ونشر القرص وطرق التخفيف آغار لا ينصح حاليا وأو dalbavancin وطرق مرق إشارة تخفيف هي الخيارات المتاحة حاليا 12،14. وبما أن هذه الطريقة المرجعية ليست التجاري وFDA مسح الأسلوب في المختبر التشخيصي، والمختبرات السريرية في الولايات المتحدة الأمريكية أن استخدام هذا الإجراء لاختبار المريض يجب أن تلتزم بالمتطلبات التنظيمية لمختبر المتقدمة اختبار (LDT). ومن المتوقع أن كما يزيد استخدام dalbavancin، والمزيد من مختبرات سوف يكون هناك حاجة لاختبار هذا المركب. فانكومايسين اختبار كبديل لتحديد dalbavancin قابلية S. تم التحقق من صحة الذهبية 5. ومع ذلك، قد يكون dalbavancin فعال ضد فانكومايسين وسيط S. الذهبية (فيزا)، وبالتالي، الأطباء أن يطلبوا النتائج dalbavancin MIC. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يطلب النتائج MIC الأنواع البكتيرية الأخرى.
وتوقف عرضة FDA لdalbavancin ضد S. وقد أنشئت الذهبية في ≤0.12 ميكروغرام / مل. ادارة الاغذية والعقاقير المخصصة فقط susceptiفئة بلي بسبب عدم وجود بيانات على العزلات مقاومة. توزيع MIC الطبيعي بين النوع البري S. الذهبية يعزل ما بين 0،03-0،12 ميكروغرام / مل، مع MIC مشروط واضح من 0.06 ميكروغرام / مل. وهناك اختلاف طفيف في نتائج MIC نتيجة لأسلوب الفرق، بالإضافة إلى الاختلاف BMD المتأصل في ± واحد التخفيف، ويحتمل أن يكون لها تأثير كبير على معدلات الحساسية. 6 مماثلة إلى وكلاء lipoglycopeptide أخرى، يمكن أن dalbavancin اختبار الحساسية تكون صعبة نتيجة ل من الذوبان وحجم كبير نسبيا من جزيء وخصائص ملزمة لها 7،8،9. طريقة إشارة BMD هو موضح هنا تضم اثنين من الخطوات المحددة التي هي فريدة من نوعها لعملاء غير قابلة للذوبان و / أو وكلاء lipoglycopeptide: (1) استخدام DMSO لإعداد الحلول الأسهم و(2) إضافة-P 80 0.002٪ في لوحة MIC النهائية التخفيفات. والهدف من هذا المنشور الفيديو هو توفير الوضوح على dalbavancin طريقة BMD وspecificaالتركيز LLY على هذه الخطوات الرئيسية، لضمان النتائج MIC دقيقة وقابلة للتكرار.
Protocol
ملاحظة: يرجى الرجوع إلى وثائق CLSI M7-A10 وM100-S25 و / أو ISO / FDIS 20776-1 للحصول على التفاصيل الكاملة للطريقة مرجعية مرق microdilution لقابلية المضادة للميكروبات 2، 3، 4 طرق إشارة تسمح الخيارات في بعض. إجراءات محددة لإعداد اللقاح ولوحة MIC الإنتاج لتحقيق نفس النتيجة النهائية. طريقة مفصلة هنا يتعلق أحد مضادات الميكروبات وكيل، dalbavancin، وبعض الخطوات تمثل واحدة من يحتمل عدة طرق يمكن أن يتم الإجراء المرجعية. احتياطات السلامة المناسبة (بما يتفق مع مستوى السلامة الحيوية 2) يجب أن تستخدم 10. يظهر شكل لوحة MIC تستخدم لغرض من هذا المنشور الفيديو في الجدول 1.
1. مخزن Dalbavancin مسحوق
- عند استلام التشخيص مسحوق الصف dalbavancin، مخزن في -20 درجة مئوية في بيئة المجفف في الفريزر غير إزالة الجليد. قبل استخدامها، ينبغي أن تتوازن مسحوق لوصول RT قبل الافتتاح.
2. إعداد التخفيفات لوحة MIC
- يعد حل الأسهم لا تزيد عن 1600 ميكروغرام / مل من dalbavancin في أنيق (النقي) DMSO في الزجاج أو البلاستيك أنابيب معقمة، واستخدامها في نفس اليوم من إعداد أو تخزينها في -20 إلى -60 درجة مئوية أو أقل لاستخدامها في المستقبل في الفريزر غير إزالة الجليد. تأخذ في الاعتبار قوة من dalbavancin على النحو المنصوص عليه في الوثائق الواردة مع مسحوق، عندما يزن مسحوق (انظر المعادلة 1 على سبيل المثال 800 ميكروغرام / مل إعداد الأوراق المالية).
- تمييع التخفيف الأسهم مماثل لنظام كما هو مبين في العمود 1 ("تركيز المصدر") في الجدول رقم 2 مع DMSO أنيق من الزجاج أو البلاستيك أنابيب معقمة. استخدام الماصة واحد لقياس مخفف والماصة آخر لإضافة الأسهم dalbavancin الأولي إلى الأنبوب الأول. لكل تركيز الأسهم dalbavancin لاحق استخدام الماصة جديدة.
- إعداد 100X النهائي تناسق لوحة MICالتخفيفات التموينية (تركيزات المتوسطة) مع DMSO أنيق. كما هو مبين في الأعمدة 2-4 من الجدول 2، والجمع بين كميات مناسبة من مصدر وDMSO لتحقيق المطلوب التركيز وسيطة (وحدات التخزين لاستخدامها سيعتمد على عدد من اللوحات MIC ليتم).
