Abstract
Test for antimikrobiel følsomhed (AST) udføres for at vurdere in vitro aktiviteten af antimikrobielle midler mod forskellige bakterier. De AST resultater, som er udtrykt ved mindste hæmmende koncentrationer (MIC) anvendes i forskning for antimikrobiel udvikling og overvågning af udviklingen modstand og i kliniske omgivelser for antimikrobiel terapi vejledning. Dalbavancin er en semi-syntetisk lipoglycopeptide antimikrobielt middel, der blev godkendt i maj 2014 ved Food and Drug Administration (FDA) til behandling af akutte bakterielle hud og hud struktur infektioner forårsaget af grampositive organismer. Fordelen ved dalbavancin i forhold til nuværende anti-stafylokok-behandlinger er dets lange halveringstid, hvilket muliggør en gang ugentlig. Dalbavancin har aktivitet mod Staphylococcus aureus (herunder både methicillin-følsomme S. aureus [MSSA] og methicillin-resistente S. aureus [MRSA]), koagulase-negative stafylokokker,
Introduction
Dalbavancin er en semi-syntetisk lipoglycopeptide, der blev godkendt af FDA maj 2014 til behandling af akutte bakterielle hud og hud struktur infektioner forårsaget af grampositive organismer 1. Det primære mål for detaljering af denne metode i en video-format er at give klare retningslinjer for de kliniske laboratorie- og forskere til test og rapportering af nøjagtige og reproducerbare dalbavancin modtagelighed resultater.
Fastsættelsen af et antimikrobielt middel MIC af kommercielle metoder rutinemæssigt udføres i kliniske laboratorier til vurdering af en agents in vitro aktivitet mod sygdomsfremkaldende bakterier. Den her beskrevne fremgangsmåde er bouillon mikrofortynding fremgangsmåden som anbefalet af CLSI og ISO 2,3,4. Siden dalbavancin kommercielle modtagelighed metoder er i øjeblikket ikke tilgængelig (på tidspunktet for denne publikation) og disk diffusion og agar fortyndingsmetoder er i øjeblikket ikke anbefales feller dalbavancin, henvisning bouillon fortynding metoder er de aktuelle muligheder 12,14. Da denne referencemetode er ikke et kommercielt og FDA ryddet in vitro diagnostisk metode, kliniske laboratorier i USA, der bruger denne procedure for patient test skal overholde lovgivningsmæssige krav til et laboratorium udviklet test (LDT). Det forventes, at de dalbavancin brug stiger, vil flere laboratorier har behov for at teste denne forbindelse. Vancomycin prøvning som et surrogat for bestemmelse af dalbavancin modtagelighed S. aureus er blevet valideret 5. Dog kan dalbavancin være aktive mod vancomycin mellemprodukt S. aureus (VISA), og derfor kan klinikere anmode dalbavancin MIC resultater. Derudover kan MIC resultater for andre bakteriearter blive anmodet om.
FDA modtagelige breakpoint for dalbavancin mod S. aureus er blevet etableret på ≤0.12 pg / ml. FDA tildelt kun susceptible kategori på grund af manglen på data om resistente isolater. Den normale MIC fordeling blandt vildtype S. aureus isolater er mellem 0,03 til 0,12 ug / ml, med en klar modal MIC på 0,06 ug / ml. En lille variation i MIC resultater på grund af metode forskel, ud over den iboende BMD variation på ± én fortynding, potentielt kunne have en betydelig indvirkning på modtagelighed satser. 6 I lighed med andre lipoglycopeptide agenter, kan dalbavancin følsomhedsbestemmelse være udfordrende som følge af opløselighed og den relativt store størrelse af molekylet og dets bindingsegenskaber 7,8,9. Henvisningen BMD-metoden beskrevet her indeholder to specifikke skridt, der er unikke for uopløselige stoffer og / eller lipoglycopeptide agenter: (1) brugen af DMSO til fremstilling af stamopløsninger og (2) tilsætning af 0,002% P-80 i den endelige MIC-panelet fortyndinger. Formålet med denne video publikation er at skabe klarhed til dalbavancin BMD-metoden og til specifikally fokusere på disse vigtige skridt, for at sikre nøjagtige og reproducerbare MIC resultater.
Protocol
BEMÆRK: Se CLSI dokumenter M7-A10 og M100-S25 og / eller ISO / FDIS 20776-1 for alle oplysninger om referencen bouillon mikrofortynding metode for antimikrobiel følsomhed 2, 3, 4 Referencemetoderne tillader muligheder i nogle af de. procedurer specifikke for inokulum forberedelse og MIC panel produktionen for at opnå samme slutresultat. Metoden beskrevet her vedrører én antimikrobielt middel, dalbavancin, og nogle af de trin repræsenterer en af potentielt flere måder referencen procedure kan gøres. Forholdsregler Passende sikkerhedsforanstaltninger (i overensstemmelse med biosikkerhed niveau 2) bør udnyttes 10. MIC panel format, der bruges i forbindelse med denne video offentliggørelse er vist i tabel 1.
