Abstract
Contaminanti organici adsorbiti sulla superficie del biossido di titanio (TiO 2) possono essere decomposti da fotocatalisi sotto ultravioletta (UV). Qui si descrive l'impiego di TiO 2 fotocatalisi alterare localmente affinità cellule della superficie del substrato un nuovo protocollo. Per questo esperimento, un sottile TiO 2 film era sputtering rivestite su un vetrino di vetro, e la superficie TiO 2 è stato successivamente modificato con un monostrato silano organico derivato da octadecyltrichlorosilane (OTS), che inibisce l'adesione cellulare. Il campione è stato immerso in un mezzo di coltura cellulare, e concentrato luce UV è stata irradiata ad una regione ottagonale. Quando un neuronali PC12 linea cellulare sono state piastrate sul campione, cellule rispettati solo sulla zona UV-irradiati. Mostriamo inoltre che tale modificazione superficiale può essere eseguita anche in situ, cioè, anche quando le cellule crescono sul substrato. Modifica corretta della superficie necessaria una matrice extracellulare protein collagene di essere presente nel mezzo al momento della irradiazione UV. La tecnica qui presentata può potenzialmente essere impiegato in tipi di cellule patterning più per la costruzione di sistemi di co-coltura o di manipolare arbitrariamente cellule in coltura.
Introduction
Processi litografia di semiconduttori e suoi derivati - come fotolitografia 1,2, litografia a fascio elettronico 3-6, 7-10 e stampare microcontact - sono diventati uno strumento stabilito in biologia cellulare crescere cellule viventi in una posizione e geometria definita. Il metodo patterning si basa sull'utilizzo di substrati microfabbricati, costituito da micro-isola di cellule permissive rivestimento in uno sfondo non permissive. Tale substrato serve come modello per modello cellule. Queste tecnologie ci hanno fornito i nuovi metodi per progettare cellule e la loro funzione a livello singolo e multi-cellulari, per estrarre le proprietà intrinseche delle cellule, e per aumentare la produttività di base cellulare di screening farmaco 11.
Il grado di libertà in patterning cellula sarebbe aumentare notevolmente se la geometria motivo template potrebbe essere modificato in situ, cioè, mentre le cellule sono coltivate sulle surface. I metodi convenzionali per la formazione di pattern non possono essere applicati direttamente qui, dato che elaborano campioni in atmosfera o in vuoto. Sono stati proposti quindi varie nuove tecniche di modificazione superficiale, che si basano, per esempio, su composti fotoreattivi 12,13 o ablazione laser 5,14, solo per citarne alcuni. I metodi proposti sono stati ben recensito da Robertus et al. 15, e più recentemente da Choi et al. 16 e 17 Nakanishi.
Qui, in questo articolo, si descrive un nuovo protocollo di in-situ modifica della superficie, che si avvale di decomposizione fotocatalitica di molecole organiche su un biossido di titanio (TiO2) Superficie 18,19. In questo metodo, un film TiO 2 è inserito tra il substrato di vetro e la pellicola organica che interfaccia le cellule, e la pellicola organica viene decomposta in situ irradiando localmente ultravioletta (UV)luce per una regione di interesse (λ <388 nm). Abbiamo dimostrato che il nuovo protocollo può essere utilizzato per creare microdisegni di proteine della matrice extracellulare e le cellule viventi sia ex situ e in situ. TiO 2 è biocompatibile, chimicamente stabile, e otticamente trasparente, cui caratteristiche rende adatto ad introdurre in esperimenti di coltura cellulare. Questo protocollo fornisce una scienza dei materiali a base alternativa per modificare ponteggi coltura cellulare in ambiente coltura cellulare.
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Protocol
1. Preparazione di TiO2 Rivestiti vetro Coverslip
- Numero i coprioggetti usando una punta per tracciare diamante. Questo non solo aiuta a tenere traccia di ogni coprioggetto ma anche per garantire che il lato corretto del campione è rivolta verso l'alto. Pulire i coprioggetti, prima sotto un getto DDH 2 O, poi immergendole in una soluzione piranha (H 2 SO 4: H 2 O 2 = 4: 1). Dopo 10 minuti, risciacquare accuratamente i coprioggetti, 8 volte in DDH 2 O. Asciugare il coprioggetto sotto N 2 flusso.
