Abstract
Os contaminantes orgânicos adsorvidos sobre a superfície de dióxido de titânio (TiO 2) pode ser decomposto por fotocatálise sob luz ultravioleta (UV). Descrevemos aqui um novo protocolo empregando o TiO 2 fotocatálise para alterar localmente afinidade de células da superfície do substrato. Para esta experiência, uma fina película de TiO2 era de uma lamela de vidro revestido por borrifamento, e a superfície de TiO2 foi posteriormente modificado com um derivado de organo-silano monocamada octadecyltrichlorosilane (OTS), que inibe a adesão celular. A amostra foi imersa em um meio de cultura celular, e focada luz UV foi irradiada para uma região octogonal. Quando uma linha celular de células PC12 neuronais foram plaqueadas sobre a amostra, as células aderiram apenas na área de irradiação com UV. Mostramos ainda que esta modificação da superfície pode também ser realizada in situ, ou seja, mesmo quando as células estão em crescimento sobre o substrato. Modificação adequada da superfície necessária uma matriz extracelular protein colagénio de estar presente no meio no momento da irradiação UV. A técnica aqui apresentada pode, potencialmente, ser empregues em vários tipos de células para a construção de sistemas de padronização ou co-cultura para manipular células arbitrariamente sob cultura.
Introduction
Processos de litografia de semicondutores e seus derivados, tais como 1,2 - fotolitografia, litografia por feixe de electrões 3-6, e microcontact impressão 7-10 - tornaram-se agora uma ferramenta estabelecida na biologia das células para crescer as células vivas numa posição definida e geometria. O método baseia-se na modelação da utilização de substratos microfabricados, que consiste em micro-ilha de revestimento celular permissiva em um fundo não permissiva. Tal substrato serve como um modelo padrão para as células. Essas tecnologias nos forneceu os novos métodos para manipular células e sua função em um nível simples e multi-celular, para extrair as propriedades intrínsecas das células, e para aumentar a taxa de transferência com base em células de triagem de drogas 11.
O grau de liberdade na modelação de células aumentariam grandemente, se a geometria do modelo padrão pode ser alterada in situ, ou seja, enquanto que as células são cultivadas sobre o Sseu rosto. Os métodos convencionais para a formação de padrão não pode ser directamente aplicados aqui, uma vez que eles processam amostras em atmosfera ou em vácuo. Por isso têm sido propostos várias novas técnicas de modificação de superfície, que se baseiam, por exemplo, em compostos fotorreactivos 12,13 ou ablação a laser 5,14, apenas para citar alguns. Os métodos propostos foram bem avaliada pelo Robertus et al. 15, e mais recentemente por Choi et al. 16 e 17 por Nakanishi.
Aqui neste artigo, descreve-se um novo protocolo de modificação in situ superfície, o que tira proveito da decomposição fotocatalítica de moléculas orgânicas num dióxido de titânio (TiO2) de superfície 18,19. Neste método, é inserida uma película de TiO2 entre o substrato de vidro e o filme orgânico que faz interface das células, e o filme orgânico é decomposto in situ por localmente irradiação ultravioleta (UV)luz de uma região de interesse (λ <388 nm). Mostra-se que o novo protocolo pode ser utilizado para criar micropadrões de proteínas da matriz extracelular e células vivas tanto ex situ e in situ. TiO 2 é biocompatível, quimicamente estável e opticamente transparentes, recursos de que o torna amigável para introduzir em experimentos de cultura celular. Este protocolo fornece uma alternativa ciência dos materiais à base de andaimes para a modificação de cultura celular no ambiente de cultura de células.
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Protocol
1. Preparação de TiO 2 -Revestido vidro Lamela
- Número as lamelas usando um riscador de diamante. Isso ajuda não só para manter o controle de cada lamelas, mas também para garantir que o lado correto da amostra está virada para cima. Limpar as lamelas, pela primeira vez sob a executar ddH2O, seguida por imersão em solução de piranha (H 2 SO 4: H 2 O 2 = 4: 1). Após 10 minutos, enxaguar as lamelas completamente, 8 vezes em ddH 2 O. Secam-se as lamelas em fluxo de N2.