1. Store dalbavancin Powder
- Ved modtagelse af diagnostisk kvalitet dalbavancin pulver, opbevares ved -20 ° C i en udtørret miljø i en ikke-afrimning fryser. Før brug skal pulveret ækvilibrere tilnå RT før åbning.
2. Forbered MIC Panel Fortyndinger
- Forbered en stamopløsning ikke højere end 1.600 mg / ml dalbavancin i pæn (ren) DMSO i sterile glas eller plast rør, og brug på samme dag forberedelse eller opbevares ved -20 til -60 ° C eller derunder til fremtidig brug i en ikke-afrimning fryser. Tag hensyn til styrken af dalbavancin som fastsat af den modtagne med pulveret dokumentation, når der vejer pulveret (se ligning 1 for eksempel 800 pg / ml lager forberedelse).
- Fortynd stock fortynding svarende til den som er vist i kolonne 1 ("Source Concentration") i tabel 2 med ren DMSO i sterile glas- eller plastrør. Brug en pipette til måling fortyndingsmiddel og anden pipette til tilsætning af oprindelige dalbavancin lager til det første rør. For hvert efterfølgende dalbavancin stamkoncentration bruge en ny pipette.
- Forbered 100X endelige MIC panel concentration fortyndinger (mellemliggende koncentrationer) med pæn DMSO. Som det er vist i kolonne 2-4 i tabel 2, kombinere passende mængder af kilden og DMSO for at opnå ønskede mellemprodukt koncentration (mængder, der skal anvendes, vil afhænge af antallet af MIC paneler, der skal foretages).
- Forbered 0,004% P80: Forbered en frisk arbejder stamopløsning på 2% P80 ved at tilføje 0,1 ml P80 til 4,9 ml dH 2 O. Der steriliseres ved passage gennem et 0,22 mikron filter og brugsopløsning på samme dag forberedelse. Forbered 0,004% P80 fortyndingsmiddel ved at lave en 1: 500 fortynding af 2% P80 (f.eks 0,3 ml 2% P80 til 149,7 ml CAMHB).
- Fortynd de mellemliggende koncentrationer fremstillet i trin 2.2 1: 100 i kation justeres Mueller Hinton bouillon (CAMHB) suppleret med 0,004% (v / v) polysorbat-80 (P-80) P-80 og / eller LHB (for streptokokker) blev tilsat det dobbelte af den koncentration, fordi endelige tilsætning af inokulum (trin 4.3) vil resultere i en 1: 2 fortynding. Se kolonne 6 og 7 i tabel 2
3. Forbered MIC Paneler
- Dispensér 50 pi af hver opløsning dalbavancin fremstillet i trin 2.3 i passende brønde i MIC panelet og omfatter kun mediet i en brønd (vækstregulering brønd). En multikanal-pipette med sterile pipettespidser kan anvendes til dette trin.
- Brug paneler straks eller forsegle med plastfilm, sted i plastposer og straks sted i en ikke-afrimning fryser ved ≤-20 ° C (fortrinsvis ved ≤-60 ° C) indtil brug. Hvis der anvendes frosne paneler, fjerne forseglinger og placere de enkelte paneler på lab bænk i 15-30 min (indtil godt indhold er optøet) før du fortsætter til panelet podning.
4. podes MIC Paneler, Udfør Renhed og opsætning kimtal
- Vælg flere velisolerede kolonier fra en 18-24 timer blodagar eller andre ikke-selektiv agarplade. Tryk på toppen af hver koloni med en steril loop eller vatpind og overførsel til 1-5 ml CAMHB eller saline indtil turbiditet svarer til en 0,5 McFarland standard. Vurdere turbiditeten ved visuel sammenligning med 0,5 McFarland eller med en fotometrisk indretning.
- Inden for 15-30 min efter fremstilling, fortynde inokulum 1: 100 i CAMHB (100 pi til 10 ml CAMHB). For de fleste testet over dalbavancin bakterier, med undtagelse af S. pneumoniae, vil denne fortynding give en endelig godt koncentration på 5 x 10 5 CFU / ml (acceptabelt område er 2-8 x 10 5 CFU / ml). For S. pneumoniae, bakteriel koncentration baseret på sammenligning af turbiditet til en 0,5 McFarland er typisk betydeligt mindre, derfor fortynde inokulum 1:25 (400 pi i 10 ml CAMHB + 10% + LHB).
- Inden for 15 min efter Inokulum, overføres 50 pi det endelige inoculum til hver brønd (med undtagelse af sterilitet kontrol brønd) MIC panel fremstillet i trin 3. En multikanal-pipette sterile pipettespidser kan anvendes til dette trin.
- Udfør en renhed kontrolved at overføre og spreder en 1-10 pi alikvot fra den positive vækstkontrol brønd med en steril løkke til en ikke-selektiv agar (f.eks trypticase agar med 5% fåreblod).