- Impostare TiO 2 destinazione nel sistema sputtering a radiofrequenza (RF). Fissare i coprioggetti su un supporto campione del materiale sputtering utilizzando un nastro poliimmide. Collocare il supporto del campione nella camera di sputtering. Evacuare la camera fino a quando la pressione raggiunge 2.0 × 10 -4 Pa.
- Introdurre gas Ar nella camera e impostare la pressione di deposizione a 4,0 mTorr. Pur mantenendo l'otturatore chiuso, aumentare gradualmentela potenza RF a 70 W.
- Aprire l'otturatore e sputter per 15 minuti per ottenere una pellicola con uno spessore di 120-150 nm (Figura 1: Fase A). Tasso di crescita del film deve essere derivato per ciascuna macchina.
2. Surface Coating con cellulare repellente Film
- Hydrophilize superficie TiO 2 trattando il campione con O 2 al plasma, seguendo le istruzioni fornite dal produttore del reattore al plasma. Trattiamo il campione per 5 minuti a 200 W con O 2 flusso di 100 sccm. Immergere il campione in DDH 2 O e confermare che la superficie è superidrofilia. Asciugare accuratamente la superficie sotto N 2 flusso.
- Preparare la soluzione 1 octadecyltrichlorosilane mm (OTS) con l'aggiunta di 39,6 OTS microlitri per 100 ml di toluene. Immergere il campione nella soluzione per 1 ora a RT. Condurre questo passaggio all'interno di un sacchetto 2 guanto -filled N (Figura 1: Fase B).
- Per rimuovere molecole physisorbed, sonicate il campione in toluene, acetone, etanolo, e DDH 2 O per 5 minuti ciascuno, in questo ordine. Sciacquare il campione quattro volte in acqua dolce DDH 2 O e asciugare la superficie sotto N 2 flusso. La superficie deve essere idrofobica con un angolo di contatto di 100-110 °.
3. Ex-Situ Patterning Surface
- Lavorare in una cappa a flusso laminare, disegnare diversi segni di graffi con una punta per tracciare diamante sulla superficie. I segni aiutano a tenere traccia delle regioni elaborati e anche portare i microscopi a fuoco. Sterilizzare il TiO OTS rivestite 2 immergendo il campione in etanolo al 70% per 5 min. Risciacquare il campione due volte nel sterile DDH 2 O.
- Trasferire il campione in un piatto da 35 mm, e aggiungere 2 ml di terreno di coltura PC12 (vedi punto 4.2). Incubare per oltre 3 ore in un incubatore CO 2 (37 ° C). Questa procedura è destinata a far albumine sieriche assorbono sulla superficie. Albumine adsorbite inibiscono conseguente assorbimento di altri proteins e cellule (Figura 1: fase c).
- Durante l'attesa, impostare il microscopio a fluorescenza invertito.
- Accendere la lampada ad arco, inserire il cubo di filtro UV, e impostare la lente dell'obiettivo a 20X.
- Misurare l'intensità della luce I (W cm -2) usando un misuratore UV intensità, e calcolare il tempo di irradiazione t (in secondi) per una dose di d (in cm -2 J) come: t = d / I.
Ad esempio, per irradiare alla dose di 200 J cm -2 utilizzando una sorgente luminosa di 600 mW cm -2, è richiesta 333 sec di irradiazione. - Utilizzare un micrometro e chiudere il diaframma di campo per impostare la dimensione della regione da irradiare, ad esempio, 200 micron.
- Dopo l'incubazione 3 ore, integrare la media con 200 ml di 3,0 mg ml -1 di collagene di tipo-IV (Col-IV; finali concentrazione di 300 ug ml -1).