- إعداد 0.004٪ P80: إعداد محلول المخزون العاملة جديدة من 2٪ P80 بإضافة 0.1 مل P80 إلى 4.9 مل درهم 2 O. تعقيم عن طريق تمرير من خلال مرشح واستخدام محلول 0.22 ميكرون في نفس اليوم من التحضير. إعداد 0.004٪ P80 مخفف بجعل 1: 500 التخفيف من 2٪ P80 (على سبيل المثال، 0.3 مل من 2٪ إلى 149.7 P80 مل من CAMHB).
- وعلاوة على ذلك يخفف من تركيز المتوسطة أعدت في الخطوة 2.2 1: 100 في الموجبة تعديل مولر هينتون مرق (CAMHB) تستكمل مع 0.004٪ (ت / ت) بوليسوربات-80 (P-80) P-80 و / أو LHB (لالعقديات) بإضافة في ضعف التركيز النهائي لأن إضافة اللقاح (الخطوة 4.3) يؤدي إلى 1: 2 التخفيف. رؤية أعمدة 6 و 7 في الجدول 2
3. إعداد لوحات هيئة التصنيع العسكري
- الاستغناء عن 50 ميكرولتر من كل حل dalbavancin أعدت في الخطوة 2.3 في الآبار الملائمة لوحة MIC وتشمل وسائل الاعلام فقط في بئر واحدة (مراقبة نمو جيد). A الماصة متعدد القنوات مع نصائح عقيمة يمكن أن تستخدم لهذه الخطوة.
- استخدام لوحات فورا أو ختم مع فيلم من البلاستيك، مكان في أكياس بلاستيكية ووضع على الفور في الفريزر غير يذيب-في ≤ 20 درجة مئوية (ويفضل في ≤ 60 درجة مئوية) لحين الحاجة إليها. إذا تم استخدام ألواح المجمدة، وإزالة الأختام ووضع لوحات فردية على مختبر مقاعد البدلاء 15-30 دقيقة (حتى يتم إذابة محتويات أيضا) قبل الانتقال إلى لوحة التلقيح.
4. تلقيح لوحات هيئة التصنيع العسكري، نفذ الطهارة وإعداد مستعمرة عدد
- اختر العديد من المستعمرات المعزولة جيدا من أجار الدم 18-24 ساعة أو غيرها من لوحة أجار غير انتقائية. تلمس الجزء العلوي من كل مستعمرة مع حلقة عقيمة أو مسحة ونقل إلى 1-5 مل CAMHB أو الصورةألين حتى تعكر ما يعادل 0.5 مكفارلاند القياسية. تقييم العكر من خلال المقارنة البصرية إلى مكفارلاند 0.5 أو مع جهاز الضوئية.
- في غضون 15-30 دقيقة من التحضير، ويخفف من اللقاح 1: 100 في CAMHB (100 ميكرولتر في 10 مل CAMHB). بالنسبة لمعظم البكتيريا المختبرة ضد dalbavancin، باستثناء S. الرئوية، وهذا التخفيف توفير التركيز جيدا النهائي من 5 × 10 5 خلية / مل (النطاق المقبول هو 2-8 × 10 5 خلية / مل). لS. الرئوية، والتركيز البكتيري على أساس المقارنة التعكر إلى 0.5 مكفارلاند هو عادة أقل بكثير، وبالتالي، يخفف من اللقاح 01:25 (400 ميكرولتر في 10 مل CAMHB + 10٪ + LHB).
- في غضون 15 دقيقة بعد إعداد اللقاح، ونقل 50 ميكرولتر من اللقاح النهائي لكل بئر (مع استثناء من السيطرة العقم أيضا) من لوحة هيئة التصنيع العسكري أعدت في الخطوة 3. الماصة متعدد القنوات باستخدام نصائح معقمة يمكن استخدامها لهذه الخطوة.
- إجراء فحص النقاءعن طريق نقل ونشر قسامة 1-10 ميكرولتر من سيطرة نمو إيجابية جيدا باستخدام حلقة عقيمة لأجار غير الانتقائية (على سبيل المثال، trypticase أجار الصويا مع 5٪ الأغنام الدم).
- عدد مستعمرة الإعداد عن طريق إزالة 10 ميكرولتر من سيطرة النمو بشكل جيد مع قناة الماصة واحد وطرف العقيمة ونقل إلى 10 مل من المياه المالحة (1: 1000 تمييع). خلط ونقل 100 ميكرولتر مع الماصة قناة واحدة وطرف العقيمة لمناسبة والمتوسطة أجار غير الانتقائية (على سبيل المثال، trypticase أجار الصويا مع 5٪ الأغنام الدم) وتنتشر على سطح أجار كامل مع حلقة عقيمة، وتكرار مرتين في اتجاهات مختلفة لضمان التوزيع حتى من اللقاح (01:10 تمييع).
5. لوحات احتضان MIC، مستعمرة العد ومركبات الطهارة
- ختم كل لوحة هيئة التصنيع العسكري أو كومة من لا يزيد عن 4 لوحات في كيس من البلاستيك، مع شريط من البلاستيك أو مع غطاء من البلاستيك ضيقة قبل يحتضنها. بدلا من ذلك، وضع لوحة MIC فارغة على رالمرجع من كومة من لا وحات MIC أكثر من 4، ووضع منشفة ورقية رطبة في وعاء من البلاستيك، والألواح مكان MIC في وعاء من البلاستيك وعاء آمن وثيقة مع غطاء.
