Abstract
Organische verontreinigingen geadsorbeerd op het oppervlak van titaniumdioxide (TiO2) kan worden afgebroken door fotokatalyse onder ultraviolet (UV) licht. Hier beschrijven we een nieuw protocol toepassen van de TiO 2 fotokatalyse lokaal veranderen cell affiniteit van het substraatoppervlak. Voor dit experiment werd een dunne TiO 2-film werd sputter coating op een glazen dekglaasje en de TiO 2 oppervlak werd vervolgens gemodificeerd met een organosilaan monolaag afgeleid van octadecyltrichloorsilaan (OTS), die celadhesie remt. Het monster werd ondergedompeld in een celkweekmedium en gerichte UV licht werd bestraald met een achthoekige gebied. Wanneer een neuronale cellijn PC12-cellen werden uitgeplaat op het monster cellen gehecht alleen de UV-bestraalde gebied. We tonen verder aan dat deze modificatie van het oppervlak kan ook worden uitgevoerd in situ, dat wil zeggen, zelfs wanneer de cellen groeien op het substraat. Een juiste modificatie van het oppervlak vereist een extracellulaire matrix pProtein collageen aanwezig in het medium ten tijde van UV bestraling. De hier gepresenteerde techniek kan eventueel worden toegepast in patroonvorming meerdere celtypen te construeren gemengde cultuursystemen of willekeurig manipuleren cellen onder kweek.
Introduction
Halfgeleiderlithografie processen en zijn derivaten - zoals fotolithografie 1,2, electron-beam lithografie 3-6 en microcontact afdrukken 7-10 - zijn inmiddels uitgegroeid tot een gevestigde praktijk in de celbiologie aan levende cellen te groeien in een bepaalde positie en geometrie. De patroon werkwijze berust op het gebruik van microfabricated substraten bestaande uit micro-eiland cel permissief coating in een niet-permissieve achtergrond. Dergelijke substraat dient als een template patroon van de cellen. Deze technologieën hebben ons de nieuwe werkwijzen om cellen en hun functie ingenieur bij enkel- en meercellige level, uittreksel de intrinsieke eigenschappen van de cellen, en de doorvoer van celgebaseerde drugonderzoek 11 verhogen.
De mate-van-vrijheid in cel patroonvorming zou enorm toenemen als het patroon geometrie in situ kan worden veranderd, dat wil zeggen, terwijl cellen gekweekt op de sppervlakte. De conventionele werkwijzen voor patroonvorming niet direct hier toegepast, aangezien samples verwerken atmosfeer of in vacuüm. Daarom diverse nieuwe oppervlakte modificatie technieken zijn voorgesteld, die gebaseerd zijn, bijvoorbeeld op fotoreactieve verbindingen 12,13 of laser ablatie 5,14, om er maar een paar te noemen. De voorgestelde werkwijzen zijn goed beoordeeld door Robertus et al. 15, en recenter door Choi et al. 16 en 17 Nakanishi.
Hier in dit artikel beschrijven we een nieuw protocol van in-situ modificatie van het oppervlak, die profiteren van de fotokatalytische afbraak van organische moleculen neemt een titaniumdioxide (TiO2) oppervlak 18,19. In deze werkwijze wordt een TiO 2 film ingevoegd tussen het glassubstraat en de organische film die de cellen interfaces en de organische film wordt ontleed in situ door het plaatselijk bestralen ultraviolette (UV)licht om een gebied van belang (λ <388 nm). We tonen aan dat het nieuwe protocol kan worden gebruikt om micropatterns van extracellulaire matrixeiwitten en levende cellen zowel ex situ als in situ te creëren. TiO 2 biocompatibel, chemisch stabiel, en optisch transparant, kenmerken waarvan maakt kinderen te voeren in cel-kweek-experimenten. Dit protocol voorziet in een materiaal-wetenschap gebaseerde alternatief voor het wijzigen van celcultuur steigers in celcultuur omgeving.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van TiO 2 gecoate dekglaasje
- Nummer de dekglaasjes met een diamant kraspen. Dit helpt niet alleen bij te houden van elke dekglaasjes maar ook voor zorgen dat de juiste zijde van het monster gericht. Reinig de dekglaasjes, eerste stromend DDH 2 O vervolgens door onderdompeling in piranha-oplossing (H 2 SO 4: H 2 O 2 = 4: 1). Na 10 minuten, spoel de dekglaasjes grondig 8 maal DDH 2 O. Droog de dekglaasjes onder een stroom N2.
