Abstract
बाद के विश्लेषण या मात्रा का ठहराव के लिए माउस छोटी आंत और पेट के पूरे mounts तैयारी समय लगता है और मुश्किल हो सकता है। हम तेजी से हाथ से प्राप्त किया जा सकता है, जो कि बेहतर करने के लिए और एक समान गुणवत्ता के पूरे माउंट तैयारियों तैयार करने के लिए कटौती करने के लिए एक सरल उपकरण के उपयोग और 'रोल' माउस आंतों का वर्णन है। डिवाइस 4 स्टेनलेस स्टील की छड़ और एक काटने गाइड कार्य करता है जो एक शीर्ष रखती है, कि एक आधार शामिल हैं। छड़ छोटी आंत [तिहाई में विभाजित] और पेट के लुमेन में डाला जाता है। छड़ और नमूने तो डिवाइस के आधार में पकड़े स्लॉट में फिल्टर पेपर या कार्ड के एक टुकड़े पर रखा जाता है। डिवाइस के शीर्ष तो तैनात है और एक काटने गाइड के रूप में कार्य करता है। शीर्ष टुकड़ा के केंद्र में दो कोणीय वर्गों एक चाकू या छुरी मार्गदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया और छड़ के शीर्ष पर अनुलंबीय आंतों में कटौती कर रहे हैं। आंतों वर्गों में कटौती की गई है, एक बार शीर्ष निकाल दिया जाता है और कार्ड, TissUE और छड़ धीरे डिवाइस से हटा दिया है और बेंच पर रखा। छड़ फिर धीरे समतल और फिल्टर पेपर या कार्ड की अंतर्निहित टुकड़े पर आंतों खंडों छड़ी करने के बग़ल में लुढ़का कर रहे हैं। अंतिम तैयारी तो जांच या तय की और बाद में विश्लेषण के लिए भंडारित किया जा सकता है। तैयारियों सामान्य या आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडल में आंत्र परिवर्तन के अध्ययन के लिए अमूल्य हैं। तैयारियों सूजन (कोलाइटिस), क्षति, पूर्व कैंसर घावों के प्रभाव का अध्ययन और मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया गया है (न्यायपालिका तहखाना foci (ACFs) और foci (MDFs) समाप्त mucin) और जंतु या ट्यूमर।
Introduction
माउस और आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस 1-3 विभिन्न विकृतियों विशेष रूप से कैंसर और जठरांत्र संबंधी मार्ग में सूजन के लिए अपने रिश्ते के अध्ययन के लिए एक अमूल्य मॉडल हैं। यह अक्सर छोटी आंत और / या पेट के पूरे mounts की तैयारी की आवश्यकता है।
पूरे mounts की तैयारी ऑफसेट कैंची की एक सटीक जोड़ी के साथ किया जा सकता है लेकिन यह माउस के 4 प्रतिशत के बारे में 20 मिनट लग सकते हैं। यह चूहों की एक महत्वपूर्ण राशि की आवश्यकता होती है, जो तुलनात्मक अध्ययन, के लिए बहुत व्यावहारिक नहीं है (सांख्यिकीय विश्लेषण करने के लिए समूह विषय के प्रति 10) कहते हैं। इसके अलावा, लगने वाले समय की लंबाई के ऊतकों का क्षरण का खतरा बढ़ जाता है। इस समस्या को कम करने का प्रयास विभिन्न काटने तैयारी एड्स का परीक्षण करने के लिए नेतृत्व किया। पहली काटने के पेड़ों के साथ, धातु प्लेट की एक श्रृंखला पर आधारित है, लेकिन प्लेटों ऊतक छिप और काटने नियंत्रित करने के लिए इस प्रकार कठिन था।
एक conventionaहम तो एक आधे पेंसिल आकार एक छुरी (चित्रा 1) के लिए एक अच्छा मार्गदर्शन करना होगा कैसे देख सकता है के रूप में एल छह पक्षीय पेंसिल अंत में, काटने डिवाइस के लिए प्रेरणा प्रदान की। यह चार काटने गाइड 5 के साथ एक फ्रेम के लिए एक डिजाइन में हुई। चित्रा 4 में तैयारियों कैंची तैयारी और डिवाइस तैयारी के बीच के अंतर को प्रदर्शित रूप में इस डिवाइस के प्रभाव को नाटकीय था।