- احتضان لوحات هيئة التصنيع العسكري في حاضنة الهواء المحيط في 35 ° C ± 2 درجة مئوية لمدة 16-20 ساعة (المكورات العنقودية والمكورات المعوية) و20-24 ساعة (العقديات) في غضون 30 دقيقة من التلقيح. احتضان عدد مستعمرة ولوحات النقاء تحت نفس الظروف إلا العقديات احتضان في 5٪ CO 2 الحاضنة.
6. قراءة MIC ومستعمرة عدد لوحات. تحقق الطهارة اللوحة
- قراءة MIC كما تحتوي على نسبة أقل أن يمنع تماما نمو البكتيريا في الآبار كما الكشف عنها بواسطة العين المجردة.
- عد المستعمرات على لوحة العد مستعمرة. تتضاعف كل مستعمرة من قبل عامل التخفيف (1: 10000) (على سبيل المثال، 50 المستعمرات ما يعادل 5 × 10 5 خلية / مل). نطاق مقبول هو 20-80 المستعمرات (2-8 × 10 5 خلية / مل)، ويستخدم بمثابة APPROالمبدأ التوجيهي ximate.
- تحقق لوحة النقاء. وإذا كان كل المستعمرات متشابهة إلى المستعمرات المستخدمة في الخطوة 4.1، ثم اللقاح يمكن اعتبار النقي. إذا كان هناك أي مستعمرات أخرى موجودة، ثم هناك احتمال لالملوث ليكون حاضرا في لوحة MIC وينبغي تكرار الاختبار.
7. تحقق نتائج مراقبة الجودة.
- الرجوع إلى الجدول رقم 3 لنطاقات المتوقع سلالات مراقبة الجودة CLSI. فقط تقرير نتائج اختبار العزلات إذا كانت النتائج MIC dalbavancin لمراقبة الجودة الكائن (الصورة) ضمن النطاق المتوقع.
- إذا حصلت على MIC من ≥0.25 ميكروغرام / مل لأي S. السريري الذهبية عزل، كرر الاختبار dalbavancin MIC و / أو إرسالها إلى مختبر مرجعي للتحقق منها.
Representative Results
طرق MIC موحدة ضرورية من أجل رصد تطور المقاومة، هدفا هاما لمختلف برامج المراقبة المضادة للميكروبات. وكانت النتائج Dalbavancin MIC للعزلة التي تم جمعها في أوروبا والولايات المتحدة الأمريكية في 2011-2013 <0.25 ميكروغرام / مل 99.9٪ من البكتريا و 100٪ من العقديات (جدول 4).
لتقييم أهمية استخدام الطازجة (مختومة) DMSO، اختبار ثلاث نسخ من البلدان المتوسطة الدخل dalbavancin BMD لQC سلالات S. الذهبية ATCC 29213، وE. البرازية ATCC 29212 وتكرار الاختبار لS. تم تنفيذ الرئوية ATCC 49619 باستخدام (1) DMSO من أمبولات مختومة، (2) DMSO من زجاجة 1 لتر التي كانت ضمن تاريخ انتهاء الصلاحية وكانت تستخدم سابقا لمدة 2 سنة و (3) قسامة من DMSO من نفس 1 L زجاجة (عينة 2) الذي يسمح للجلوس في دورق مفتوح لمدة 72 ساعة قبل استخدامها. وكانت النتائج MIC Dalbavancin باستخدام الألواح المصنوعة من جميع العينات DMSO ثلاثة مماثلة وثithin نطاقات مراقبة الجودة المقبولة (الجدول 5).
فقدان النشاط dalbavancin بعد التعرض للمحلول المخزون إلى البلاستيك وبدون إضافة P-80 تم توثيقه جيدا 7. في 2 دراسات إضافية، إضافة-P 80 إلى الحلول الأسهم الأولية والمتوسطة (الجدول 6)، واستخدام الزجاج أو البلاستيك أنابيب لإعداد الحلول الأسهم الأولية والوسيطة لم (الجدول 7) لا يكون لها تأثير على نتائج dalbavancin MIC. كان هناك أيضا أي تأثير على النتائج MIC dalbavancin عندما تم استخدام البولي بروبلين والبوليسترين لوحات من ثلاث شركات مصنعة (الجدول 7).
وقد تبين وجود هي lysed حصان الدم في وسائل الإعلام مرق لاختبار العقديات أن يكون النشاط مثل السطحي، مقارنة P-80 7، 8. والطريقة المرجعية dalbavancin لالعقدية لا تشمل كلا ف 80 و lysed حصان الدم ،ولكن، خلافا المكورات العنقودية والمكورات المعوية، نتائج dalbavancin MIC عن العقديات متشابهة (ضمن +/- 1 تمييع) مع وبدون إضافة P-80.
كما قدمت وهو مبين في الشكل رقم 1 سابقا، dalbavancin أجار التخفيف (AD) البلدان المتوسطة الدخل وعادة ما تكون 2-8 أضعاف أعلى بالمقارنة مع المرجع الحالي BMD 12، 13، 14 وعلى عكس BMD، إضافة 0.002٪ P-80 لا تؤثر dalbavancin AD MIC ينتج 12.
المعادلة 1: مثال لDalbavancin محلول المخزون إعداد خطوات التحضير ل25 مل من 800 ميكروغرام / مل حل dalbavancin.