- Definir TiO2 alvo no sistema de pulverização de rádio-frequência (RF). Anexar as lamelas em um suporte de amostra do dispositivo de pulverização utilizando uma fita de poliimida. Coloque o suporte de amostras na câmara de pulverização. Evacuar a câmara até a pressão atingir 2,0 x 10 -4 Pa.
- Introduzir Ar gasoso para dentro da câmara e ajustar a pressão de deposição a 4,0 mTorr. Enquanto mantém o obturador fechado, aumentar gradualmentea energia RF a 70 W.
- Abrir o obturador e por pulverização catódica durante 15 minutos para se obter uma película com uma espessura de 120-150 nm (Figura 1: Passo A). A velocidade de crescimento do filme necessita de ser derivada para cada máquina.
2. Revestimento de Superfícies com Cell-repelente Film
- Hidrofilizar a superfície de TiO 2, tratando a amostra do plasma com O 2, seguindo as instruções fornecidas pelo fabricante do reactor de plasma. Nós tratar a amostra durante 5 minutos a 200 W com O2 fluxo de 100 sccm. Mergulhe a amostra em DDH 2 O e confirmar que a superfície é superhydrophilic. Secar completamente a superfície sob fluxo de N2.
- Preparar a solução 1 mM octadecyltrichlorosilane (OTS) por adição de 39,6 ul de OTS 100 ml de tolueno. Imergir a amostra na solução durante 1 h à TA. Realizar este passo dentro de um saco de luvas -filled 2 N (Figura 1: Etapa B).
- Para remover moléculas physisorbed, sonicate a amostra em tolueno, acetona, etanol, e ddH2O durante 5 min cada, por essa ordem. Lavar a amostra quatro vezes em fresco ddH2O e secar a superfície sob um fluxo de N2. A superfície deve ser hidrofóbico com um ângulo de contacto de 100-110 °.
3. Ex-Situ Superfície Patterning
- Trabalhando em fluxo laminar capô, desenhe várias marcas de arranhões com um riscador de diamantes na superfície. As marcas de ajudar a manter o controle das regiões processados e também trazendo microscópios em foco. Esteriliza-se o TiO 2 OTS-revestidos por imersão da amostra em etanol a 70% durante 5 min. Em seguida, enxaguar a amostra duas vezes em esterilizado DDH 2 O.
- Colocar a amostra em um prato de 35 mm, e adicionar 2 ml de meio de crescimento PC12 (ver Passo 4.2). Incubar durante mais 3 horas num incubador de CO2 (37 ° C). Este procedimento destina-se a deixar albuminas do soro absorvem na superfície. Albuminas adsorvido inibir a adsorção posterior de outros proteins e células (Figura 1: o passo c).
- Enquanto espera, configurar o microscópio de fluorescência invertido.
- Ligue a lâmpada de arco, insira o cubo filtro UV, e definir a lente objetiva de 20X.
- Medir a intensidade da luz I (W cm-2) utilizando um medidor de intensidade de UV, e calcular o tempo de irradiação t (em segundos) para uma dose de d (em J cm-2) como: t = d / I.
Por exemplo, para irradiar a uma dose de 200 J cm-2 utilizando uma fonte de luz de 600 mW cm de -2, é necessária a irradiação de 333 seg. - Usar um micrómetro de plataforma e fechar o diafragma de campo para definir o tamanho da região a ser irradiada, por exemplo, 200 um.
- Após a incubação de 3 horas, completar o meio com 200 mL de 3,0 mg ml -1 de colágeno tipo IV (Col-IV; finais concentração de 300 ug ml -1).
