TiO का प्रयोग जलीय वातावरण में प्रोटीन और कोशिकाओं Photopatterning Published: October 26, 2015 doi: 10.3791/53045

DOI

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Hideaki Yamamoto^1,2, Takanori Demura³, Kohei Sekine³, Sho Kono³, Michio Niwano^2,4, Ayumi Hirano-Iwata^2,5, Takashi Tanii⁶

¹Frontier Research Institute for Interdisciplinary Sciences, Tohoku University, ²CREST, Japan Science and Technology Agency, ³School of Fundamental Science and Engineering, Waseda University, ⁴Research Institute of Electrical Communication, Tohoku University, ⁵Graduate School of Biomedical Engineering, Tohoku University, ⁶Faculty of Science and Engineering, Waseda University

Abstract

टाइटेनियम डाइऑक्साइड की सतह ₍₂ Tio) पर adsorbed जैविक contaminants पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश के तहत photocatalysis द्वारा विघटित किया जा सकता है। यहाँ हम स्थानीय स्तर पर सब्सट्रेट सतह की सेल आत्मीयता को बदलने के लिए ₂ Tio photocatalysis रोजगार एक उपन्यास प्रोटोकॉल का वर्णन है। इस प्रयोग के लिए, एक पतली ₂ Tio फिल्म धूम में लिपटे एक गिलास coverslip पर था, और ₂ Tio सतह बाद में सेल आसंजन को रोकता है जो octadecyltrichlorosilane (ओटीएस) से ली गई एक organosilane monolayer, साथ संशोधित किया गया था। नमूना एक सेल संस्कृति माध्यम में डूबे, और पराबैंगनी प्रकाश एक अष्टकोणीय क्षेत्र के लिए किरणित था ध्यान केंद्रित किया गया। एक neuronal सेल लाइन PC12 कोशिकाओं के नमूने पर चढ़ाया गया है, कोशिकाओं केवल यूवी विकिरणित क्षेत्र पर पालन। हम आगे कोशिकाओं सब्सट्रेट पर बढ़ रहे हैं, तब भी जब यह सतह संशोधन भी यानी, बगल में प्रदर्शन किया जा सकता है। सतह के समुचित संशोधन एक बाह्य मैट्रिक्स पी आवश्यककोलेजन rotein पराबैंगनी विकिरण के समय में मध्यम में उपस्थित होने के लिए। यहां प्रस्तुत तकनीक संभावित संस्कृति के तहत कोशिकाओं coculture सिस्टम के निर्माण या मनमाने ढंग से हेरफेर करने के लिए patterning के अनेक प्रकार की कोशिकाओं में नियोजित किया जा सकता है।

Introduction

सेमीकंडक्टर लिथोग्राफी प्रक्रियाओं और उसके डेरिवेटिव - जैसे फोटोलिथोग्राफी ^1,2, इलेक्ट्रॉन बीम लिथोग्राफी ^{3-6, 7-10} और मुद्रण microcontact के रूप में - अब एक परिभाषित स्थिति और ज्यामिति में रहने वाले कोशिकाओं को विकसित करने के लिए कोशिका जीव विज्ञान में एक स्थापित उपकरण बन गए हैं। patterning विधि एक गैर अनुमोदक पृष्ठभूमि में सेल अनुमोदक कोटिंग की सूक्ष्म द्वीप से मिलकर, microfabricated substrates के उपयोग पर निर्भर करता है। इस तरह के सब्सट्रेट पैटर्न कोशिकाओं के लिए एक टेम्पलेट के रूप में कार्य करता है। इन प्रौद्योगिकियों हमें कोशिकाओं के आंतरिक गुणों को निकालने के लिए, और सेल आधारित दवा स्क्रीनिंग ¹¹ के throughput बढ़ाने के लिए, एक एकल और बहु-कोशिकीय स्तर पर कोशिकाओं और उनके कार्य करने के लिए इंजीनियर उपन्यास तरीकों प्रदान की है।

टेम्पलेट पैटर्न ज्यामिति यानी, बगल में बदला जा सकता है, तो कोशिकाओं रों पर सुसंस्कृत हैं, जबकि डिग्री के-स्वतंत्रता सेल patterning में काफी वृद्धि होगीurface। वे वातावरण में या शून्य में नमूने प्रक्रिया के बाद से पैटर्न गठन के लिए पारंपरिक तरीकों सीधे, यहां लागू नहीं किया जा सकता है। इसलिए विभिन्न नई सतह संशोधन तकनीकों बस कुछ ही नाम के लिए, photoreactive यौगिकों ^12,13 या लेजर पृथक ^5,14 पर, जैसे, आधार पर कर रहे हैं, जो प्रस्तावित किया गया है। प्रस्तावित तरीकों अच्छी तरह से चोई एट अल। ¹⁶ और नाकानिशी ¹⁷ से अधिक हाल ही में। रॉबर्ट एट अल द्वारा ¹⁵ समीक्षा की, और कर दिया गया है।