मूल उपकरणों के सबसे ऊपर धातु के कई टुकड़े, लेकिन बाद में लोगों से निर्माण किया गया था, और मौजूदा मॉडल Duralumin का एक ठोस टुकड़ा से बाहर machined किया गया था। आधार उच्चतम गुणवत्ता उच्च घनत्व राल से बाहर machined किया गया था।
डिवाइस यह बहुत गति को और आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला है जो की तैयारी, की गुणवत्ता और स्थिरता में सुधार के रूप में माउस आंत के पूरे mounts की तैयारी के लिए बहुत काम का साबित हुई है।
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Protocol
विभिन्न प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं और मानवीय इच्छामृत्यु मेजबान संस्थानों नैतिक समिति से और उचित नियामक निकायों द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं। इच्छामृत्यु सामान्य रूप से ग्रीवा अव्यवस्था के बाद सीओ 2 asphyxiation का उपयोग कर हासिल की है।
1. डिवाइस
- मशीन इस पांडुलिपि में वर्णित के रूप में उच्च घनत्व एसिटाइल राल का एक ठोस ब्लॉक के बाहर से डिवाइस के आधार के मुख्य भाग। प्रत्येक के अंत में छड़ लेने के लिए इन 2.5 मिमी के पेड़ों से बाहर 3 मिमी उच्च ऊंचा स्ट्रिप्स, और भाग मशीन बनाने (चित्रा 2 और 3 चित्र देखें)।
- गोल बंद सिरों के साथ एक 2.4 मिमी व्यास स्टेनलेस स्टील से छड़ बनाओ।
नोट: ढक्कन के मुख्य फ्रेम Duralumin थाली से बाहर machined किया गया था। समाप्त उपकरणों की एक सीमित संख्या डा Goodlad से उपलब्ध हैं।
डिवाइस का 2. का प्रयोग करें
- कैंची का उपयोग उदर गुहा से छोटी आंत और पेट काटनाऔर दस्ताने उंगलियों। आंत से दूर खींच धीरे घुमावदार संदंश के साथ इसे पकड़ और से अन्त्रपेशी निकालें।
- ठंड फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस, पीएच 7.4) यह एक 10 या 20 मिलीलीटर Luer फिटिंग प्लास्टिक सिरिंज पर फिट कर सकते हैं ताकि इसकी व्यापक अंत में नीचे कट गया था, जो एक गिल्सन प्रकार पिपेट टिप, उपयोग करने के साथ आंतों कुल्ला।
- कागज तौलिया का एक शीट पर छोटी आंत (एसबी) बाहर करना और लंबाई (समीपस्थ, मध्य, और बाहर - SB1, SB2 और SB3) में तीन बराबर वर्गों में विभाजित कैंची का उपयोग। सेसम निकालें और पेट के बाहर करना।
- कैंची से आंतों खंडों में कई बहुत छोटे कटौती तरल पदार्थ से बचने और आंतों पर कागज तौलिया का एक चादर प्लेस और धीरे तरल पदार्थ बाहर निकल जाती है और सूखी दाग की तैयारी पर एक उंगली को चलाने के लिए अनुमति देने के लिए करें।
- वर्गों लिफ्ट और पहले से फॉस्फेट बफर खारा की एक बीकर में भिगोने से गीला कर रहे थे कि स्टेनलेस स्टील की छड़ डालें।
नोट: आंत में किया जा सकता हैइसलिए अगर वांछित verted (अंदर बाहर कर दिया)। - डिवाइस के आधार में फिट करने के लिए आकार के कार्ड या फिल्टर पेपर में कटौती का एक टुकड़ा लेबल। यह लगभग सभी समाधान से अप्रभावित है के रूप में पेंसिल, सबसे अच्छा है। शव परीक्षा की तारीख, प्रयोगात्मक कोड और पशु पहचान संख्या का सुझाव दिया है।