- Transferir a 35 mm de prato de platina do microscópio. Encontre o zero marca, focar o microscópio sobre a superfície da amostra, e irradiar luz UV, numa dose de 200 J cm-2 (Figura 1: Passo D). A área de irradiação UV pode ser alterado quer através do ajuste da abertura do diafragma de campo ou por substituição do diafragma de campo com uma máscara metálica de geometria de arbitragem.
- Substituir o meio com um meio de crescimento fresco (sem Col-IV), e colocar a amostra de volta na incubadora.
4. Cultura celular
- Cultura de rotina de células PC12 é levada a cabo em um prato de plástico revestidas com colagénio.
- Para revestimento de 60 mm de cultura de tecidos prato com Col-IV, primeiro molhar a superfície com DDH 2 O e aspirar tudo DDH 2 O.
- Preparar 300 ng mL -1 Col-IV por diluição da solução original (3 mg ml-1) 10x com ddH 2 O.
- Adicionar 200 ul de 300 ng mL -1 Col-IV por 60 mm de prato. Deixe a solução se espalhar através da superfície.
- Seco tele prato em uma câmara de fluxo laminar durante aproximadamente 1 h.
- Lavar a superfície duas vezes com 4 ml de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (D-PBS). Quando não utilizar a placa revestida imediatamente, lavar o prato uma vez com 4 ml de DDH 2 O. Após aspiração DDH 2 O, armazenar o prato na incubadora. Tente não para mantê-lo guardado por mais de duas semanas.
- As células PC12 são cultivadas num meio de crescimento, que consiste em: meio (baixo teor de glucose) de Eagle modificado por Dulbecco solução de penicilina-estreptomicina + 1% de soro + 10% de soro fetal de bovino a 5% + cavalo. Incubar as células em uma incubadora de CO 2 (37 ° C, 5% de CO 2), e substituir metade do meio todos os outros dias. Células de passagem antes que eles atinjam confluência.
- Aspirar o meio de crescimento, e adicionar 2 ml de PBS + (D-PBS + 10 mg mL -1 de albumina de soro bovino (BSA) + EDTA a 10 mM) pré-aquecido a 37 ° C. Incubar durante 5 min a 37 ° C. Bata levemente o prato para retirar todo cells.
- Recolher as células num tubo cónico de 15 ml. Lavar a placa com 3 ml de D-PBS fresco, pré-aquecido a 37 ° C.
- Centrifuga-se o tubo a 150 × g durante 4 min.
- Aspirar o sobrenadante e adicionar 1 ml de meio de crescimento.
- Para cultura de rotina, dividir as células 1: 3 a 1: 5.
- Ao prato células na OTS / TiO 2 amostra modificada-UV, contar densidade de células e adicionar 3,0 × 10 5 células em um prato de 35 mm (Figura 1: Passo E). Incubar a placa na incubadora humidificada (37 ° C, 5% CO2) durante 1-2 dias. Tanto o factor de crescimento ingénuos e do nervo (NGF), as células PC12 -differentiated pode ser usado para as experiências de modelação. Para a diferenciação de NGF, 100 ng ml -1 de 7S-NGF é adicionado ao meio o crescimento de vários dias antes do plaqueamento das células na amostra. NGF-diferenciação parece aumentar a adhesibility das células PC12 e torna o manuseamento mais fácil, especialmente no in situ e padronizaçãoxperiments.
5. In Situ superfície de modelação
- Após 1-2 dias de cultura na superfície do ex-situ modificado, confirmar que as células estão a crescer e anexar apenas na região do irradiadas com UV. Defina-se o microscópio, conforme descrito no Passo 3.4.
- Transferir a amostra para um novo 35-mm de placa de cultura de tecidos contendo o meio de crescimento, 100 ng ml -1 de NGF (no caso da utilização de células diferenciadas por NGF), e 100? G ml -1 Col-IV.