الشكل 1. مقارنة Dalbavancin وفنكمسن BMD إلى AD نتائج الدراسة أن مقارنة dalbavancin وفانكومايسين BMD وAD MIC نتائج اختر العزلات البكتيرية موجبة الجرام. المتوسط (A) Dalbavancin و (B) فنكمسن مرق Microdilution وآجار التخفيف MIC النتائج في ميكروغرام / مل لمدة 15 المكورات العنقودية الذهبية، 8 مخثر المكورات العنقودية السلبية (CNS)، 5 المعوية البرازية و 14 العقديات (المجموعات A، B، و C). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | DAL 0،002 | DAL 0،004 | DAL 0،008 | DAL 0،015 | DAL 0.03 | DAL؛ 0.06 | DAL 0.12 | DAL 0.25 | DAL 0.5 | DAL 1 | DAL 2 | نقاط البيع السيطرة. |
| B | DAL 0،002 | DAL 0،004 | DAL 0،008 | DAL 0،015 | DAL 0.03 | DAL 0.06 | DAL 0.12 | DAL 0.25 | DAL 0.5 | DAL 1 | DAL 2 | نقاط البيع السيطرة. |
| C | DAL 0،002 | DAL 0،004 | DAL 0،008 | DAL 0،015 | DAL 0.03 | DAL 0.06 | DAL0.12 | DAL 0.25 | DAL 0.5 | DAL 1 | DAL 2 | نقاط البيع السيطرة. |
| د | DAL 0،002 | DAL 0،004 | DAL 0،008 | DAL 0،015 | DAL 0.03 | DAL 0.06 | DAL 0.12 | DAL 0.25 | DAL 0.5 | DAL 1 | DAL 2 | نقاط البيع السيطرة. |
| E | DAL 0،002 | DAL 0،004 | DAL 0،008 | DAL 0،015 | DAL 0.03 | DAL 0.06 | DAL 0.12 | DAL 0.25 DAL 0.5 | DAL 1 | DAL 2 | نقاط البيع السيطرة. | |
| F | DAL 0،002 | DAL 0،004 | DAL 0،008 | DAL 0،015 | DAL 0.03 | DAL 0.06 | DAL 0.12 | DAL 0.25 | DAL 0.5 | DAL 1 | DAL 2 | نقاط البيع السيطرة. |
| G | DAL 0،002 | DAL 0،004 | DAL 0،008 | DAL 0،015 | DAL 0.03 | DAL 0.06 | DAL 0.12 | DAL 0.25 | DAL 00.5 | DAL 1 | DAL 2 | نقاط البيع السيطرة. |
| H | DAL 0،002 | DAL 0،004 | DAL 0،008 | DAL 0،015 | DAL 0.03 | DAL 0.06 | DAL 0.12 | DAL 0.25 | DAL 0.5 | DAL 1 | DAL 2 | نقاط البيع السيطرة. |
| DAL | Dalbavancin | |||||||||||
| وذكر التركيزات في ميكروغرام / مل بعد 50 ميكرولتر / جيد التلقيح | ||||||||||||
جدول تنسيق لوحة 1. MIC. الموقع إظهار 96 شكل لوحة جيدا من التخفيفات dalbavancin وآبار مراقبة إيجابية تستخدم كمثال في هذا المنشور الفيديو
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| مصدر اضرب. (ميكروغرام / مل) | حجم المصدر (مل) | حجم DMSO (مل) | وسيط اضرب. في DMSO (ميكروغرام / مل) | حجم متوسط اضرب. (مل) | حجم CAMHB + 0.004٪ P80 (مل) * | 2X اضرب. بعد 1: 100 التخفيف في CAMHB (ميكروغرام / مل) | النهائي لفريق اضرب. بعد التلقيح (ميكروغرام / مل) |
| 800 | 1.0 | 1.0 | 400 | 0.02 | 1.98 | 4 | 2 |
| 400 | 0.5 | 0.5 | 200 | 0.02 | 1.98 | 2 | 1 |
| 400 | 0.5 | 1.5 | 100 | 0.02 | 1.98 | 1 | 0.5 |
| 400 | 0.5 | 3.5 | 50 | 0.02 | 1.98 | 0.5 | 0.25 |
| 50 | 0.5 | 0.5 | 25 | 0.02 | 1.98 | 0.25 | 0.125 |
| 50 | 0.5 | 1.5 | 12.5 | 0.02 | 1.98 | 0.125 | 0.06 |
| 50 | 0.5 | 3.5 | 6.25 | 0.02 | 1.98 | 0.06 | 0.03 |
| 6.25 | 0.5 </ td> | 0.5 | 3.13 | 0.02 | 1.98 | 0.03 | 0.015 |
| 6.25 | 0.5 | 1.5 | 1.5 | 0.02 | 1.98 | 0.015 | 0.008 |
| 6.25 | 0.5 | 3.5 | 0.8 | 0.02 | 1.98 | 0.008 | 0.004 |
| 0.8 | 0.5 | 0.5 | 0.4 | 0.02 | 1.98 | 0.004 | 0.002 |
| تم تعديل هذا الجدول من CLSI M100-S25، الجدول 8B 3 | |||||||
الجدول مخطط 2. لإعداد التخفيفات وكلاء مضادات الميكروبات المياه غير القابلة للذوبان لاستخدامها في مرق التخفيفات حساسية الاختبار. مجلدات وحلول العمل dalbavancin ومنظفة لإعداد MIC النهائيحلول dalbavancin من ،002-2 ميكروغرام / مل.