- Opsætning kimtal ved at fjerne 10 ul fra vækstkontrollen godt med en enkelt kanal pipette og sterilt spids og overførsel til 10 ml saltvand (1: 1000 fortynding). Bland og overføre 100 pi med en enkelt pipette kanal og sterile tip til en egnet, ikke-selektivt agarmedium (f.eks trypticase agar med 5% fåreblod) og strækker sig over hele agaroverfladen med en steril løkke, gentage to gange i forskellige retninger for at sikre en jævn fordeling af inoculum (1:10 fortynding).
5. Inkuber MIC Paneler, kimtal og renhed Plader
- Forsegle hver MIC panel eller stak af ikke mere end 4 paneler i en plastikpose, med plastik tape eller med en tætsiddende plastlåg før inkubering. Alternativt kan placere tom MIC panel på top af stakken af ikke mere end 4 MIC paneler, placere en fugtig køkkenrulle i en plastikbeholder, sted MIC paneler i plastikbeholder og tæt beholder sikkert med låg.
- Inkubér MIC paneler i en omgivende luft inkubator ved 35 ° C ± 2 ° C i 16-20 timer (stafylokokker og enterokokker), og 20-24 timer (streptokokker) inden for 30 minutter af podning. Inkubér kimtal og renhed plader under de samme betingelser, bortset fra inkuberes streptokokker i en 5% CO2-inkubator.
6. Læs MIC og Colony Count Plader; Tjek Renhed Plate
- Læs MIC som den laveste koncentration, der fuldstændig hæmmer bakterievækst i brøndene som detekteret ved det blotte øje.
- Tæl kolonier på kolonien tæller pladen. Multipliceres hver koloni med fortyndingsfaktoren (1: 10.000) (f.eks 50 kolonier svarer til 5 x 10 5 CFU / ml). Et acceptabelt interval er 20-80 kolonier (2-8 x 10 5 CFU / ml) og anvendes som en hensigtsximate retningslinje.
- Tjek renhed plade. Hvis alle kolonier svarer til kolonierne anvendt i trin 4.1, så inoculum kan betragtes rent. Hvis der er nogen andre kolonier til stede, så der er potentiale for et forurenende stof til at være til stede i MIC-panelet, og testen skal gentages.
7. Kontrollér kvalitetskontrolresultater.
- Der henvises til tabel 3 for de forventede intervaller af CLSI kvalitetskontrol stammer. Kun rapporterer resultater af test isolater hvis dalbavancin MIC resultater for kvalitetskontrol organisme (e) er inden for det forventede område.
- Hvis en MIC på ≥0.25 ug / ml opnås for enhver klinisk S. aureus isolere, gentag dalbavancin MIC test og / eller sende til et referencelaboratorium til kontrol.
Representative Results
Standardiserede MIC metoder er nødvendige for at overvåge udviklingen modstand, et vigtigt mål af forskellige antimikrobielle overvågningsprogrammer. Dalbavancin MIC resultater for isolater indsamlet i Europa og USA i 2011-2013 var <0,25 mg / ml for 99,9% af S. aureus og 100% af streptokokker (tabel 4).
For at vurdere betydningen af at bruge frisk (forseglet) DMSO, tredobbelt test af dalbavancin BMD MIC'er for QC-stammer S. aureus ATCC 29213, og E. faecalis ATCC 29212 og duplikere testning for S. pneumoniae ATCC 49619 blev udført under anvendelse af (1) DMSO fra lukkede ampuller, (2) DMSO fra en 1 L flaske, der var inden udløbsdatoen og havde været anvendt tidligere til 2 år og (3) en alikvot af DMSO fra den samme 1 l flaske (prøve 2), der fik lov til at sidde i et åbent bægerglas i 72 timer før brug. Dalbavancin MIC resultater ved hjælp af paneler lavet med alle tre DMSO prøver var ens og wnden de acceptable QC intervaller (tabel 5).
Tabet af dalbavancin aktivitet efter eksponering af stamopløsning til plast og uden tilsætning af P-80 er veldokumenteret 7. I 2 yderligere undersøgelser, tilsætning af P-80 til de indledende og mellemliggende stamopløsninger (tabel 6) og anvendelse af glas- eller plastrør til fremstilling af de indledende og mellemliggende stamopløsninger (tabel 7) ikke har en effekt på de dalbavancin MIC resultater. Der var heller ingen effekt på dalbavancin MIC resultater, når polypropylen og polystyren plader fra tre producenter blev anvendt (tabel 7).
Tilstedeværelsen af lyseret hesteblod i bouillon medier til afprøvning af streptokokker har vist sig at have et overfladeaktivt middel-lignende aktivitet, der kan sammenlignes med P-80 7, 8. Den dalbavancin referencemetode til streptococcus ikke omfatte både P-80 og lyseret hesteblod ,Men i modsætning stafylokokker og enterokokker, dalbavancin MIC resultater for streptokokker er ens (inden for +/- 1 fortynding) med og uden tilsætning af P-80.
Som tidligere er blevet fremlagt og vist i figur 1, dalbavancin agarfortynding (AD) MIC'er er typisk 2-8 gange højere sammenlignet med den nuværende BMD henvisningen 12, 13, 14. I modsætning til BMD, tilsætning af 0,002% P-80 ikke påvirker dalbavancin AD MIC resultater 12.