- डिवाइस के आधार में कार्ड या फिल्टर पेपर रखें। डिवाइस के आधार में स्लॉट में छड़ और आंतों डालें। क्षेत्रों के समीपस्थ अंत एक मानकीकृत तरीके से तैनात है सुनिश्चित करें। समीपस्थ सिरों कार्ड लेबल के पास होना चाहिए।
- आधार पर डिवाइस के शीर्ष टुकड़ा रखें। अनुलंबीय वर्गों में कटौती करने के लिए एक छुरी ब्लेड मार्गदर्शन करने के लिए कोणीय सलाखों का प्रयोग करें।
नोट: ऊतक धीरे और सावधानी से यह चाकू के साथ कदम नहीं करता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए एक उंगली के साथ आयोजित किया है अगर यह मदद करता है। - डिवाइस के शीर्ष टुकड़ा निकालें। ध्यान से (उनके छड़ पर अभी भी) फिल्टर पेपर और ऊतकों को हटा दें।
नोट: fil के नीचे रखा कड़ी कार्ड का एक टुकड़ाआतंकवाद कागज उठाने सहायता करेगा। - खंडों (पीबीएस में डूबा एक दस्ताने उंगलियों के साथ) थोड़ा गीला। रॉड रोल, ओर पेट के ऊपर खुला और यह फ्लैट का प्रसार करने की ओर। ऊतक तो फिल्टर पेपर का पालन करना होगा।
- दिखने में किसी भी सकल घावों के लिए तैयारी की जांच।
- एक उथले स्नान (या सैंडविच बॉक्स) युक्त लगानेवाला करने के लिए फिल्टर पेपर का पालन ऊतक स्थानांतरण।
नोट: ऊतक फिल्टर पेपर का पालन करता है या कार्ड के लिए इसे मजबूती से जुड़ा रहेगा बाद। Fixatives की एक विस्तृत श्रृंखला की तैयारी की रक्षा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह Carnoy के तरल पदार्थ के लिए सबसे अच्छा सेल प्रसार के तरीकों के लिए आदर्श नियतन है जो आंतों सेल proliferations 6 के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए कि सिफारिश की है; हालांकि formalin या अन्य समापन के लिए आवश्यक हैं, तो कई अन्य fixatives भी इस्तेमाल किया जा सकता है। - निर्धारण (आमतौर पर 3 घंटा) के बाद, 70% इथेनॉल में तैयारियों हस्तांतरण। जब तक आवश्यक नमूने तो संग्रहित किया जा सकता है। तैयारियों गएक चेहरे एन अध्ययन किया और / या एच ई या अन्य ऊतकीय धुंधला तकनीक, immunohistochemistry और / या स्वस्थानी संकरण में लिए ऊतकीय नमूनों की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
नोट: लम्बे समय तक निर्धारण प्रतिरक्षाऊतकरसायन जेट और / या स्वस्थानी संकरण जेट में कम कर सकते हैं। पॉलीप्रोपाइलीन सैंडविच बक्से तैयारियों की एक बड़ी संख्या के भंडारण के लिए आदर्श होते हैं। - विभिन्न आंतों क्षेत्रों से तय ऊतकों यदि आवश्यक हो 'स्विस रोल' में किया जाता है और ऊपर वर्णित उन सहित ऊतकीय तरीकों 6 की पूरी रेंज के साथ दाग जा सकता है। एक 'स्विस रोल' बनाने के लिए आंतों खंडों एक कीट विज्ञानी पिन के साथ सुरक्षित और मोम 6 embedding के लिए कार्रवाई की एक कॉकटेल छड़ी या एक दंर्तखोदनी के आसपास लुढ़का फिल्टर पेपर, से हटा रहे हैं।
- यदि आवश्यक हो, न्यायपालिका तहखाना foci 7 कल्पना करने के लिए methylene नीले रंग के साथ थोक ऊतक दाग।
- पर तय की तैयारी स्कोरअवकाश।
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Representative Results