| سلالة مراقبة الجودة | يتوقع Dalbavancin MIC (ميكروغرام / مل) |
| S. الذهبية ATCC 29213 | 0،03-0،12 |
| E. البرازية ATCC 29212 | 0،03-0،12 |
| S. الرئوية ATCC 49619 | 0،008-،03 |
الجدول 3. المتوقعة Dalbavancin MIC نتائج للجودة سلالات تحكم 3، 11. نتائج مراقبة الجودة CLSI لسلالات اقترح أن يتم اختبارها جنبا إلى جنب مع العزلات السريرية من أجل التحقق من منهجية سليمة
الجدول 4. توزيع Dalbavancin نتائج MIC (عدد في كل MIC) من الولايات المتحدة الأمريكية ودول أوروبا 2011-2013 Surveillتعصب الدراسات 15. النتائج Dalbavancin MIC من دراسة نشرت العزلات السريرية الأخيرة كمؤشر على dalbavancin التيار النشاط في المختبر.
| عزل # | Dalbavancin MIC (ميكروغرام / مل) | ||
| DMSO 1 | DMSO 2 | DMSO 3 | |
| S. الذهبية ATCC 29213 | 0.12 | 0.06 | 0.06 |
| 0.12 | 0.06 | 0.06 | |
| 0.06 | 0.06 | 0.06 | |
| E. البرازية ATCC 29212 | 0.06 | 0.06 | 0.06 |
| 0.06 | 0.06 | 0.06 | |
| 0.06 | 0.06 | 0.06 | |
| 0.015 | 0.015 | 0.015 | |
| 0.03 | 0.015 | 0.015 | |
| DMSO 1 = مختومة اللهب غير مفتوحة 10 مل أمبولات | |||
| DMSO 2 = زجاجة 1L افتتح كثيرا | |||
| DMSO 3 = زجاجة 1L فتح وأجوبة - جلس على مقاعد البدلاء في دورق المكشوف لمدة 72 ساعة | |||
الجدول 5. Dalbavancin MIC نتائج (ميكروغرام / مل) باستخدام DMSO المالية والمتوسطة التخفيفات التحضير مع DMSO من 3 مصادر نتائج دراسة MIC dalbavancin أن مقارنة أثر استخدام المذيبات DMSO مختلفة في إعداد الأوراق المالية dalbavancin والتخفيفات المتوسطة.
| عزل عدد | تكرار الرقم | Dalbavancin MIC (ميكروغرام / مل) | |
| DALB ث / P80 في DMSO | DALB ث / س P80 في DMSO | ||
| S. الذهبية ATCC 29213 | 1 | 0.06 | 0.06 |
| 2 | 0.06 | 0.06 | |
| 3 | 0.06 | 0.06 | |
| 4 | 0.06 | 0.06 | |
| S. الذهبية DP80-002SA السريرية | 1 | 0.03 | 0.03 |
| S. الذهبية ATCC 700699 | 1 | 0.5 | 0.5 |
| S. الرئوية ATCC 49619 | 1 | 0.03 | 0.015 |
| 2 | 0.03 | 0.015 | |
| 3 | 0.03 | 0.015 | |
| 4 | 0.03 | 0.015 | |
| المقيحة S. السريرية: | |||
| DP80-004PY | 1 | 0.015 | 0.015 |
| DP80-005PY | 1 | 0.03 | 0.03 |
| DP80-006PY | 1 | 0.03 | 0.015 |
| DP80-007PY | 1 | 0.06 | 0.03 |
| DP80-008PY | 1 | 0.03 | 0.015 |
| S. القاطعة للدر السريري: | |||
| DP80-009AG | 1 | 0.06 | 0.12 |
| DP80-010AG | 1 | 0.06 | 0.03 |
| DP80-011AG | 1 | 0.06 | 0.06 |
| DP80-012AG | 1 | 0.06 | 0.06 |
| S. dysgalactiae كلينيكال DP80-013DY | 1 | 0.03 | 0.03 |
| S. الرئوية السريري: | |||
| DP80-014SP | 1 | 0.06 | 0.06 |
| DP80-015SP | 1 | 0.03 | 0.03 |
| DP80-016SP | 1 | 0.03 | 0.03 |
| DP80-017SP | 1 | 0.06 | 0.06 |
الجدول 6. Dalbavancin MIC النتائج باستخدام DMSO المالية والمتوسطة التخفيفات إعداد مع وبدون 0.002٪ P-80 نتائج دراسة MIC dalbavancin أن مقارنة تأثير إضافة 0.002٪ P-80 لdalbavancin الأسهم والتخفيفات المتوسطة.