Ligning 1: Eksempel på dalbavancin stamopløsning Forberedelse Forberedelse trin for 25 ml 800 mg / ml dalbavancin løsning..
Figur 1. Sammenligning af dalbavancin og vancomycin BMD til AD. Resultater af undersøgelse, som sammenlignede dalbavancin og vancomycin BMD og AD MIC resultater for udvalgte Gram-positive bakterielle isolater. Gennemsnit (A) dalbavancin og (B) Vancomycin Broth mikrofortynding og agarfortynding MIC Resultater i ug / ml for 15 Staphylococcus aureus, 8 koagulase-negative stafylokokker (CNS), 5 Enterococcus faecalis og 14 streptokokker (gruppe A, B og C). Klik her for at se en større version af dette tal.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| En | DAL 0,002 | DAL 0,004 | DAL 0,008 | DAL 0,015 | Dal 0.03 | DAL; 0,06 | DAL 0.12 | DAL 0.25 | DAL 0.5 | DAL 1 | DAL 2 | Pos Ctrl. |
| B | DAL 0,002 | DAL 0,004 | DAL 0,008 | DAL 0,015 | Dal 0.03 | DAL 0,06 | DAL 0.12 | DAL 0.25 | DAL 0.5 | DAL 1 | DAL 2 | Pos Ctrl. |
| C | DAL 0,002 | DAL 0,004 | DAL 0,008 | DAL 0,015 | Dal 0.03 | DAL 0,06 | DAL0.12 | DAL 0.25 | DAL 0.5 | DAL 1 | DAL 2 | Pos Ctrl. |
| D | DAL 0,002 | DAL 0,004 | DAL 0,008 | DAL 0,015 | Dal 0.03 | DAL 0,06 | DAL 0.12 | DAL 0.25 | DAL 0.5 | DAL 1 | DAL 2 | Pos Ctrl. |
| E | DAL 0,002 | DAL 0,004 | DAL 0,008 | DAL 0,015 | Dal 0.03 | DAL 0,06 | DAL 0.12 | DAL 0.25 DAL 0.5 | DAL 1 | DAL 2 | Pos Ctrl. | |
| F | DAL 0,002 | DAL 0,004 | DAL 0,008 | DAL 0,015 | Dal 0.03 | DAL 0,06 | DAL 0.12 | DAL 0.25 | DAL 0.5 | DAL 1 | DAL 2 | Pos Ctrl. |
| G | DAL 0,002 | DAL 0,004 | DAL 0,008 | DAL 0,015 | Dal 0.03 | DAL 0,06 | DAL 0.12 | DAL 0.25 | DAL 0.5 | DAL 1 | DAL 2 | Pos Ctrl. |
| H | DAL 0,002 | DAL 0,004 | DAL 0,008 | DAL 0,015 | Dal 0.03 | DAL 0,06 | DAL 0.12 | DAL 0.25 | DAL 0.5 | DAL 1 | DAL 2 | Pos Ctrl. |
| DAL | Dalbavancin | |||||||||||
| Koncentrationer er angivet i ug / ml efter 50 pl / brønd inokulering | ||||||||||||
Tabel 1. MIC pladeformat. Den 96 brønds plade-format, der viser placeringen af dalbavancin fortyndinger og positive kontrolbrønde bruges som eksempel i denne video publikation
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| Kilde Konc. (ug / ml) | Volumen Kilde (ml) | Volumen DMSO (ml) | Intermediate Konc. i DMSO (ug / ml) | Volumen Intermediate Konc. (ml) | Volume CAMHB + 0,004% P80 * (ml) | 2X Konc. Efter 1: 100 fortynding i CAMHB (ug / ml) | Final Panel Konc. Efter inokulering (ug / ml) |
| 800 | 1,0 | 1,0 | 400 | 0.02 | 1,98 | 4 | 2 |
| 400 | 0,5 | 0,5 | 200 | 0.02 | 1,98 | 2 | 1 |
| 400 | 0,5 | 1.5 | 100 | 0.02 | 1,98 | 1 | 0,5 |
| 400 | 0,5 | 3,5 | 50 | 0.02 | 1,98 | 0,5 | 0.25 |
| 50 | 0,5 | 0,5 | 25 | 0.02 | 1,98 | 0.25 | 0,125 |
| 50 | 0,5 | 1.5 | 12.5 | 0.02 | 1,98 | 0,125 | 0,06 |
| 50 | 0,5 | 3,5 | 6.25 | 0.02 | 1,98 | 0,06 | 0.03 |
| 6.25 | 0.5 </ td> | 0,5 | 3.13 | 0.02 | 1,98 | 0.03 | 0,015 |
| 6.25 | 0,5 | 1.5 | 1.5 | 0.02 | 1,98 | 0,015 | 0,008 |
| 6.25 | 0,5 | 3,5 | 0,8 | 0.02 | 1,98 | 0,008 | 0,004 |
| 0,8 | 0,5 | 0,5 | 0,4 | 0.02 | 1,98 | 0,004 | 0,002 |
| Denne tabel er blevet ændret fra CLSI M100-S25, Tabel 8B 3 | |||||||
Tabel 2. Ordning for Forberedelse Fortyndinger af vanduopløselige antimikrobielle stoffer for at blive brugt i bouillon Fortyndinger resistensbestemmelse. Mængden af dalbavancin arbejder løsninger og fortyndere til forberedelse af den endelige MICdalbavancin opløsninger af 0,002-2 ug / ml.