- Stel TiO 2 doel in het radiofrequentie (RF) sputtering systeem. Bevestig de dekglaasjes op een monster houder van het sputteren apparatuur met behulp van een polyimide tape. Plaats de monsterhouder in de sputterkamer. Evacueren van de kamer tot de druk bereikt 2,0 x 10 -4 Pa.
- Introduceren Ar gas in de kamer en stel de depositie druk tot 4,0 mTorr. Terwijl de sluiter gesloten, geleidelijk te verhogende RF-vermogen tot 70 W.
- Open de sluiter en sputteren gedurende 15 minuten om een film te verkrijgen met een dikte van 120-150 nm (Figuur 1: Stap A). Groeisnelheid van de folie moet worden afgeleid voor elke machine.
2. Coating met Cell-afstotende Film
- Hydrofiliseren de TiO 2 oppervlak door behandeling van het monster met O2 plasma, volgens de instructies van de fabrikant van het plasma reactor. Wij behandelen het monster gedurende 5 minuten bij 200 W met O2 stroom van 100 sccm. Dompel het monster in DDH 2 O en controleer of het oppervlak is superhydrofiel. Droog het oppervlak grondig onder een stroom N2.
- Bereid 1 mM octadecyltrichloorsilaan (OTS) door toevoeging van 39,6 ul OTS tot 100 ml tolueen. Dompel het monster in de oplossing gedurende 1 uur bij KT. Voeren deze stap in een N 2 -gevulde handschoen zak (Figuur 1: Stap B).
- Om fysisch gesorbeerde moleculen te verwijderen, sonicate het monster in tolueen, aceton, ethanol, en DDH 2 O 5 minuten elk, in die volgorde. Spoel het monster vier maal in vers DDH 2 O en droog het oppervlak onder een stroom N2. De ondergrond moet hydrofoob met een contact hoek van 100-110 ° zijn.
3. Ex-situ Surface Patterning
- Werken in een laminaire stroming kap, trek enkele krassen met een diamant kraspen op het oppervlak. De markeringen helpen bij het bijhouden van de verwerkte regio's en ook het brengen van microscopen in beeld. Steriliseer de OTS-beklede TiO 2 door onderdompeling van het monster in 70% ethanol gedurende 5 minuten. Tweemaal Spoel vervolgens het monster in gesteriliseerde DDH 2 O.
- Plaats het monster in een 35-mm schaal en voeg 2 ml van de PC12 groeimedium (zie stap 4.2). Incubeer gedurende 3 uur in een CO2-incubator (37 ° C). Deze procedure moet laten serumalbuminen absorberen op het oppervlak. Geadsorbeerd albuminen remmen daaropvolgende adsorptie van andere proteins en cellen (Figuur 1: Stap C).
- Tijdens het wachten, het opzetten van de omgekeerde fluorescentie microscoop.
- Zet de booglamp, plaatst u de UV-filter kubus, en stel het objectief naar 20X.
- Meet lichtintensiteit I (W cm -2) met UV-intensiteit meter en bereken bestralingstijd t (in seconden) voor een dosis van d (in J cm -2) als: t = d / I.
Bijvoorbeeld, bestralen met een dosis van 200 J cm -2 behulp van een lichtbron van 600 mW cm -2 is 333 sec bestraling vereist. - Gebruik een micrometer en sluit het velddiafragma om de grootte van het gebied te bestralen, bijvoorbeeld 200 urn.
- Na 3 uur incubatie, het medium aangevuld met 200 pl 3,0 mg ml -1 type IV collageen (Col-IV; eindconcentratie 300 ug ml-1).
- Breng de 35-mm schotel naar de microscoop podium. Vind de scratch mark, richten de microscoop op het monsteroppervlak en bestralen UV-licht bij een dosis van 200 J cm -2 (Figuur 1: Stap D). Het gebied van UV straling kan worden gewijzigd ofwel door aanpassing van de opening van het velddiafragma of door vervanging van het velddiafragma met een metalen masker van arbitraal geometrie.