- Coloque o prato no palco microscópio. Localizar a posição adequada e irradiar luz UV, numa dose de 200 J cm-2 (Figura 1: Passo F, G). A região permissiva recém-criado é indicado com um asterisco na Figura 1: Passo G.
- Tente completar o processamento de uma única amostra no prazo de 30 min. Após a irradiação, transferir a amostra de volta para o meio sem Col-IV.
- Tenha muito cuidado ao transportar o prato com cucélulas ltured e transferir a amostra do prato de prato para evitar desanexação das células estampados.
Figura 1. Ilustração esquemática do processo global. Veja o texto para maiores detalhes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Representative Results
A Figura 2A apresenta uma imagem de microscopia electrónica de varrimento do corte transversal (SEM) do TiO 2 filme depositado por borrifamento. A partir da observação, da espessura do filme foi estimada como sendo de aproximadamente 150 nm. Perceptível aqui é a planura do filme depositado de TiO 2. Uma análise mais aprofundada por microscopia de força atômica (AFM) revelou que a rugosidade root mean square (RMS) da superfície foi de 0,2 nm (Figura 2B).
Quando a superfície do TiO 2 é modificado com OTS e depois imersos num meio de crescimento contendo soro, albuminas do soro adsorvido sobre a superfície do OTS e inibir a subsequente adsorção de proteínas e adesão celular 18,20. Subsequentemente, quando a luz UV focalizada é irradiada para a superfície, as espécies de oxigénio reactivas (ROS) são gerados na superfície de TiO 2 21, que se decompõem a OTS monocamada auto-montada (SAM) em TiO 2 e remover o SAM e adsorvida a umlbumins da superfície. Isto torna a região irradiada hidrófilo e permissiva para adsorção de proteínas. Interação direta do ROS com albuminas pode estar ocorrendo simultaneamente, mas a decomposição do OTS deve ser a reacção principal, uma vez que está a interagir OTS SAM albumina e TiO 2. No protocolo de corrente, uma proteína da matriz extracelular Col-IV é suplementado no meio durante a irradiação, e Col-IV adsorve preferencialmente à região de irradiadas com UV, onde albuminas são removidos (Figura 3A). Outras proteínas, tais como a fibronectina pode ser modelado no mesmo protocolo (Figura 3B), indicando a versatilidade desta abordagem.
Albuminas do soro, que também estão presentes no meio no momento da irradiação UV, também deve adsorver a região irradiada, mas os resultados sugerem que a quantidade não é tão alta que no intacta OTS SAM. Para confirmar isso, investigou-se a diferença na afinidade de BSApara OTS irradiadas com UV e SAM intactas por microscopia de fluorescência de marcadas com corante de BSA. Para esta experiência, a luz UV focalizada foi irradiada para o / TiO 2 OTS amostra que não tenha sido imerso no meio contendo soro, e em seguida, a amostra foi imersa em solução de BSA marcado com fluoresceína. A figura 3C mostra o padrão de adsorção BSA. Fluorescência brilhante na região intacta OTS SAM que a área de irradiadas com UV indica que a quantidade de adsorvido BSA é superior na região intacta. O mecanismo de adsorção preferencial pode ser compreendido pela diferença na hidrofobicidade das duas regiões. A quantidade de BSA adsorção é conhecido por ser mais elevado em superfícies hidrofóbicas 22, e a região intacta OTS SAM é mais hidrófobo do que a região de 18 irradiadas com UV.
O padrão de Col-IV assim criado serve como suporte para a adesão celular. A Figura 4A mostra as células PC12 diferenciadas do NGF-cultivadas numa n ex-situ região modelada por 1 dia. Em seguida, a luz UV foi irradiada para o lado de um micropadrão, e as células foram cultivadas durante mais 5 dias. Como mostrado na Figura 4B-D, as células migraram para além da região modificada, indicando que a afinidade da superfície celular foi modificada com êxito no ambiente de cultura de células.