| Kvalitetskontrol Strain | Forventet dalbavancin MIC (ug / ml) |
| S. aureus ATCC 29213 | 0,03-0,12 |
| E. faecalis ATCC 29212 | 0,03-0,12 |
| S. pneumoniae ATCC 49619 | 0,008-0,03 |
Tabel 3. Forventet dalbavancin MIC Resultater for Kvalitet kontrolstammer 3, 11. CLSI kvalitetskontrolresultater for foreslåede stammer, der skal testes sammen med kliniske isolater for at verificere korrekt metode
Tabel 4. Fordeling af dalbavancin MIC Resultater (Antal ved hvert MIC) fra USA og Europa 2011-2013 Surveillstemmelse Study 15. Dalbavancin MIC resultater fra en publiceret undersøgelse af de seneste kliniske isolater som en indikator for aktuelle dalbavancin in vitro-aktivitet.
| Isoler # | Dalbavancin MIC (ug / ml) | ||
| DMSO 1 | DMSO 2 | DMSO 3 | |
| S. aureus ATCC 29213 | 0.12 | 0,06 | 0,06 |
| 0.12 | 0,06 | 0,06 | |
| 0,06 | 0,06 | 0,06 | |
| E. faecalis ATCC 29212 | 0,06 | 0,06 | 0,06 |
| 0,06 | 0,06 | 0,06 | |
| 0,06 | 0,06 | 0,06 | |
| 0,015 | 0,015 | 0,015 | |
| 0.03 | 0,015 | 0,015 | |
| DMSO 1 = Uåbnet flamme forseglet 10 ml ampuller | |||
| DMSO 2 = Ofte åbnet 1L flaske | |||
| DMSO 3 = Ofte åbnet 1L flaske - sad på bænken i udækkede bæger i 72 timer | |||
Tabel 5. dalbavancin MIC Resultater (pg / ml) ved hjælp af DMSO Stock og Intermediate Fortyndinger Forberedelse med DMSO fra 3 Kilder. Resultater af en dalbavancin MIC undersøgelse, som sammenlignede effekten af at anvende forskellige DMSO opløsningsmidler i udarbejdelsen af dalbavancin materiel og mellemliggende fortyndinger.
| Isoler Antal | Gentagne Antal | Dalbavancin MIC (ug / ml) | |
| DALB w / P80 i DMSO | DALB w / o P80 i DMSO | ||
| S. aureus ATCC 29213 | 1 | 0,06 | 0,06 |
| 2 | 0,06 | 0,06 | |
| 3 | 0,06 | 0,06 | |
| 4 | 0,06 | 0,06 | |
| S. aureus klinisk DP80-002SA | 1 | 0.03 | 0.03 |
| S. aureus ATCC 700.699 | 1 | 0,5 | 0,5 |
| S. pneumoniae ATCC 49619 | 1 | 0.03 | 0,015 |
| 2 | 0.03 | 0,015 | |
| 3 | 0.03 | 0,015 | |
| 4 | 0.03 | 0,015 | |
| S. pyogenes kliniske: | |||
| DP80-004PY | 1 | 0,015 | 0,015 |
| DP80-005PY | 1 | 0.03 | 0.03 |
| DP80-006PY | 1 | 0.03 | 0,015 |
| DP80-007PY | 1 | 0,06 | 0.03 |
| DP80-008PY | 1 | 0.03 | 0,015 |
| S. agalactiae klinisk: | |||
| DP80-009AG | 1 | 0,06 | 0.12 |
| DP80-010AG | 1 | 0,06 | 0.03 |
| DP80-011AG | 1 | 0,06 | 0,06 |
| DP80-012AG | 1 | 0,06 | 0,06 |
| S. dysgalactiae kli-cal DP80-013DY | 1 | 0.03 | 0.03 |
| S. pneumoniae kliniske: | |||
| DP80-014SP | 1 | 0,06 | 0,06 |
| DP80-015SP | 1 | 0.03 | 0.03 |
| DP80-016SP | 1 | 0.03 | 0.03 |
| DP80-017SP | 1 | 0,06 | 0,06 |
Tabel 6. dalbavancin MIC resultater ved hjælp af DMSO Stock og Intermediate Fortyndinger Forberedelse med og uden 0,002% P-80. Resultater af en dalbavancin MIC undersøgelse, som sammenlignede effekten af at tilsætte 0,002% P-80 til dalbavancin lager og mellemliggende fortyndinger.