- Vervang het medium met vers kweekmedium (zonder Col-IV) en plaats het monster opnieuw in de incubator.
4. Cultuur van de Cel
- Routine cultuur van PC12 cellen wordt uitgevoerd op een collageen gecoate plastic schaaltje uitgevoerd.
- De vacht van een 60-mm weefselkweek schotel met Col-IV, eerst nat het oppervlak met DDH 2 O en zuig alle DDH 2 O.
- Bereid 300 ug ml -1 Col-IV door verdunning van de oorspronkelijke oplossing (3 mg ml -1) 10x met DDH 2 O.
- Voeg 200 ul van 300 ug ml-1 Col-IV per 60 mm schaal. Laat de oplossing verspreid over het oppervlak.
- Droge tHij schotel in een laminaire stroming kap gedurende ongeveer 1 uur.
- Tweemaal Spoel het oppervlak met 4 ml Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (D-PBS). Wanneer deze niet onmiddellijk met de gecoate schaal, spoel de schaal een keer met 4 ml van DDH 2 O. Na het opzuigen van DDH 2 O, slaan de schotel in de incubator. Probeer niet te houden opgeslagen voor meer dan twee weken.
- PC12-cellen worden gekweekt in een kweekmedium bestaande uit: Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (laag glucose) + 10% foetaal runderserum + 5% paardenserum + 1% penicilline-streptomycine-oplossing. Incubeer de cellen in een CO2 incubator (37 ° C, 5% CO 2) en plaats de helft van het medium elke andere dag. Passage cellen voordat ze samenloop.
- Zuig het groeimedium en voeg 2 ml PBS + (D-PBS + 10 mg ml -1 runderserumalbumine (BSA) + 10 mM EDTA) voorverwarmd tot 37 ° C. Incubeer 5 minuten bij 37 ° C. Tik voorzichtig de schotel naar alle ce loslls.
- Verzamel cellen in een 15 ml conische buis. Spoel de schaal met 3 ml verse D-PBS, voorverwarmd tot 37 ° C.
- Centrifugeer de buis bij 150 x g gedurende 4 min.
- Zuig het supernatant en voeg 1 ml van het kweekmedium.
- Voor routine cultuur, split de cellen 1: 3 tot 1: 5.
- Aan cellen plaat op de UV-gemodificeerde OTS / TiO 2 monster, tellen celdichtheid en voeg 3,0 x 10 5 cellen in een 35-mm schaal (Figuur 1: Stap E). Incubeer de schotel in de bevochtigde incubator (37 ° C, 5% CO2) gedurende 1-2 dagen. Zowel naïef en zenuwgroeifactor (NGF) -differentiated PC12-cellen kunnen worden toegepast voor de patroonvorming experimenten. Voor NGF differentiatie, 100 ng ml -1 7S-NGF voor het uitplaten van de cellen op het monster wordt toegevoegd aan het groeimedium enkele dagen. NGF-differentiatie lijkt de adhesibility van de PC12-cellen te verhogen en vergemakkelijkt de manipulatie, met name bij de in-situ patroonvorming experiments.
5. In-Situ Surface Patterning
- Na 1-2 dagen van cultuur op de ex-situ gemodificeerd oppervlak, bevestigen dat de cellen hechten en alleen groeien op de UV-bestraalde gebied. Stel de microscoop, zoals beschreven in stap 3.4.
- Breng het monster om een nieuwe 35-mm weefselkweek schaaltje met het groeimedium, 100 ng ml -1 NGF (bij gebruik van NGF-gedifferentieerde cellen) en Col-IV 100 ug ml-1.
- Plaats de schotel op de microscoop podium. Zoek de juiste positie en bestralen UV licht met een dosis van 200 J cm -2 (Figuur 1: Stap F, G). De nieuw gecreëerde permissieve gebied wordt aangegeven met een sterretje in Figuur 1: Stap G.
- Proberen om de verwerking van een enkel monster binnen 30 minuten te voltooien. Na bestraling overdracht van de sample in het medium zonder Col-IV.