- Trasferire il piatto 35 mm al palco microscopio. Trova il graffio marca fuoco il microscopio sulla superficie del campione, e irradiare luce UV con una dose di 200 J cm -2 (Figura 1: Fase D). La zona di irradiazione UV può essere modificata sia regolando l'apertura del diaframma di campo o sostituendo il diaframma di campo con una maschera metallica della geometria arbitrale.
- Sostituire la media con un mezzo di coltura fresco (senza Col-IV), e posizionare il campione torna in incubatrice.
Cultura 4. cellulare
- Routine coltura di cellule PC12 è effettuata su un piatto di plastica rivestita di collagene.
- Per rivestire un piatto di tessuto-cultura di 60 mm, con Col-IV, prima bagnare la superficie con DDH 2 O e aspirare tutto DDH 2 O.
- Preparare 300 mg ml -1 Col-IV diluendo la soluzione originale (3 mg ml -1) 10x con DDH 2 O.
- Aggiungere 200 ml di 300 mcg ml -1 Col-IV per 60-mm piatto. Lasciate che la soluzione di diffondersi attraverso la superficie.
- Dry tha piatto in una cappa a flusso laminare per circa 1 ora.
- Lavare la superficie due volte con 4 ml di tampone fosfato salino di Dulbecco (D-PBS). Quando non si usa subito il piatto rivestito, lavare il piatto una volta con 4 ml di DDH 2 O. Dopo aspirazione DDH 2 O, riporre il piatto in incubatrice. Cercate di non conserverà per più di due settimane.
- Cellule PC12 sono coltivate in un terreno di coltura costituito da: medio (glucosio basso) modificato Eagle Dulbecco + 10% siero fetale bovino + 5% soluzione cavallo penicillina streptomicina siero + 1%. Incubare le cellule in un incubatore CO 2 (37 ° C, 5% CO 2), e sostituire la metà del mezzo ogni altro giorno. Passage cellule prima che raggiungano confluenza.
- Aspirare il terreno di coltura, e aggiungere 2 ml di PBS + (D-PBS + 10 mg ml -1 albumina di siero bovino (BSA) + EDTA 10 mM) preriscaldata a 37 ° C. Incubare per 5 min a 37 ° C. Battere delicatamente il piatto di staccare tutti cells.
- Raccogliere le cellule in un tubo da 15 ml. Sciacquare il piatto con 3 ml di fresco D-PBS, preriscaldata a 37 ° C.
- Centrifugare la provetta a 150 g per 4 min.
- Aspirare il surnatante e aggiungere 1 ml di mezzo di crescita.
- Per la cultura di routine, dividere le celle 1: 3 a 1: 5.
- Per piastra cellule sul campione modificato UV OTS / TiO 2, contare densità cellulare e aggiungere 3,0 x 10 5 cellule in un piatto da 35 mm (Figura 1: Stadio E). Incubare il piatto in incubatrice umidificata (37 ° C, 5% CO 2) per 1-2 giorni. Entrambi fattore di crescita ingenuo e nervoso (NGF), le cellule PC12 -differentiated possono essere utilizzati per gli esperimenti patterning. Per NGF differenziazione, 100 ng ml -1 di 7S-NGF viene aggiunto alla crescita media diversi giorni prima placcatura le cellule sul campione. NGF-differenziazione sembra aumentare la adhesibility delle cellule PC12 e facilita la manipolazione, specialmente nella in-situ e patterningxperiments.
5. In-Situ Patterning Surface
- Dopo 1-2 giorni di coltura sulla superficie ex situ modificato, confermano che le cellule sono Collegamento e cresce solo sulla regione UV irradiata. Impostare il microscopio, come descritto al punto 3.4.
- Trasferire il campione in un piatto di coltura di tessuti da 35 mm contenente il mezzo di crescita, 100 ng ml -1 NGF (nel caso di utilizzo di cellule NGF dissociati), e 100 mg ml -1 Col-IV.