| عزل | تكرار الرقم الأسهم التخفيف أنابيب | وحة microtiter (بلاستيك نوع) | |||||||
| بولي بروبيلين، غرينر | البوليسترين | ||||||||
| زجاج | البلاستيك | 1hr البلاستيك | 1hr البلاستيك / متوسط 1hr | غرينر | كورنينج | نونك | |||
| S. الذهبية ATCC 29213 | 1 | 0.06 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.06 | 0.03 | 0.06 | 0.03 |
| 2 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.06 | |
| 3 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | |
| E. البرازية ATCC 29212 | 0.06 | 0.06 | 0.06 | 0.06 | 0.03 | 0.03 | 0.06 | 0.03 | |
| 2 | 0.06 | 0.06 | 0.06 | 0.06 | 0.03 | 0.03 | 0.06 | 0.03 | |
| 3 | 0.06 | 0.06 | 0.06 | 0.06 | 0.03 | 0.03 | 0.06 | 0.03 | |
| S. الرئوية ATCC 49619 | 1 | 0.015 | 0.015 | 0.015 | 0.015 | 0.008 | 0.008 | 0.008 | 0.008 |
| 2 | 0.015 | 0.015 | 0.015 | 0.015 | 0.008 | 0.015 | 0.008 | 0.008 | |
| الزجاج = مخزون الأولي المحرز في زجاجة، استخدامها على الفور لجعل تركيز المتوسطالصورة في أنابيب بلاستيكية، استخدامها على الفور لجعل التخفيفات مرق. | |||||||||
| الأوراق المالية البلاستيك = الأولية المحرز في البلاستيك أنبوب الطرد المركزي، استخدامها على الفور لجعل تركيزات المتوسطة في أنابيب بلاستيكية، استخدامها على الفور لجعل التخفيفات مرق. | |||||||||
| البلاستيك 1 ساعة = مخزون الأولي المحرز في البلاستيك أنبوب الطرد المركزي، والسماح الجلوس على مقاعد البدلاء لمدة 1 ساعة ثم تستخدم لجعل تركيزات المتوسطة في أنابيب بلاستيكية، استخدامها على الفور لجعل التركيزات في المرق. | |||||||||
| البلاستيك 1 ساعة / متوسط 1 ساعة = مخزون الأولي المحرز في البلاستيك أنبوب الطرد المركزي، والسماح الجلوس على مقاعد البدلاء لمدة 1 ساعة ثم تستخدم لجعل تركيزات المتوسطة في أنابيب بلاستيكية، ترك الجلوس على مقاعد البدلاء لمدة 1 ساعة ثم تستخدم لجعل التركيزات في المرق. | |||||||||
الجدول 7. Dalbavancin MIC النتائج باستخدام الأسهم التخفيفات التحضير في البلاستيك والزجاج أنابيب وهيئة التصنيع العسكري أنواع لوحة من البلاستيك. النتائج ساتحاد كرة القدم dalbavancin دراسة MIC أن مقارنة أثر استخدام أنابيب بلاستيكية أو زجاجية عند إعداد الحلول الأوراق المالية وأثر استخدام مصادر وأنواع مختلفة من البلاستيك لوحات عيار مكروي أيضا.
Discussion
يتم عرض تفاصيل الطريقة التالية لاعتبارات إضافية عند التحضير للاختبار dalbavancin MIC. سوف تصميم لوحة MIC يعتمد على عدد من العوامل المضادة للجراثيم لفحصها (أي.، dalbavancin وحده أو وكلاء متعددة) وأنواع من البكتيريا لفحصها. وينبغي أن تشمل تركيزات dalbavancin نقاط الإيقاف التفسيرية لجميع الأنواع البكتيرية لفحصها ومجموعة كاملة من التخفيفات المتوقع لسلالة واحدة على الأقل QC. يمكن تنظيم سلسلة تخفيف مضادات الميكروبات سواء في الصفوف أو الأعمدة اعتمادا على عدد من العوامل المضادة للجراثيم و / أو يعزل / لوحة وطريقة التلقيح. يجب أن يحسب حجم مسحوق dalbavancin والمرق للتأكد من أن كميات الأمثل ويتم إنتاج والنفايات هو الحد الأدنى. للمثال المستخدمة في هذا المنشور، وتقوم وحدات التخزين على إعداد فريقي هيئة التصنيع العسكري. وينبغي إعداد الموجبة تعديل مولر هينتون مرق وتعقيمها وفقا للإنسانالتحقق تعليمات ufacturer والعقم وسائل الإعلام. لوحات هيئة التصنيع العسكري يمكن أن تكون وتستخدم في نفس اليوم من إعداد أو أنها يمكن اختبارها مع الكائنات مراقبة الجودة المناسبة والألواح التحقق من صحة تخزينها في المجمد لاستخدامها في المستقبل. من المهم أن استخدام تقنيات معقمة في جميع أنحاء الداخلي.
ليس هناك معايير صارمة للتحقق من تركيز اللقاح مع التهم مستعمرة. يمكن مراجعة التهم مستعمرة في البداية لكل أنواع اختبار و / أو دوريا للتحقق من صحة الخطوة تخفيف يؤديها في الخطوة 4.2. من المهم أن صلاحية مكفارلاند مستوى 0.5 محددا أيضا بشكل روتيني مع E. القولونية ATCC 25922 باستخدام إجراء مماثل إلى الخطوة 4.5. إذا لم تكن النتائج تعادل 1-2 × 10 8 كفو / مل، يجب الحصول على الجديد 0.5 مكفارلاند القياسية. إذا كانت التهم مستعمرة من الآبار MIC هي خارج نطاق مقبول (2-8 × 10 5 خلية / مل النتائج وهيئة التصنيع العسكري لعزل السريرية (ق) تختلف من عشريتوقع ه التوزيع الطبيعي (على سبيل المثال. 0،03-0،12 ميكروغرام / مل للبكتريا المكورة العنقودية البرتقالية) و / أو نتائج هيئة التصنيع العسكري لمراقبة الجودة عزل (ق) هي خارج النطاقات المتوقعة، اختبار التحقق من صحة ضروري ويمكن أن يكون له ما يبرره طريقة التعديل. ويقترح أن التحقق من صحة 0.5 مكفارلاند معيار يستخدم لتكرار العد مستعمرة (ق) وإذا كانت النتائج غير مرة أخرى خارج النتائج المتوقعة، وتخفيف اللقاح كما يؤديها في الخطوة 4.2 يجب أن تعدل وفقا لذلك وتكرار MIC. لاحظ أن الاختيار نقاء ضروري حتى لو يتم تنفيذ عدد مستعمرة لإجراء تعداد المستعمرة يستخدم حجم المخففة التي قد لا يكشف بالضرورة تركيزات أقل من الكائنات تلوث.