- Wees uiterst voorzichtig bij het uitvoeren van de schotel met cultured cellen en overbrengen van het monster van schotel naar schotel te voorkomen losmaken van de gevormde cellen.
Figuur 1. Schematische weergave van het totale proces. Zie de tekst voor meer informatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 2A toont een dwarsdoorsnede scanning electron microscopy (SEM) beeld van sputteren afgezette TiO 2 film. Uit de waarnemingen, dikte van de film werd geschat op ongeveer 150 nm. Opvallend hierbij is de vlakheid van de afgezette TiO 2 film. Verdere analyse van atomaire kracht microscopie (AFM) bleek dat de wortel-gemiddelde-kwadraat (RMS) ruwheid van het oppervlak was 0,2 nm (figuur 2B).
Wanneer de TiO 2 oppervlak gemodificeerd met OTS en vervolgens ondergedompeld in een serum- bevattend groeimedium, serumalbuminen adsorberen op het oppervlak OTS remmen daaropvolgende eiwitadsorptie en celadhesie 18,20. Wanneer vervolgens geconcentreerd UV-licht wordt bestraald op het oppervlak, reactieve zuurstof species (ROS) ontstaan aan de TiO 2 oppervlak 21, waarbij de OTS zelf-geassembleerde monolaag (SAM) ontleden TiO 2 en verwijder het SAM en een geadsorbeerdelbumins van het oppervlak. Dit maakt het bestraalde gebied hydrofiele en tolerant te eiwitadsorptie. Directe wisselwerking van de ROS met albuminen zou kunnen tegelijkertijd plaatsvinden, maar de afbraak van OTS moet de belangrijkste reactie, aangezien OTS SAM in aanraking albumine en TiO 2. In het huidige protocol is een extracellulaire matrix eiwit Col-IV aangevuld het medium tijdens de bestraling en Col-IV adsorbeert bij voorkeur aan de UV-bestraalde gebied waar albuminen verwijderd (figuur 3A). Andere eiwitten zoals fibronectine kan worden gevormd in hetzelfde protocol (figuur 3B), waarin de veelzijdigheid van deze benadering.
Serumalbuminen, die ook in het medium ten tijde van UV-straling zijn, ook adsorberen op het bestraalde gebied, maar de resultaten suggereren dat de hoeveelheid niet hoog als op de intacte OTS SAM. Om dit te bevestigen, onderzochten we het verschil in de affiniteit van BSAmet UV-bestraalde en intacte OTS SAM door fluorescentiemicroscopie van kleurstof gemerkte BSA. Voor dit experiment werd geconcentreerd UV-licht bestraald om de OTS / TiO 2 monster dat niet is ondergedompeld in het serum bevattend medium, en daarna het monster werd ondergedompeld in een oplossing van fluorescein- gelabelde BSA. Figuur 3C toont het patroon van adsorptie BSA. Helderdere fluorescentie in het intacte OTS SAM gebied dan de UV-bestraalde gebied geeft de geadsorbeerde hoeveelheid BSA groter is in de intacte regio. Het mechanisme van preferentiële adsorptie kan worden begrepen door het verschil in hydrofobiciteit van beide gebieden. De hoeveelheid BSA adsorptie bekend hoger op hydrofobe oppervlakken 22 en de intacte OTS SAM regio meer hydrofoob is dan de UV-bestraalde gebied 18.
Het patroon van Col-IV aldus gecreëerde dient als matrix voor celadhesie. Figuur 4A toont NGF-gedifferentieerde PC12-cellen gekweekt op een n ex-situ gevormde regio voor 1 dag. Vervolgens werd UV-licht bestraald om de zijkant van een micropatroon en de cellen werden gekweekt gedurende nog 5 dagen. Zoals getoond in figuur 4B-D, cellen verder gemigreerd naar het aangepaste gebied, wat aangeeft dat cel affiniteit van het oppervlak met succes werd gewijzigd in celkweek omgeving.