Figura 2. Caracterização do filme de TiO 2. (A) imagem de corte transversal SEM da amostra. Imagem (B) AFM da superfície do TiO 2. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 3. selectiva-site adsorção de proteínas sobre a região irradiadas com UV. (A) de colagénio marcado com fluoresceina (200 um padrão octogonal) e (B) de fibronectina marcada com rodamina (100 um padrão quadrado). Adsorção preferencial destas proteínas baseia-se na ausência de albuminas que bloqueiam a adsorção de proteínas (C). Note-se que em (C), OTS SAM não foi imersa em meio contendo soro, antes da aplicação de BSA marcado com fluoresceína. Barras de escala, 100 mm (A) e 50 mm (B, C). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. ex-situ e in-situ padronização de células PC12. (A) A adesão das células PC12 para uma região ex-situ modelado. Octógono pontilhado indica o local de irradiação UV in situ. (B - D) migração de células PC12 à região modelada in situ, aos 2 dias (B), 3 dias (C) e 5 dias (d) decorridos após a irradiação. Barra de escala, de 200 mm. Modificada com a permissão de Yamamoto et al. 18. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Em nosso protocolo atual, TiO 2 filme foi formado por RF-pulverização catódica. Somos a favor deste método de deposição, uma vez que nos permite preparar de forma reprodutível um fotocatalítico TiO 2 filme com uma rugosidade sub-nm. Embora os processos de deposição por pulverização catódica são familiares aos cientistas de materiais e engenheiros eletrônicos, não pode ser bastante acessível para os biólogos. Nesse caso, o TiO 2 película revestida por rotação seria uma escolha alternativa 23. Neste método, o TiO 2 nanopartículas dissolvido num solvente é espalhado sobre uma superfície de substrato por meio de força centrífuga. Equipamento especial é necessário um aplicador de rotação, que é muito mais barato do que um sistema de pulverização catódica. Nós temos utilizado para se estabeleceu uma película de nanopartículas revestidas de rotação de TiO 2 e confirmaram que a película também pode ser utilizado para levar a cabo experiências semelhantes (dados não mostrados). A superfície do TiO 2 película revestida-spin é comparativamente áspero com uma rugosidade rms de várias dezenass de nm, e é preciso alguma prática para revestir uniformemente o substrato reproducibly especialmente quando vários revestimentos de spin são necessários para obtenção de filmes espessos. No entanto, o método pode ser o primeiro candidato para biólogos.
Até agora, nós utilizamos este método em padronização não só as células PC12, mas também uma linha de células do cancro pancreático humano AsPC-1 e neurônios primários obtidos a partir de hipocampo de ratos embrionários 19. Adhesibility de AsPC-1 células são muito mais fortes do que a de células PC12 ou neurónios do hipocampo, e suplementação de moléculas de andaimes, como o colágeno, não era necessária na padronização eles. Nós ainda notar que a adesão não específica das células para a região não irradiado foi ocasionalmente observada, que é, provavelmente, devido a defeitos no OTS SAM.
Neurônios primários de padrões eram muito mais desafiador desde a sua adhesibility é fraca. De facto, o passo crítico do processo de corrente situa-se na adsorção adequadaandaime de moléculas. Um simples suplemento de colágeno ou laminina foi insuficiente para aumentar a afinidade da região modificados para os neurônios. Cultura de neurónios do hipocampo convencional baseia-se carregada positivamente péptido poli-lisina para revestir a superfície da lamela 24. Neste contexto, induzindo a ligação selectiva da poli-lisina para a área de UV-irradiado é desejado, mas era impossível, uma vez adsorvida poli-lisina na região OTS SAM intacto bem. Tentámos outros revestimentos de superfície, tais como polietilenoglicol-silano SAMs e perfluoro-silano SAMs, ao descobrir que nenhum deles eram anti-incrustantes para poli-lisina. Para resolver este problema, muito recentemente, mostrou que uma molécula de ligação cruzada pode ser utilizado para induzir a adsorção activo das moléculas de andaimes para a região de 19 irradiadas com UV. Tal selecção de moléculas de andaimes e optimização da sua concentração deve ser realizada para cada experiência.