لاختبار هيئة التصنيع العسكري أن تعتبر صالحة، يجب أن يحدث نمو مقبول في مراقبة النمو بشكل جيد. بالنسبة لمعظم البكتيريا التي سيتم اختبارها ضد dalbavancin (أي.، المكورات العنقودية، المكورات العقدية والمكورات المعوية، سوف ينظر النمو كزر (عادة> 2 مم) وأقل الابequently، قد تظهر النمو كما التعكر في البئر. وخلافا لبعض العوامل المضادة للجراثيم التي قد تظهر زائدة اعتبارا زيادة تركيزات، تعرف النهاية dalbavancin عادة بشكل جيد. هناك العديد من أجهزة العرض يهدف إلى تسهيل اختبارات القراءة microdilution، والتي يمكن استخدامها لقراءة dalbavancin تحتوي على لوحات طالما لا يوجد حل وسط في القدرة على التمييز النمو في الآبار.
ترتبط الخطوات الحاسمة ضمن بروتوكول للمراحل الإجراءات التي تتعلق ذوبان dalbavancin وإضافة P80. من المهم أن الحد الأقصى لتركيز dalbavancin المستخدم هو لا يزيد عن 1600 ميكروغرام / مل، ويستخدم هذا DMSO كمادة مذيبة وتعد أن تركيزات المتوسطة في DMSO قبل اتخاذ التخفيفات مرق بحيث التركيز النهائي من DMSO في MIC لوحة الآبار ليس أكبر من 1٪. DMSO هو بلوري ولذا، فإن استخدام الزجاجات القديمة من DMSO لconsideratايون فيما يتعلق dalbavancin الذوبان. ومع ذلك، في حين أظهرت دراسة BMD صغيرة مع سلالات مراقبة الجودة هذا لا يجب أن يكون متغير مهم (انظر القسم النتائج)، ومن الممارسات الجيدة لاستخدام زجاجات جديدة أو فتح مؤخرا من DMSO. ومن المهم أيضا أن P80 يضاف إلى المرق في الخطوة الأخيرة من الإعداد تخفيف المخدرات وغير بتركيز نهائي من 0.002٪ في MIC جيدا.
الإجراء BMD المضمنة هنا يستخدم إعداد لوحات MIC باستخدام 50 ميكرولتر / جيد في dalbavancin وP-80 تركيزات مرتين على التركيز النهائي وإضافة اللقاح مع 50 ميكرولتر / جيد بحيث الحجم النهائي / هو من 100 ميكرولتر. يسمح هذا الأسلوب للتنسيق لوحة واحدة MIC إلى أن يتم إنتاجها لاختبار كلا S. الذهبية وS. الرئوية لأنه لا يمكن أن تضاف الحصان الدم هي lysed إلى اللقاح. طرق بديلة لإعداد لوحات MIC باستخدام 100 ميكرولتر / جيد مع إضافة ما يصل إلى 10 ميكرولتر / جيد موصوفة فيCLSI وISO الإجراءات.
وتوقف عرضة dalbavancin لS. العنقودية الذهبية هي ≤0.12 ميكروغرام / مل (FDA حزمة إدراج). كما هو مبين في المراقبة الأخيرة، وتحول دون غالبية العزلات التي كتبها dalbavancin عند مستويات 0.06 ميكروغرام / مل 15. مع نقطة توقف عرضة بالقرب من MIC مشروط، أي الاختلاف في هيئة التصنيع العسكري نتيجة للاختلافات طريقة يمكن أن تؤثر على معدلات الحساسية. لأن الإجراء BMD لdalbavancin يتضمن بعض الخطوات فريدة من نوعها (على وجه التحديد، واستخدام DMSO في إعداد الأوراق المالية والتخفيفات المخدرات وسيطة و 0.002٪ P80 في MIC جيدا، فمن الضروري أن يتبع طريقة بالضبط. الكائن S. الذهبية QC (آي تي سي سي 29213) مع واضحة جدا MIC dalbavancin مشروط من 0.06 ميكروغرام / مل، فقد كان مؤشرا جيدا على طريقة الاختلاف وينبغي أن تستخدم بشكل روتيني للتحقق من صحة طريقة BMD. إذا كانت النتائج هي هيئة التصنيع العسكري مع النطاق المتوقع من 0،03-0،12 ميكروغرام / مل، ولكن تتجه إما إلى انخفاض أو المهزومةح جانب من هذا النطاق، يوجد ما يبرر مواصلة التحقق من صحة هذه الطريقة.
يوصى بإضافة 0.002٪ P80 لجميع الكائنات موجبة الجرام ذات الصلة (staphylococcci، المكورات المعوية، والمكورات العقدية). ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أنه قد ثبت أن هي lysed حصان الدم يعمل على غرار P-80 بالنسبة لسياستها المعادية ملزم القدرة وأن إضافة P-80 إلى CAMHB + LHB لا يوجد لديه تأثير إضافي على dalbavancin العقديات النتائج هيئة التصنيع العسكري.