जंतु (चित्रा 4) ऊतक रोशन पक्ष के लिए एक ठंड प्रकाश स्रोत के साथ एक stereomicroscope के तहत की पहचान करने के लिए आसान कर रहे हैं। यह एक नाकड़ा स्कोरिंग बाद में चर्चा की जा सकती है और विभिन्न ऑपरेटरों समझौते तक पहुँच सकते हैं कि आदेश में मनाया जाता है जब पेंसिल के निशान के साथ कार्ड चिह्नित करने के लिए उपयोगी है। ऊतक भी [methylene नीले रंग के साथ] की पहचान करने के लिए दाग थोक किया जा सकता है न्यायपालिका तहखाना foci 8 या ऊपर या ट्रांस रोशनी से से रोशनी से समाप्त foci (MDFs) 9 mucin (चित्रा 5)।
घावों का स्थान भी एक स्थितीय आधार 8 पर रन बनाए जा सकते हैं। इस एक पहले विभिन्न ज्ञात आकार के लिए कई ग्रिड खिंचाव और एक एसीटेट शीट पर मुद्रित तो, एक कंप्यूटर ड्राइंग पैकेज में 10 वर्ग का एक ग्रिड तैयार यह कई बार कॉपी और करने की जरूरत है ऐसा करने के लिए सील एक उपयोगी है [(6 चित्रा देखें) और इस] करने के लिए अपेक्षाकृत सरल कार्यक्रम। एक तो एल फिट बैठता है कि एक ग्रिड पा सकते हैं खंड के ength और ब्याज की घटनाओं स्कोर करने के लिए इसका इस्तेमाल करते हैं।
एक बार रन बनाए हिस्सा या ऊतक के सभी आगे के विश्लेषण के लिए हटाया जा सकता है या पूरे वर्गों ऊतकीय सेक्शनिंग के लिए एक 'स्विस रोल' में लुढ़का जा सकता है। इस प्रक्रिया के तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण 10 के रूप में वर्णित किया गया है जबकि तैयारियों की भी फ्लैट और प्रकृति इस प्रक्रिया के और अधिक सरल बना देता है। मैक्रो तैयारी 'मैक्रो जंतु' और 'सूक्ष्म जंतु' 11,12 (चित्रा 7) स्कोर करने के लिए इस्तेमाल किया स्विस रोल स्कोर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
डिवाइस की प्रेरणा एक पेंसिल से आया कैसे चित्रा 1। एक काटने गाइड के रूप में कार्य करने के लिए एक आधा पेंसिल आकार का उपयोग करने के विचार के लिए जैविक सेवा इकाई के नेतृत्व में चर्चाएँ।53,042 / 53042fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा मूल डिवाइस के 2. तस्वीरें। मूल डिवाइस हाथ से तैयार की धातु के कई टुकड़े, से निर्माण किया गया था। (ए) डिवाइस इकट्ठे हुए। (बी) डिवाइस के शीर्ष। स्थिति में छड़ को दिखाने के लिए हटा दिया गया है कृपया यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
बदल दिया डिवाइस की चित्रा 3. तस्वीरें। (ए) ढक्कन के मुख्य फ्रेम Duralumin थाली से बाहर machined है। (बी) (काले रंग में देखा) आधारएक चैनल में बैठे 4 हटाने योग्य छड़ होने, उच्च घनत्व एसिटाइल राल का एक ठोस ब्लॉक से बना है। । ढक्कन (ए) बेसिन (बी) के शीर्ष पर रखा गया है: आधार (काला) के शीर्ष पर रखा एक फिल्टर पेपर (सफेद) (सी) डिवाइस के अंतिम दृश्य दिखाया गया है। सेंटीमीटर में आयाम दिखाए जाते हैं। छड़ गोल बंद सिरों के साथ व्यास में 2.4 मिमी थे। अधिक जानकारी के लिए संदर्भ 5 देखें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