- Porre la capsula sul palco microscopio. Trovare la posizione appropriata, e irradiare luce UV con una dose di 200 J cm -2 (Figura 1: Fase F, G). La regione permissiva appena creato viene indicato con un asterisco nella figura 1: Punto G.
- Prova a completare l'elaborazione di un singolo campione entro 30 minuti. Dopo l'irraggiamento, trasferire il campione di nuovo nel mezzo senza Col-IV.
- Fare molta attenzione quando si trasporta il piatto con cucellule ltured e trasferimento del campione dal piatto per piatto per evitare il distacco delle cellule fantasia.
Figura 1. Schema di processo globale. Vedere il testo per i dettagli. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Representative Results
Figura 2A mostra un'immagine in sezione microscopia elettronica a scansione (SEM) della TiO 2 film di sputtering depositato. Dall'osservazione, spessore del film è stata stimata essere di circa 150 nm. Notevole ecco la planarità del depositato TiO 2 film. Ulteriori analisi mediante microscopia a forza atomica (AFM) ha rivelato che la radice quadrata media (RMS) rugosità della superficie era di 0,2 nm (Figura 2B).
Quando la superficie TiO 2 è modificato con OTS e poi immerso in un mezzo di coltura contenente siero, albumine sieriche adsorbono sulla superficie OTS e inibiscono successivo adsorbimento di proteine e adesione cellulare 18,20. Successivamente, quando la luce UV concentrata viene irradiata sulla superficie, specie reattive dell'ossigeno (ROS) vengono generati sulla superficie TiO 2 21, che si decompongono il OTS monostrato auto-assemblato (SAM) su TiO 2 e rimuovere il SAM e un adsorbitolbumins dalla superficie. Questo rende la regione irradiata idrofila e permissiva per l'adsorbimento di proteine. Interazione diretta del ROS con albumine poteva accadere simultaneamente, ma la decomposizione di OTS dovrebbe essere la reazione principale, poiché OTS SAM di interfaccia albumina e TiO 2. Nel protocollo corrente, una proteina della matrice extracellulare Col-IV è integrato nel mezzo durante l'irraggiamento, e Col-IV adsorbe preferenzialmente alla regione UV irradiata in cui vengono rimossi albumine (Figura 3A). Altre proteine quali fibronectina possono essere modellati nello stesso protocollo (Figura 3B), indicando la versatilità di questo approccio.
Albumine siero, che sono anche presenti nel terreno al momento di irradiazione UV, dovrebbero anche essere assorbito da regione irradiata, ma i risultati suggeriscono che la quantità non è superiore a quella sul intatta OTS SAM. A conferma di ciò, abbiamo studiato la differenza nella affinità di BSAper OTS-UV irradiati e intatti SAM di microscopia a fluorescenza di colorante marcata con BSA. Per questo esperimento, la luce UV è stata irradiata focalizzato alla / TiO 2 OTS campione che non è stato immerso nella sostanza contenente siero, e quindi il campione è stato immerso in una soluzione di BSA marcata con fluoresceina. Figura 3C mostra lo schema di adsorbimento BSA. Brighter fluorescenza nella regione OTS SAM intatto rispetto all'area-UV irradiata indica che la quantità di adsorbita BSA è più elevato nella regione intatta. Il meccanismo di adsorbimento preferenziale può essere compreso dalla differenza in idrofobicità delle due regioni. La quantità di BSA adsorbimento è noto per essere maggiore sulle superfici idrofobiche 22, e la regione OTS SAM intatto è più idrofobico rispetto alla regione UV irradiata 18.
Il modello di Col-IV così creato funge da impalcatura per l'adesione cellulare. Figura 4A mostra le cellule PC12 NGF dissociati coltivate su un n ex situ regione modellato per 1 giorno. Successivamente, la luce UV è stata irradiata al lato di un micropattern, e le cellule sono state coltivate per altri 5 giorni. Come mostrato in Figura 4B-D, le cellule migrate ulteriormente alla regione modificata, indicando che l'affinità delle cellule della superficie è stata modificata con successo in ambiente di coltura cellulare.