لا يوجد حاليا أي طريقة نشر القرص لاختبار dalbavancin وبسبب الارتباط الضعيف لBMD والنتائج AD، اختبار الحساسية من dalbavancin باستخدام طريقة AD لا ينصح 12، 14. طريقة BMD ينبغي أن تستخدم لتقييم المستقبل dalbavancin الحساسية وكمعيار الذهب للتنمية التجارية اختبارات الحساسية المضادة للميكروبات.
Disclosures
ساندرا مكوردي هو موظف من Durata التداوي. المتخصصين المختبرات، وشركة، صاحب العمل لورا Koeth وجينا فيشر، تم التعاقد من قبل Durata التداوي لإعداد المخطوطة. تم دفع رسوم النشر لهذه المادة من قبل اختصاصيي المختبرات، وشركة
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dalbavancin | Metrics, Inc. | Greenville, NC | BI-397 |
| Vancomycin | Sigma-Aldrich | St. Louis, MO | C5793 |
| Cation Adjusted Mueller Hinton Broth | Becton Dickinson | Sparks, MD | 212322 |
| Lysed horse blood | Cleveland Scientific | Bath, OH | |
| Dose-it peristaltic pump | Integra Biosciences | Hudson, NH | |
| Multi-channel pipet (Viaflo II) | Integra | Hudson, NH | 4164 |
| 12 channel pipet (Matrix) | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
| Single channelpPipets (Ovation 10 µl - 100 µl) | VistaLab | Brewster, NY | |
| 96 well microplate | Greiner Bio-one | Monroe, NC | 650161 |
| 50 ml flat cap conical bottom centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
| 16x125 mm disposable glass tubes | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
| 12x17 mm snap cap, polystyrene tubes | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
| 16 ml centrifuge tubes | BioExpress | Kaysville, UT | C-3394-2 |
| Reagent reservoirs | Integra Biosciences | Hudson, NH | 4312 |
| Disposable sterilelLoops (1 µl & 10 µl) | Biologix | Lenexa, KA | 65-0001,65-0010 |
| Tryptic soy agar + 5% sheep blood | Becton Dickinson | Sparks, MD | |
| Incubator (ambient) | Sanyo | ||
| Incubator (5% CO2) | Sanyo | ||
| Analytical balance | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
| Gloves | Kimberly-Clark | 52817 | |
| Lab coats |
References
- Boucher, H. W., et al. Once-weekly dalbavancin versus daily conventional therapy for skin infection. The New England journal of medicine. 370, 2169-2179 (2014).
- M07-A10. Methods for Dilution Antimicrobial Tests for Bacteria that Grow Aerobically.: Approved Standard. , Tenth Edition, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2015).
- M100-S25. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Fifth Informational Supplement. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2015).
- Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems -- Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices -- Part 1: Reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against rapidly growing aerobic bacteria involved in infectious diseases. ISO/FDIS. 20776-1, International Organization for Standardization. (2006).
- Jones, R. N., Farrell, D. J., Flamm, R. K., Sader, H. S., Dunne, M. W., Mendes, R. E. Surrogate analysis of vancomycin to predict susceptible categorization of dalbavancin. Diagn Microbiol Infect Dis. , (2015).
- Turnidge, J., Paterson, D. L. Setting and revising antibacterial susceptibility breakpoints. Clinical microbiology reviews. 20, 391-408 (2007).
- Rennie, R. P., et al. Factors influencing broth microdilution antimicrobial susceptibility test results for dalbavancin, a new glycopeptide agent. Journal of clinical microbiology. 45, 3151-3154 (2007).
- Arhin, F. F., et al. Effect of polysorbate 80 on oritavancin binding to plastic surfaces: implications for susceptibility testing. Antimicrobial agents and chemotherapy. 52, 1597-1603 (2008).
- Farrell, D. J., Mendes, R. E., Rhomberg, P. R., Jones, R. N. Revised reference broth microdilution method for testing telavancin: effect on MIC results and correlation with other testing methodologies. Antimicrobial agents and chemotherapy. 58, 5547-5551 (2014).
- Ribbon Panel, B. lue Guidelines for Safe Work Practices in Human and Animal Medical Diagnostic Laboratories. MMWR Supplements. 61 (01), 1-101 (2012).
- Anderegg, T. R., Biedenbach, D. J., Jones, R. N. Initial quality control evaluations for susceptibility testing of Dalbavancin (BI397), an investigational glycopeptide with potent gram-positive activity. Journal of clinical microbiology. 41, 2795-2796 (2003).
- Koeth, L. M., Windau, A. R., Goldstein, B. P. Comparison of Broth Microdilution and Agar Dilution Dalbavancin and Vancomycin MIC Results for 42 Aerobic Gram-positive Bacteria. Poster 132. ASM. , San Francisco, CA. (2012).
- Fritsche, T. R., Rennie, R. P., Goldstein, B. P., Jones, R. N. Comparison of dalbavancin MIC values determined by Etest (AB BIODISK) and reference dilution methods using gram-positive organisms. Journal of clinical microbiology. 44, 2988-2990 (2006).
- Mushtaq, S., Warner, M., Johnson, A. P., Livermore, D. M. Activity of dalbavancin against staphylococci and streptococci, assessed by BSAC and NCCLS agar dilution methods. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 54, 617-620 (2004).
- Jones, R. N., Flamm, R. K., Sader, H. S. Surveillance of dalbavancin potency and spectrum in the United States (2012). Diagnostic microbiology and infectious disease. 76, 122-123 (2013).