के साथ बनाया चित्रा 4. आंत तैयारी कैंची और डिवाइस का उपयोग ऑफसेट। (ए) आंतों ऑफसेट कैंची का उपयोग कर तैयार किया। (बी) के पेट कटर पेट भर भी चौड़ाई दिखा रहा है और साथ तैयार आंतों गिनती में आता है जो ऊतकों की बेहतर प्रस्तुति, और बहुत आसान जंतु के अवलोकन। सेल प्रसार 6 में चित्रा 3 से संशोधित। यूनिट के साथ स्केल बार संकेत दिया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5. न्यायपालिका तहखाना foci methylene नीले रंग के साथ दाग पेट के पूरे माउंट में देखा। पूरे पेट के थोक तीर द्वारा दिखाया गया है, न्यायपालिका तहखाना foci पहचान करने के लिए methylene नीले रंग के साथ दाग था माउंट। यूनिट के साथ स्केल बार संकेत दिया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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चित्रा 6 स्थितीय स्कोरिंग के लिए एसीटेट शीट के लिए खाका। 10 चौकों की ग्रिड के विभिन्न आकारों एसीटेट शीट पर मुद्रित कर रहे हैं। कटौती आंत खंड की लंबाई फिट बैठता है कि ग्रिड पर रखी है, और ब्याज की घटनाओं प्रत्येक वर्ग में घावों की गिनती संख्या के रूप में इस तरह के रन बनाए हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा एक एच ई कलंकित माउस छोटी आंत के 7. स्विस रोल। दिखाया छोटी आंत स्विस रोल एक अच्छी तरह से आंतों ट्यूमर उत्पत्ति की विवो मॉडल में विशेषता है, एक APC (न्यूनतम / +) माउस से है। तीर प्रतिनिधि adenomas संकेत मिलता है। यूनिट के साथ स्केल बार दिखाया गया है।42 / 53042fig7large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
दो ऑपरेटरों के लिए पूरी तरह से 6 मिनट के भीतर एक माउस शव परीक्षण कर सकते हैं ताकि डिवाइस बहुत प्रक्रिया को गति। यह स्पष्ट सकल घावों और वजन और प्रमुख अंगों फिक्सिंग के लिए एक दृश्य की जांच में शामिल होंगे। यह भी ऑपरेटरों, कुल्ला दाग और पेट, काएकुम, छोटी आंत और पेट के वजन और पूरे mounts तैयार करने के लिए अनुमति देगा। चपटा ऊतक बहुत जल्दी तय की और इस प्रकार गिरावट कलाकृतियों से बचने जा सकता है।
(अलग गति से) डिवाइस के प्रमुख लाभ में से एक डिवाइस तो बाद के विश्लेषण और ज्यादा आसान मात्रा का ठहराव बनाता है, जो कहीं बेहतर गुणवत्ता की तैयारी के उत्पादन, उत्पन्न कर सकते हैं। चेहरे स्कोरिंग एन (जैसे नाकड़ा संख्या, व्यास और बोझ मात्रा के रूप में) स्थूल कैंसर और पूर्व कैंसर घावों बढ़ाता के लिए आदर्श है। तैयारियों की भी प्रकृति बाद में 'स्विस रोल' में रोलिंग और इसलिए 'माइक्रो पी की कि ऊतकीय विश्लेषण सेक्शनिंग के लिए आदर्श बनाताolyp 'नंबर भी मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। न्यायपालिका तहखाना foci और अन्य पूर्व नवोत्पादित घावों भी पूरे mounts का उपयोग करते हुए देखे जा सकते हैं।
विभिन्न कोलाइटिस मॉडल में भड़काऊ परिवर्तन भी पूरे mounts का उपयोग करते हुए देखा जा सकता है।
इसके अलावा पेट के विभिन्न क्षेत्रों में इन घटनाओं की मात्रात्मक और स्थानिक स्थान निर्धारित किया जा सकता है। तकनीक की सीमा डिवाइस का उपयोग विशेष रूप से छुरी के साथ ऊतक की स्कोरिंग में, कुछ निपुणता की आवश्यकता है। ज्यादातर ऑपरेटर के कुछ ही मिनट के अभ्यास के बाद एक कम समय में तकनीक में महारत हासिल कर सकते हैं। तैयारियों केवल कुछ ही मिनट ले, लेकिन तत्काल संरक्षण आवश्यक है, तो छोटे नमूने तो निर्धारण या स्थिर और के लिए सामान्य रूप से तैयार ऊतक के बाकी लिया जा सकता है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Delrin | Ryan Plastics, Earls Barton, UK | High-density acetal resin similar material would suffice | |