Figura 2. Caratterizzazione del film TiO 2. (A) immagine trasversale SEM del campione. Immagine (B) AFM della superficie di TiO2. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 3. Site-selettiva adsorbimento di proteine Onto regione UV-irradiato. (A) collagene marcato con fluoresceina (200 micron modello ottagonale) e (B) rodamina marcato fibronectina (100 micron quadrato). Adsorbimento preferenziale di queste proteine si basa sulla mancanza di albumine che bloccano delle proteine (C). Si noti che in (C), OTS SAM non è stato immerso in un mezzo contenente siero prima dell'applicazione di fluoresceina BSA. Bar Scala, 100 micron (A) e 50 micron (B, C). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. ex situ che in situ patterning di cellule PC12. (A) adesione delle cellule PC12 su una regione ex situ modellata. Ottagono tratteggiata indica il sito di in-situ irradiazione UV. (B - D) La migrazione delle cellule PC12 alla regione in situ modellato, a 2 giorni (B), 3 giorni (C), e 5 giorni (D) dopo irradiazione. Barra della scala, 200 micron. Modificata con il permesso di Yamamoto et al., 18. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Nel nostro attuale protocollo, TiO 2 film è stato formato da RF-magnetron sputtering. Favoriamo questo metodo di deposito in quanto ci permette di preparare in modo riproducibile un fotocatalitico TiO 2 film con una rugosità sub-nm. Anche se i processi di deposizione sputtering sono familiari a scienziati dei materiali e ingegneri elettronici, potrebbe non essere abbastanza accessibile per i biologi. In tal caso, TiO 2 film di spin-rivestite sarebbe una scelta alternativa 23. In questo metodo, TiO 2 nanoparticelle disciolti in un solvente si sviluppa su una superficie del substrato per forza centrifuga. Apparecchiatura speciale necessaria è un coater rotazione, che è molto più conveniente di un sistema di sputtering. Abbiamo usato per noi un TiO 2 film di nanoparticelle spin-rivestito e hanno confermato che il film può essere utilizzato anche per eseguire esperimenti simili (dati non mostrati). La superficie del TiO 2 film di spin-rivestita è relativamente ruvida con una rugosità rms di diverse decines di nm, e ci vuole un po 'di pratica per ricoprire uniformemente il substrato riproducibile soprattutto quando più i rivestimenti di rotazione sono necessari per ottenere film di spessore. Tuttavia, il metodo potrebbe essere il primo candidato per i biologi.
Finora, abbiamo utilizzato questo metodo in patterning non solo le cellule PC12, ma anche una linea di cellule del pancreas cancro umano ASPC-1 e neuroni primari ottenuti da ippocampi di ratto embrionali 19. Adhesibility di ASPC-1 le cellule sono molto più forte di quella delle cellule PC12 o neuroni dell'ippocampo, e l'integrazione di molecole ponteggi, come il collagene, non è stato richiesto in loro patterning. Abbiamo tuttavia notare che non specifico adesione delle cellule alla regione non irradiata è stata occasionalmente osservata, che è probabilmente dovuta a difetti del OTS SAM.
Neuroni primari patterning erano molto più impegnativo in quanto il loro adhesibility è debole. Infatti, la fase critica del processo corrente sta nella corretta adsorbimentodi impalcature molecole. Una semplice supplementazione di collagene o laminina era insufficiente per aumentare l'affinità della regione modificato per i neuroni. La cultura tradizionale di neuroni dell'ippocampo si basa sulla carica positiva peptide poli-lisina per rivestire la superficie del vetrino 24. In questo contesto, inducendo attacco selettivo di poli-lisina alla zona UV-irradiato è desiderato, ma era impossibile dal poli-lisina adsorbito sulla regione OTS SAM intatta pure. Abbiamo provato altri rivestimenti superficiali, come il polietilene glicole-silano SAM e perfluoro-silano SAM, per scoprire che nessuno di questi erano antivegetativa a poli-lisina. Per risolvere questo problema, abbiamo molto recentemente dimostrato che una molecola reticolazione può essere utilizzato per indurre l'adsorbimento delle molecole attive ponteggio sulla regione UV irradiata 19. Tale selezione di molecole ponteggi e l'ottimizzazione della sua concentrazione deve essere eseguita per ogni esperimento.