| Isoler | Gentagne Antal Stock Fortynding Tubes | Mikrotiterplade (plasttype) | |||||||
| Poly-propylen, Greiner | Polystyren | ||||||||
| Glas | Plastic | Plastic 1 time | Plastic 1 time / Intermediate 1 time | Greiner | Corning | Nunc | |||
| S. aureus ATCC 29213 | 1 | 0,06 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0,06 | 0.03 | 0,06 | 0.03 |
| 2 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0,06 | |
| 3 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | |
| E. faecalis ATCC 29212 | 0,06 | 0,06 | 0,06 | 0,06 | 0.03 | 0.03 | 0,06 | 0.03 | |
| 2 | 0,06 | 0,06 | 0,06 | 0,06 | 0.03 | 0.03 | 0,06 | 0.03 | |
| 3 | 0,06 | 0,06 | 0,06 | 0,06 | 0.03 | 0.03 | 0,06 | 0.03 | |
| S. pneumoniae ATCC 49619 | 1 | 0,015 | 0,015 | 0,015 | 0,015 | 0,008 | 0,008 | 0,008 | 0,008 |
| 2 | 0,015 | 0,015 | 0,015 | 0,015 | 0,008 | 0,015 | 0,008 | 0,008 | |
| Glas = Initial bestand lavet i glasflaske, anvendes straks at gøre mellemliggende koncentrations i plastrør, der anvendes straks at gøre bouillon fortyndinger. | |||||||||
| Plastic = Initial bestand lavet i plastik centrifugerør, anvendes straks at foretage mellemliggende koncentrationer i plastrør, der anvendes straks at gøre bouillon fortyndinger. | |||||||||
| Plastic 1 hr = startbeholdningen fremstillet i plast centrifugerør, lad det sidde på bænken i 1 time og derefter anvendt til at fremstille mellemprodukter koncentrationer i plastrør, der anvendes straks at gøre koncentrationer i bouillon. | |||||||||
| Plastic 1 time / Intermediate 1 hr = startbeholdningen fremstillet i plast centrifugerør, lad det sidde på bænken i 1 time og derefter anvendt til at fremstille mellemprodukter koncentrationer i plastrør, lad det sidde på bænken i 1 time og derefter bruges til at lave koncentrationer i bouillon. | |||||||||
Tabel 7. dalbavancin MIC resultater ved hjælp af Stock Fortyndinger Forberedelse i plast og glas Rør og MIC Plate plasttyper. Resultater ofa dalbavancin MIC undersøgelse, som sammenlignede effekten af at bruge plastik eller glasrør ved udarbejdelsen af stamopløsninger og også effekten af at anvende forskellige kilder og typer af plast til mikrotiterplader.
Discussion
Følgende metode detaljer præsenteres for yderligere overvejelser, når forberedelserne til dalbavancin MIC test. Udformningen af MIC panel vil afhænge af antallet af antimikrobielle stoffer, der skal testes (dvs.., Dalbavancin alene eller flere midler) og bakteriearter, der skal testes. De dalbavancin koncentrationer bør omfatte de fortolkende breakpoints for alle bakteriearter, der skal testes, og hele spektret af fortyndinger forventes for mindst et QC stamme. Den antimikrobielle fortyndingsrække kan organiseres enten i rækker eller kolonner afhængigt af antallet af antimikrobielle stoffer og / eller isolater / plade og en fremgangsmåde til podning. Mængden af dalbavancin pulver og bouillon bør beregnes at sikre, at optimale mængder produceres og affald er minimal. For anvendt i denne publikation eksempel mængder baseret på udarbejdelse af to MIC paneler. Kation justeret Mueller Hinton bouillon bør være forberedt og autoklaveres efter mandufacturer anvisninger og sterilitet medierne verificeres. MIC paneler kan foretages og bruges på samme dag som forberedelse eller de kan blive testet med passende kvalitetskontrol organismer og de validerede paneler lagrede frosset til fremtidig brug. Det er vigtigt at anvende sterile teknikker under hele proceduren.
Der er ingen strenge kriterier for kontrol af inokulum koncentration med kolonitællinger. Kolonitællinger kan begynde med tjekket for hver afprøvet og / eller periodisk at validere fortyndingstrinnet udføres i trin 4.2 arter. Det er vigtigt, at gyldigheden af den 0,5 McFarland standard også kontrolleres rutinemæssigt med E. coli ATCC 25922 under anvendelse af en fremgangsmåde svarende til trin 4.5. Hvis resultaterne ikke svarer til 1-2 x 10 8 CFU / ml, en ny 0,5 McFarland standard bør indhentes. Hvis kolonitællinger fra MIC brønde er uden for det acceptable område (2-8 x 10 5 CFU / ml og MIC resultater for klinisk isolat (s) varierer fra the forventede normalfordeling (f.eks. fra 0,03 til 0,12 ug / ml for S. aureus) og / eller MIC resultater for kvalitetskontrol isolat (e) er uden for forventede områder, er det nødvendigt validering afprøvning og metode modifikation kan være berettiget. Det foreslås, at en valideret 0,5 McFarland standard anvendes til at gentage kimtal (r), og hvis resultater er igen uden for forventede resultater, bør inokulum fortynding som udføres i trin 4.2 justeres og MIC gentages. Bemærk, at en renhed kontrol er nødvendig, selv hvis en kimtal udføres, fordi kolonitælling proceduren bruger en fortyndet volumen, som måske ikke nødvendigvis registrerer lavere koncentrationer af forurenende organismer.