इस लेख में, हम एक टाइटेनियम डाइऑक्साइड पर कार्बनिक अणुओं के photocatalytic अपघटन का लाभ लेता है, जिसमें सीटू सतह संशोधन, ₍₂ TiO) सतह ^18,19 के एक उपन्यास प्रोटोकॉल का वर्णन है। इस विधि में, एक ₂ Tio फिल्म कांच सब्सट्रेट और कोशिकाओं इंटरफेस है कि जैविक फिल्म के बीच में डाला जाता है, और जैविक फिल्म स्थानीय स्तर पर पराबैंगनी (यूवी) irradiating से बगल में विघटित किया जाता हैब्याज की एक क्षेत्र (λ <388 एनएम) के लिए प्रकाश। हम नए प्रोटोकॉल बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन और जीवित कोशिकाओं दोनों पूर्व सीटू की और बगल में micropatterns बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ₂ Tio सेल संस्कृति प्रयोगों में लागू करने के लिए यह अनुकूल बनाता सुविधाओं, जिनमें से, biocompatible रासायनिक स्थिर, और ऑप्टिकली पारदर्शी है। इस प्रोटोकॉल सेल संस्कृति वातावरण में कोशिका-संस्कृति मचानों को संशोधित करने के लिए एक सामग्री विज्ञान आधारित विकल्प प्रदान करता है।

Protocol

TiO ₂ 1. तैयारी गिलास coverslip लिपटे

1. संख्या एक हीरे खुरचने का औजर का उपयोग कर coverslips। यह प्रत्येक coverslips का ट्रैक रखने के लिए, लेकिन यह भी नमूने के सही पक्ष का सामना करना पड़ रहा है यह सुनिश्चित करने के लिए न केवल मदद करता है। पहले पिरान्हा समाधान में उन्हें डुबो कर तब, DDH ₂ हे चलाने के अंतर्गत, coverslips साफ (एच ₂ अतः _4: एच ₂ ओ ₂ = 4: 1)। 10 मिनट के बाद, DDH ₂ ओ में, अच्छी तरह से 8 बार coverslips कुल्ला एन ₂ प्रवाह के तहत coverslips सूखी।
2. रेडियो-फ्रीक्वेंसी (आरएफ) sputtering प्रणाली में ₂ Tio लक्ष्य निर्धारित करें। एक Polyimide टेप का उपयोग sputtering उपकरण का एक नमूना धारक पर coverslips संलग्न। Sputtering कक्ष में नमूना धारक रखें। दबाव 2.0 × 10 तक पहुँच जाता है जब तक कक्ष खाली ^-4 फोनों के लिए।
3. कक्ष में गैस एर परिचय और 4.0 mTorr को बयान दबाव निर्धारित किया है। शटर बंद कर दिया रखते हुए, धीरे-धीरे वृद्धि70 डब्ल्यू आरएफ शक्ति
4. शटर खुला और 120-150 एनएम (चित्रा 1: चरण ए) की मोटाई के साथ एक फिल्म प्राप्त करने के लिए 15 मिनट के लिए धूम। फिल्म की वृद्धि दर प्रत्येक मशीन के लिए प्राप्त किया जा करने की जरूरत है।

सेल से बचाने वाली क्रीम फिल्म के साथ 2. सतह कोटिंग

1. प्लाज्मा रिएक्टर के निर्माता द्वारा दिए गए निर्देशों का पालन, हे ₂ प्लाज्मा के साथ नमूना के इलाज से ₂ Tio सतह Hydrophilize। हम 100 SCCM के ओ ₂ प्रवाह के साथ डब्ल्यू 200 पर 5 मिनट के लिए नमूना पेश आते हैं। DDH ₂ हे में नमूना विसर्जित कर दिया और सतह superhydrophilic है कि इस बात की पुष्टि। अच्छी तरह से ₂ एन प्रवाह के तहत सतह सूखी।
2. 100 मिलीलीटर टोल्यूनि को 39.6 μl ओटीएस जोड़कर 1 मिमी octadecyltrichlorosilane (ओटीएस) समाधान तैयार है। आरटी पर 1 घंटे के लिए समाधान में नमूना विसर्जित कर दिया। एक एन ₂ -filled दस्ताने बैग (: चरण बी चित्रा 1) के अंदर इस कदम का संचालन।
3. Physisorbed अणुओं को निकालने के लिए sonicatई टोल्यूनि, एसीटोन, इथेनॉल में नमूना है, और इसी क्रम में 5 मिनट प्रत्येक के लिए DDH ₂ हे। ताजा DDH ₂ हे में नमूना चार बार कुल्ला और एन ₂ प्रवाह के तहत सतह सूखी। सतह 100-110 डिग्री के साथ संपर्क कोण के साथ हाइड्रोफोबिक होना चाहिए।