Figuur 2. Karakterisatie van de TiO 2 film. (A) Doorsnede SEM beeld van het monster. (B) AFM beeld van de TiO 2 oppervlak. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
OAD / 53045 / 53045fig3highres.jpg "width =" 700 "/>
Figuur 3. Site-selectieve adsorptie van proteïnen op de UV-bestraalde gebied. (A) fluoresceïne-gelabeld collageen (200 um achthoekig patroon) en (B) rhodamine gemerkte fibronectine (100 um vierkant patroon). Preferentiële adsorptie van deze eiwitten is gebaseerd op de afwezigheid van albuminen die eiwitadsorptie (C) te blokkeren. Merk op dat in (C), werd OTS SAM niet in serum bevattend medium ondergedompeld vóór toepassing van fluoresceïne-gelabelde BSA. Schaal bars, 100 micrometer (A) en 50 micrometer (B, C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Ex-situ en in-situ patroonvorming van PC12-cellen. (A) Adhesie van PC12-cellen op een ex-situ gevormde gebied. Gestippelde octagon geeft de plaats van in situ UV-straling. (B - D) Migratie van PC12-cellen op de in-situ gevormde gebied, bij 2 dagen (B), 3 dagen (C) en 5 dagen (D) na bestraling. Schaal bar, 200 pm. Gewijzigd met toestemming van Yamamoto et al. 18. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In onze huidige protocol, werd TiO 2 film gevormd door RF-magnetron sputteren. Wij zijn voorstander van deze methode van afzetting, omdat het ons toelaat om reproduceerbaar te bereiden een fotokatalytische TiO 2 film met een sub-nm ruwheid. Hoewel sputterdepositie processen zijn bekend om materialen wetenschappers en elektronische ingenieurs, kan het niet zijn vrij toegankelijk voor biologen. In dat geval zou roterend bedekken TiO 2 film een alternatieve keuze 23 zijn. In deze werkwijze, TiO 2 nanodeeltjes opgelost in een oplosmiddel wordt uitgespreid op een substraatoppervlak door centrifugaalkracht. Speciale apparatuur nodig is een spin coater, die veel goedkoper dan een verstuivingssysteem. We hebben voor onszelf een roterend bedekken TiO 2 nanodeeltjes film en hebben bevestigd dat de film ook worden gebruikt om soortgelijke experimenten uit te voeren (data niet getoond). Het oppervlak van het roterend bedekken TiO 2 film is relatief ruw met een rms ruwheid van enkele tientallens van nm en duurt enige oefening uniform bekleden substraat reproduceerbaar bijzonder wanneer meerdere rotatie bekledingen nodig zijn dikke films te verkrijgen. Niettemin kan de werkwijze van de eerste kandidaat voor biologen.
Tot nu toe hebben we deze methode patroonvorming niet alleen PC12 cellen, maar ook een menselijke pancreas kanker cellijn AsPC-1 en primaire neuronen verkregen uit embryonale rat hippocampus 19 gebruikt. Adhesibility van AsPC-1 cellen zijn veel sterker dan die van PC12 cellen of hippocampale neuronen en aanvulling van steigers moleculen zoals collageen, was niet nodig te patroneren. We nog opgemerkt dat de niet-specifieke hechting van de cellen aan het bestraalde gebied werd zelden waargenomen, waarschijnlijk als gevolg van defecten in de OTS SAM.
Patroonvorming primaire neuronen waren veel meer uitdagend omdat hun adhesibility is zwak. In feite is de cruciale stap van de huidige werkwijze ligt in de juiste adsorptievan steigers moleculen. Een eenvoudige aanvulling van collageen of laminine onvoldoende affiniteit van het gemodificeerde gebied te verhogen voor de neuronen. Conventionele cultuur van hippocampale neuronen voert positief geladen peptide polylysine het bekleden van het oppervlak van het dekglaasje 24. In dit verband wordt induceren selectieve aanhechting van polylysine met UV-bestraald gebied gewenst, maar was onmogelijk omdat polylysine geadsorbeerd op de intacte OTS SAM regio ook. Wij probeerden andere oppervlaktecoatings, zoals polyethyleenglycol-silaan SAM en perfluor-silaan SAMs om te vinden dat geen van deze werden aangroeiwerende poly-lysine. Om dit probleem op te lossen, hebben we onlangs aangetoond dat een verknoping molecuul kan worden gebruikt om actieve adsorptie van de steigers moleculen induceren op de UV-bestraalde gebied 19. Een dergelijke selectie van steigers moleculen en optimalisatie van de concentratie dient voor elk experiment worden uitgevoerd.