| Duralumin plate | Metal Supplies Ltd, Park Road,Dukinfield. SK16 5LP UK | Aluminium allow dating back to 1909 so alterative suppliers are available | |
| Finished device(s) ready for use | Contact Dr Goodlad r.goodlad@imperial.ac.uk | Contact r.goodlad@imperial.ac.uk for supply details |
References
- Goodlad, R. A. Cancer Handbook. Alison, M. R. , John Wiley and Sons, Ltd. 243-262 (2007).
- Ward, J. M., Treuting, P. M. Rodent intestinal epithelial carcinogenesis: pathology and preclinical models. Toxicol Pathol. 42, 148-161 (2014).
- Sundberg, J. P., Hogenesch, H., Nikitin, A. Y., Treuting, P. M., Ward, J. M. Training mouse pathologists: ten years of workshops on the Pathology of Mouse Models of Human Disease. Toxicol Pathol. 40, 823-825 (2012).
- Wasan, H. S., Novelli, M., Bee, J., Bodmer, W. F. Dietary fat influences on polyp phenotype in multiple intestinal neoplasia mice. Proc Natl Acade Sci USA. 94, 3308-3313 (1997).
- Rudling, R., Hassan, A. B., Kitau, J., Mandir, N., Goodlad, R. A. A simple device to rapidly prepare whole mounts of murine intestine. Cell Prolif. 39, 415-420 (2006).
- Alferez, D., Goodlad, R. A. To best measure cell proliferation in samples from the intestine. Cell Prolif. 40, 231-240 (2007).
- Park, H. S., Goodlad, R. A., Wright, N. A. The incidence of aberrant crypt foci and colonic carcinoma in dimethylhydrazine-treated rats varies in a site-specific manner and depends on tumor histology. Cancer Res. 57, 4507-4510 (1997).
- Park, H. S., et al. Effects of epidermal growth factor and dimethylhydrazine on crypt size, cell proliferation, and crypt fission in the rat colon. Cell proliferation and crypt fission are controlled independently. Am J Pathol. 151, 843-852 (1997).
- Femia, A. P., Dolara, P., Caderni, G. Mucin-depleted foci (MDF) in the colon of rats treated with azoxymethane (AOM) are useful biomarkers for colon carcinogenesis. Carcinogenesis. 25, 277-281 (2004).
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).
- Goodlad, R. A., et al. Inhibiting vascular endothelial growth factor receptor-2 signaling reduces tumor burden in the ApcMin/+ mouse model of early intestinal cancer. Carcinogenesis. 27, 2133-2139 (2006).
- Mandir, N., Englyst, H., Goodlad, R. A. Resistant carbohydrates stimulate cell proliferation and crypt fission in wild-type mice and in the Apc(Min/+) mouse model of intestinal cancer, association with enhanced polyp development. Br J Nutr. 100, 711-721 (2008).