Dose de irradiação UVdeve também ser optimizada, uma vez que afecta fortemente a quantidade de adsorção de proteínas. No nosso caso, a medição da intensidade de fluorescência foi utilizada para derivar uma dose de UV de 200 óptima J cm-2 18. O valor pode variar dependendo dos parâmetros experimentais, tais como a espessura e a cristalinidade do filme de TiO 2.
Entre as várias técnicas in situ de modificação da superfície desenvolvidos até agora, uma grande vantagem do presente método é que ele não requer síntese orgânica de moléculas especializadas para o tratamento de superfície. O método aqui apresentado é, em princípio, compatível com as películas orgânicos preparados a partir da biblioteca de polímeros vasta comercialmente disponíveis, peptídeos, e os precursores de SAM. Também é favorável no sentido de que o processo de modificação de superfície pode-ser levada a cabo utilizando equipamento de laboratório convencional, tal como um microscópio de fluorescência de campo amplo equipado com uma lâmpada de arco de mercúrio, tal como foi mostrado. Usandoum laser de UV como fonte de luz, a resolução subcelular até ~ 3 micrómetros pode ser conseguida (dados não mostrados).
Algumas limitações do método atual incluem a irreversibilidade da modificação da superfície, a necessidade de completar as moléculas de andaimes no meio, e geração de ROS. O processo aqui descrito é aplicável a não permissiva para conversão permissiva da superfície, mas a conversão é unidireccional e não pode ser revertida. Para as experiências que requerem a conversão de inversão de afinidade de células, outros métodos 15 devem ser considerados. Além disso, o processo requer moléculas de andaime, tais como o colagénio para ser banho-aplicada ao meio de cultura celular. Uma vez que a população de células pré-modelado, inevitavelmente, ser exposto às moléculas, isto pode limitar a alguma aplicação deste processo. Photocatalyzed geração de ROS, tal como os radicais hidroxilo, na região da irradiadas com UV pode ser tóxico para as células vizinhas, mas, pelo menos, este efeito não foiobservou nas nossas experiências. Mesmo se isso se torna proeminente para outras aplicações, este problema deve ser resolvido, completando absorvedores de oxigênio em meio de crescimento. Uma vez que a eliminação de oxigénio moléculas não estaria localizado entre o TiO 2 e as moléculas não permissivas na sua superfície, eles são esperados para eliminar excessiva de ERO sem afectar a cinética do processo de padronização.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass coverslip | Warner Instruments | CS-15R15 | 15 mm diameter, #1.5 thickness |
| Diamond scriber | Ogura Jewel Industry | D-Point Pen | |
| RF sputtering system | ANELVA | SPC350 | |
| TiO2 sputtering target | Kojundo Chemical Lab | Titanium (IV) oxide, target | Purity, 99.9% |
| Plasma reactor | Yamato | PR301 | |
| n-octadecyltrichlorosilane (OTS) | Aldrich | 104817 | |
| Toluene | Wako | 204-01866 | |
| Tissue-culture dish (35 mm) | Greiner | 627160 | |
| Tissue-culture dish (60 mm) | BD Falcon | 353002 | |
| Type-IV collagen | Nitta Gelatin | Cellmatrix Type IV | |
| D-PBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | Heat-inactivate and pass through a 0.22 μm filter before use |
| Horse serum | Gibco | 26050-088 | Pass through a 0.22 μm filter before use |
| Penicillin-streptomycin (100x) | Nacalai tesque | 26253-84 | |
| 7S nerve growth factor (NGF) | Alomone Labs | N-130 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| EDTA | Dojindo | N001 | Stock solution in 0.5 M |
| TiO2 nanoparticle | Tayca | TKD-701 |
References
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