UV bestralingsdosismoet ook worden geoptimaliseerd aangezien sterke invloed op de hoeveelheid eiwitadsorptie. In ons geval, werd fluorescentie-intensiteit meting gebruikt om een optimale UV dosis van 200 J cm -2 18 afleiden. De waarde kan variëren afhankelijk van de experimentele parameters zoals de dikte en de kristalliniteit van de TiO 2 film.
Tussen de verschillende technieken van in situ oppervlaktemodificatie nu toe ontwikkeld, het grote voordeel van de onderhavige werkwijze is dat deze niet biologisch synthese van specifieke moleculen voor oppervlaktebehandeling vereist. De hier gepresenteerde methode is in principe compatibel met organische films bereid uit de uitgebreide bibliotheek van commercieel verkrijgbare polymeren, peptiden en SAM precursors. Het is ook gunstig in de zin dat de oppervlakte-modificatie werkwijze kan worden uitgevoerd met gebruikelijke laboratoriumapparatuur, zoals een wide-field fluorescentiemicroscoop uitgerust kwik booglamp, zoals hier is getoond. Gebruikeen UV-laser als lichtbron, subcellulaire resolutie beneden naar ~ 3 micrometer worden bereikt (gegevens niet getoond).
Een aantal beperkingen van de huidige werkwijze omvatten de onomkeerbaarheid van de oppervlaktemodificatie, nodig voor het aanvullen steigers moleculen in het medium, en het genereren van ROS. De hier beschreven werkwijze is van toepassing op niet-permissief tolerante omzetting van het oppervlak, maar de omzetting terugslag en kan niet worden omgekeerd. Voor experimenten die omkering omzetting cel affiniteit vereisen andere methoden 15 moeten worden overwogen. Bovendien onze werkwijze vereist steigers moleculen zoals collageen te bath aangebracht op het celkweekmedium. Aangezien de populatie van pre-gevormde cellen onvermijdelijk worden blootgesteld aan de moleculen, kan dit enige toepassing van deze werkwijze beperkt. Photocatalyzed generatie van ROS, zoals hydroxylradicalen, de UV-bestraalde gebied kan toxisch nabijgelegen cellen, maar in ieder geval was dit effect nietwaargenomen in onze experimenten. Zelfs als dit wordt prominent voor andere toepassingen, zou dit probleem worden opgelost door aanvulling zuurstofvangers in groeimedium. Aangezien de zuurstof vangende moleculen zouden niet zijn gelegen tussen de TiO 2 en de niet-permissieve moleculen op zijn oppervlak, dienen zij overmatig ROS elimineren zonder dat het patroonvormende proces kinetiek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass coverslip | Warner Instruments | CS-15R15 | 15 mm diameter, #1.5 thickness |
| Diamond scriber | Ogura Jewel Industry | D-Point Pen | |
| RF sputtering system | ANELVA | SPC350 | |
| TiO2 sputtering target | Kojundo Chemical Lab | Titanium (IV) oxide, target | Purity, 99.9% |
| Plasma reactor | Yamato | PR301 | |
| n-octadecyltrichlorosilane (OTS) | Aldrich | 104817 | |
| Toluene | Wako | 204-01866 | |
| Tissue-culture dish (35 mm) | Greiner | 627160 | |
| Tissue-culture dish (60 mm) | BD Falcon | 353002 | |
| Type-IV collagen | Nitta Gelatin | Cellmatrix Type IV | |
| D-PBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | Heat-inactivate and pass through a 0.22 μm filter before use |
| Horse serum | Gibco | 26050-088 | Pass through a 0.22 μm filter before use |
| Penicillin-streptomycin (100x) | Nacalai tesque | 26253-84 | |
| 7S nerve growth factor (NGF) | Alomone Labs | N-130 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| EDTA | Dojindo | N001 | Stock solution in 0.5 M |
| TiO2 nanoparticle | Tayca | TKD-701 |
References
- Hughes, M. A., Brennan, P. M., Bunting, A. S., Shipston, M. J., Murray, A. F. Cell Patterning on Photolithographically Defined Parylene-C: SiO2 Substrates. J. Vis. Exp. (85), e50929 (2014).
- Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. Controlled Outgrowth of Dissociated Neurons on Patterned Substrates. J. Neurosci. 8, 4098-4120 (1988).
- Pensen, D., Heinz, W. F., Werbin, J. L., Hoh, J. H., Haviland, D. B. Electron Beam Patterning of Fibronectin Nanodots that Support Focal Adhesion Formation. Soft Matter. 3, 1280-1284 (2007).
- Tanii, T., et al. Application of Organosilane Monolayer Template to Quantitative Evaluation of Cancer Cell Adhesive Ability. Jpn. J. Appl. Phys. 50, 06GL01 (2011).
- Yamamoto, H., et al. In-Situ Guidance of Individual Neuronal Processes by Wet Femtosecond Laser Processing of Self-Assembled Monolayers. Appl. Phys. Lett. 99, 163701-1610 (2011).
- Yamamoto, H., et al. Differential Neurite Outgrowth is Required for Axon Specification by Cultured Hippocampal Neurons. J. Neurochem. 123, 904-910 (2012).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J. Vis. Exp. (22), e1065 (2008).
- Johnson, D. M., LaFranzo, N. A., Maurer, J. A. Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement. J. Vis. Exp. (55), e3164 (2011).
- Singhvi, R., et al. Engineering Cell Shape and Function. Science. 264, 696-698 (1126).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric Control of Cell Life and Death. Science. 276, 1425-1428 (1997).
- Degot, S., et al. Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects using Micropatterned Cells. J. Vis. Exp. (46), e2514 (2010).
- Nakanishi, J., et al. Photoactivation of a Substrate for Cell Adhesion under Standard Fluorescence Microscopes. J. Am. Chem. Soc. 126, 16314-16315 (2004).
- Kim, M., et al. Addressable Micropatterning of Multiple Proteins and Cells by Microscope Projection Photolithography Based on a Protein Friendly Photoresist. Langmuir. 26, 12112-12118 (2010).
- Deka, G., Okano, K., Kao, F. -J. Dynamic Photopatterning of Cells In Situ by Q-Switched Neodymium-Doped Yttrium Ortho-Vanadate. Laser. J. Biomed. Opt. 19, 011012 (2014).
- Robertus, J., Browne, W. R., Feringa, B. L. Dynamic Control over Cell Adhesive Properties using Molecular-Based Surface Engineering Strategies. Chem. Soc. Rev. 39, 354-378 (2010).
- Choi, I., Yeo, W. -S. Self-Assembled Monolayers with Dynamicity Stemming from (Bio)chemical Conversions: From Construction to Application. ChemPhysChem. 14, 55-69 (2013).
- Nakanishi, J. Switchable Substrates for Analyzing and Engineering Cellular Functions. Chem. Asian J. 9, 406-417 (2014).
- Yamamoto, H., et al. In Situ Modification of Cell-Culture Scaffolds by Photocatalytic Decomposition of Organosilane Monolayers. Biofabrication. 6, 035021 (2014).
- Sekine, K., Yamamoto, H., Kono, S., Ikeda, T., Kuroda, A., Tanii, T. Surface Modification of Cell Scaffold in Aqueous Solution using TiO2 Photocatalysis and Linker Protein L2 for Patterning Primary Neurons. e-J. Surf. Sci. Nanotech. 13, 213-218 (2015).
- Arima, Y., Iwata, H. Effects of Surface Functional Groups on Protein Adsorption and Subsequent Cell Adhesion using Self-Assembled Monolayers. J. Mater. Chem. 17, 4079-4087 (2007).
- Fujishima, A., Zhang, X., Tryk, D. A. TiO2 Photocatalysis and Related Surface Phenomena. Surf. Sci. Rep. 63, 515-582 (2008).
- Sigal, G. B., Mrksich, M., Whitesides, G. M. Effect of Surface Wettability on the Adsorption of Proteins and Detergents. J. Am. Chem. Soc. 120, 3464-3473 (1998).
- Zhang, X., et al. A Transparent and Photo-Patternable Superhydrophobic Film. Chem. Commun. 2007, 4949-4951 (1039).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing Hippocampal Neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