For en MIC test kan anses for gyldig, skal acceptabel vækst forekomme i kontrol væksten godt. For de fleste bakterier, der vil blive testet mod dalbavancin (dvs.., Stafylokokker, streptokokker og enterokokker, væksten vil blive betragtet som en knap (typisk> 2 mm) og mindre frequently, kan væksten vist som turbiditet i brønden. I modsætning til nogle antimikrobielle stoffer, der kan udvise efterfølgende effekt som koncentrationer stiger, bliver dalbavancin endpoints typisk veldefinerede. Der er forskellige visning anordninger beregnet til at lette læsningen mikrofortyndingsplader tests, der kan anvendes til at læse dalbavancin holdige plader, så længe der ikke er nogen kompromis i evnen til at skelne vækst i brøndene.
De kritiske skridt i protokollen er relateret til de dele af den procedure, der er relateret til opløseligheden af dalbavancin og tilsætning af P80. Det er vigtigt, at den maksimale koncentration af dalbavancin anvendes ikke er større end 1.600 ug / ml, at DMSO anvendes som opløsningsmiddel, og at de mellemliggende koncentration fremstilles i DMSO forud for den bouillon fortyndinger, således at slutkoncentrationen af DMSO i MIC Panelet brønde ikke er større end 1%. DMSO er hygroskopisk og derfor anvendelse af ældre flasker DMSO var en consideration med hensyn til dalbavancin opløselighed. Men mens en lille BMD studie med kvalitetskontrol stammer har vist, at dette ikke at være en vigtig variabel (se resultater afsnit), er det god praksis at anvende nye eller nyligt åbnede flasker af DMSO. Det er også vigtigt, at der tilsættes P80 til suppen i det sidste trin af lægemiddel fortynding forberedelse og er ved en slutkoncentration på 0,002% i MIC godt.
Den BMD procedure medtaget her udnytter udarbejdelse af MIC paneler ved hjælp af 50 gl / brønd på dalbavancin og P-80 koncentrationer to gange den endelige koncentration og tilsætning af inokulum med 50 pl / brønd, så den endelige volumen / brønd er 100 pi. Denne metode giver mulighed for en MIC panel format, der skal produceres til afprøvning af både S. aureus og S. pneumoniae fordi lyseret hesteblod kan sættes til podestoffet. Alternative fremgangsmåder til fremstilling af MIC paneler ved hjælp af 100 pl / brønd med tilsætning af op til 10 pl / brønd er beskrevet iCLSI og ISO procedurer.
Den dalbavancin modtagelige breakpoint for S. aureus er ≤0.12 ug / ml (FDA indlægssedlen). Som det fremgår af de seneste overvågning, er de fleste af isolater hæmmet af dalbavancin i niveauer på 0,06 ug / m 15. Med en modtagelig breakpoint tæt på modal MIC, kan enhver variation i MIC som følge af metode forskelle påvirker modtagelighed satser. Fordi BMD procedure for dalbavancin indeholder nogle unikke trin (specifikt anvendelsen af DMSO i fremstilling af materiel og mellemliggende drug fortyndinger og 0,002% P80 i MIC godt, er det bydende nødvendigt, at fremgangsmåden følges nøjagtigt. S. aureus QC organisme (ATCC 29213) med en meget klar dalbavancin modal MIC på 0,06 pg / ml, har været en god indikator for metoden variation og bør anvendes rutinemæssigt at validere BMD-metoden. Hvis MIC resultater er med det forventede udbud af ,03-0,12 pg / ml, men er Trendvisning til enten lav eller HIGh side af dette interval, er yderligere validering af metoden berettiget.
Tilsætning af 0,002% P80 anbefales til alle relevante Gram-positive organismer (staphylococcci, enterokokker og streptokokker.) Det er dog bemærkelsesværdigt, at det er påvist, at lyseret hesteblod virker ligner P-80 i forhold til dets anti-bindende kapacitet og at tilføjelsen af P-80 til CAMHB + LHB har ingen yderligere effekt på dalbavancin streptokokker MIC resultater.
Der er i øjeblikket ingen disk diffusion metode til test dalbavancin og på grund af den ringe korrelation mellem BMD og AD resultater, resistensbestemmelse af dalbavancin hjælp af AD-metoden anbefales ikke 12, 14. Den BMD metode bør anvendes for den fremtidige vurdering af dalbavancin modtagelighed og som en gold standard for udvikling af kommercielle antimikrobielle følsomhedstest.