Dose di irradiazione UVdovrebbe essere ottimizzato quanto influisce fortemente la quantità di proteina adsorbimento. Nel nostro caso, la misurazione dell'intensità di fluorescenza è stato usato per derivare una dose ottimale UV di 200 J cm -2 18. Il valore può variare a seconda dei parametri sperimentali, quali lo spessore e la cristallinità del film TiO 2.
Tra le varie tecniche di in-situ modifica superficiale sviluppati finora, il vantaggio principale del presente metodo è che non richiede la sintesi organica di molecole specializzate per la lavorazione superficiale. Il metodo qui presentato è, in linea di principio, compatibile con film organici preparati dalla vasta libreria di polimeri disponibili in commercio, peptidi e precursori SAM. È anche favorevole in un senso che il processo di superficie-modifica può essere effettuata con apparecchiature di laboratorio convenzionale, come un microscopio a fluorescenza a grande campo dotato di una lampada a vapori di mercurio, come è stato qui illustrato. Utilizzandoun laser UV come sorgente luminosa, risoluzione subcellulare fino a ~ 3 micron per (dati non mostrati).
Alcune limitazioni del metodo corrente comprendono l'irreversibilità della modificazione superficiale, hanno bisogno di integrare molecole ponteggi nel mezzo, e la generazione di ROS. Il processo qui descritto è applicabile non permissive per la conversione permissiva della superficie, ma la conversione è unidirezionale e non può essere invertita. Per gli esperimenti che richiedono la conversione inversione di affinità delle cellule, altri metodi 15 devono essere considerati. Inoltre, il nostro processo richiede molecole ponteggi come il collagene da bagno applicata al mezzo di coltura cellulare. Dal momento che la popolazione di cellule pre-modellata inevitabilmente esposta alle molecole, questo può limitare alcune applicazioni di questo processo. Generazione di ROS Photocatalyzed, come i radicali idrossilici, in corrispondenza della zona-UV irradiata può essere tossico per le cellule vicine, ma, almeno, questo effetto non eraosservata nei nostri esperimenti. Anche se questo diventa importante per altre applicazioni, questo problema dovrebbe essere risolto integrando deossigenanti in terreno di crescita. Poiché l'ossigeno scavenging molecole non sarebbe situato tra il TiO 2 e le molecole non permissive sulla sua superficie, si prevede di eliminare l'eccessiva ROS senza influenzare la cinetica del processo patterning.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass coverslip | Warner Instruments | CS-15R15 | 15 mm diameter, #1.5 thickness |
| Diamond scriber | Ogura Jewel Industry | D-Point Pen | |
| RF sputtering system | ANELVA | SPC350 | |
| TiO2 sputtering target | Kojundo Chemical Lab | Titanium (IV) oxide, target | Purity, 99.9% |
| Plasma reactor | Yamato | PR301 | |
| n-octadecyltrichlorosilane (OTS) | Aldrich | 104817 | |
| Toluene | Wako | 204-01866 | |
| Tissue-culture dish (35 mm) | Greiner | 627160 | |
| Tissue-culture dish (60 mm) | BD Falcon | 353002 | |
| Type-IV collagen | Nitta Gelatin | Cellmatrix Type IV | |
| D-PBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | Heat-inactivate and pass through a 0.22 μm filter before use |
| Horse serum | Gibco | 26050-088 | Pass through a 0.22 μm filter before use |
| Penicillin-streptomycin (100x) | Nacalai tesque | 26253-84 | |
| 7S nerve growth factor (NGF) | Alomone Labs | N-130 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| EDTA | Dojindo | N001 | Stock solution in 0.5 M |
| TiO2 nanoparticle | Tayca | TKD-701 |
References
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