Disclosures
Sandra McCurdy er ansat i Durata Therapeutics; Laboratorie Specialister, Inc., arbejdsgiver Laura Koeth og Jeanna Fisher, blev indgået af Durata Therapeutics at forberede manuskriptet. Offentliggørelse gebyrer for denne artikel blev betalt af Laboratory Specialister, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dalbavancin | Metrics, Inc. | Greenville, NC | BI-397 |
| Vancomycin | Sigma-Aldrich | St. Louis, MO | C5793 |
| Cation Adjusted Mueller Hinton Broth | Becton Dickinson | Sparks, MD | 212322 |
| Lysed horse blood | Cleveland Scientific | Bath, OH | |
| Dose-it peristaltic pump | Integra Biosciences | Hudson, NH | |
| Multi-channel pipet (Viaflo II) | Integra | Hudson, NH | 4164 |
| 12 channel pipet (Matrix) | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
| Single channelpPipets (Ovation 10 µl - 100 µl) | VistaLab | Brewster, NY | |
| 96 well microplate | Greiner Bio-one | Monroe, NC | 650161 |
| 50 ml flat cap conical bottom centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
| 16x125 mm disposable glass tubes | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
| 12x17 mm snap cap, polystyrene tubes | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
| 16 ml centrifuge tubes | BioExpress | Kaysville, UT | C-3394-2 |
| Reagent reservoirs | Integra Biosciences | Hudson, NH | 4312 |
| Disposable sterilelLoops (1 µl & 10 µl) | Biologix | Lenexa, KA | 65-0001,65-0010 |
| Tryptic soy agar + 5% sheep blood | Becton Dickinson | Sparks, MD | |
| Incubator (ambient) | Sanyo | ||
| Incubator (5% CO2) | Sanyo | ||
| Analytical balance | ThermoFisher Scientific | Waltham, MA | |
| Gloves | Kimberly-Clark | 52817 | |
| Lab coats |
References
- Boucher, H. W., et al. Once-weekly dalbavancin versus daily conventional therapy for skin infection. The New England journal of medicine. 370, 2169-2179 (2014).
- M07-A10. Methods for Dilution Antimicrobial Tests for Bacteria that Grow Aerobically.: Approved Standard. , Tenth Edition, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2015).
- M100-S25. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Fifth Informational Supplement. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2015).
- Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems -- Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices -- Part 1: Reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against rapidly growing aerobic bacteria involved in infectious diseases. ISO/FDIS. 20776-1, International Organization for Standardization. (2006).
- Jones, R. N., Farrell, D. J., Flamm, R. K., Sader, H. S., Dunne, M. W., Mendes, R. E. Surrogate analysis of vancomycin to predict susceptible categorization of dalbavancin. Diagn Microbiol Infect Dis. , (2015).
- Turnidge, J., Paterson, D. L. Setting and revising antibacterial susceptibility breakpoints. Clinical microbiology reviews. 20, 391-408 (2007).
- Rennie, R. P., et al. Factors influencing broth microdilution antimicrobial susceptibility test results for dalbavancin, a new glycopeptide agent. Journal of clinical microbiology. 45, 3151-3154 (2007).
- Arhin, F. F., et al. Effect of polysorbate 80 on oritavancin binding to plastic surfaces: implications for susceptibility testing. Antimicrobial agents and chemotherapy. 52, 1597-1603 (2008).
- Farrell, D. J., Mendes, R. E., Rhomberg, P. R., Jones, R. N. Revised reference broth microdilution method for testing telavancin: effect on MIC results and correlation with other testing methodologies. Antimicrobial agents and chemotherapy. 58, 5547-5551 (2014).
- Ribbon Panel, B. lue Guidelines for Safe Work Practices in Human and Animal Medical Diagnostic Laboratories. MMWR Supplements. 61 (01), 1-101 (2012).
- Anderegg, T. R., Biedenbach, D. J., Jones, R. N. Initial quality control evaluations for susceptibility testing of Dalbavancin (BI397), an investigational glycopeptide with potent gram-positive activity. Journal of clinical microbiology. 41, 2795-2796 (2003).
- Koeth, L. M., Windau, A. R., Goldstein, B. P. Comparison of Broth Microdilution and Agar Dilution Dalbavancin and Vancomycin MIC Results for 42 Aerobic Gram-positive Bacteria. Poster 132. ASM. , San Francisco, CA. (2012).
- Fritsche, T. R., Rennie, R. P., Goldstein, B. P., Jones, R. N. Comparison of dalbavancin MIC values determined by Etest (AB BIODISK) and reference dilution methods using gram-positive organisms. Journal of clinical microbiology. 44, 2988-2990 (2006).
- Mushtaq, S., Warner, M., Johnson, A. P., Livermore, D. M. Activity of dalbavancin against staphylococci and streptococci, assessed by BSAC and NCCLS agar dilution methods. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 54, 617-620 (2004).
- Jones, R. N., Flamm, R. K., Sader, H. S. Surveillance of dalbavancin potency and spectrum in the United States (2012). Diagnostic microbiology and infectious disease. 76, 122-123 (2013).