3. पूर्व के आस सतह patterning

1. एक लामिना का प्रवाह हुड में काम करते हुए, सतह पर एक हीरे खुरचने का औजर के साथ कई खरोंच के निशान आकर्षित। निशान संसाधित क्षेत्रों का ट्रैक रखने के लिए और भी ध्यान में माइक्रोस्कोप लाने में मदद करते हैं। 5 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में नमूना डुबो कर ओटीएस में लिपटे ₂ Tio जीवाणुरहित। तब निष्फल DDH ₂ ओ में दो बार नमूना कुल्ला
2. एक 35 मिमी पकवान में नमूना प्लेस, और PC12 मध्यम विकास के 2 मिलीलीटर जोड़ने (4.2 कदम देखें)। सीओ ₂ इनक्यूबेटर में 3 घंटा (37 डिग्री सेल्सियस) के लिए सेते हैं। यह प्रक्रिया सीरम albumins सतह पर अवशोषित करने का इरादा है। Adsorbed albumins अन्य prote के बाद सोखना बाधितभारतीय नौसेना पोत और कोशिकाओं (चित्रा 1: चरण सी)।
3. इंतजार करते हुए, उल्टे प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी की स्थापना की।
   1. चाप दीपक पर बारी यूवी फिल्टर क्यूब डालें, और 20x करने के उद्देश्य लेंस निर्धारित किया है।
   2. प्रकाश की तीव्रता मैं (डब्ल्यू सेमी ^-2) का उपयोग कर एक यूवी तीव्रता मीटर उपाय है, और के रूप में (जम्मू सेमी ^-2 में) घ की एक खुराक के लिए (सेकंड में) विकिरण समय टी गणना: टी = डी / मैं।
      उदाहरण के लिए, 200 जम्मू सेमी की एक खुराक पर चमकाना ^-2 600 मेगावाट सेमी ^-2 के एक प्रकाश स्रोत का उपयोग कर, विकिरण के 333 सेकंड की आवश्यकता है।
   3. एक मंच सुक्ष्ममापी का उपयोग करें और इस क्षेत्र के आकार जैसे, 200 माइक्रोन, किरणित होने को तैयार करने के लिए क्षेत्र डायाफ्राम बंद करें।
4. (; अंतिम एकाग्रता 300 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर ^-1 कर्नल-चतुर्थ) 3 घंटा ऊष्मायन के बाद, 3.0 मिलीग्राम मिलीलीटर ^-1 प्रकार चतुर्थ कोलेजन के 200 μl के साथ मध्यम पूरक।
5. माइक्रोस्कोप चरण के लिए 35 मिमी पकवान स्थानांतरण। खरोंच मीटर खोजेंसन्दूक, नमूना की सतह पर माइक्रोस्कोप ध्यान देते हैं, और 200 से जम्मू जाने वाली ^-2 (चित्रा 1: चरण डी) की एक खुराक पर यूवी प्रकाश चमकाना। पराबैंगनी विकिरण के क्षेत्र क्षेत्र डायाफ्राम के उद्घाटन का समायोजन करके या मध्यस्थ ज्यामिति की एक धातु मुखौटा के साथ क्षेत्र डायाफ्राम की जगह से या तो बदला जा सकता है।
6. (कर्नल-चतुर्थ) के बिना एक ताजा मध्यम विकास के साथ मध्यम बदलें, और वापस इनक्यूबेटर में नमूना रखें।

4. सेल संस्कृति

1. PC12 कोशिकाओं की दिनचर्या संस्कृति एक कोलेजन लेपित प्लास्टिक पकवान पर किया जाता है।
   1. कोट कर्नल-चतुर्थ के साथ एक 60 मिमी ऊतक संस्कृति डिश के लिए, पहली DDH ₂ हे के साथ सतह गीला और सभी DDH ₂ ओ महाप्राण
   2. 300 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर की तैयारी ^-1 कर्नल-चतुर्थ DDH ₂ ओ (3 मिलीग्राम मिलीलीटर ^-1) 10x मूल समाधान गिराए
   3. 300 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर ^-1 60 मिमी पकवान प्रति कर्नल-चतुर्थ के 200 μl जोड़ें। सतह के माध्यम से फैल समाधान करते हैं।
   4. सूखी टीवह लगभग 1 घंटे के लिए एक लामिना का प्रवाह हुड में पकवान।
   5. Dulbecco फॉस्फेट बफर खारा (डी पीबीएस) के 4 मिलीलीटर के साथ दो बार सतह कुल्ला। तुरंत लेपित पकवान का उपयोग नहीं करते हैं, DDH ₂ ओ के 4 मिलीलीटर के साथ एक बार पकवान कुल्ला DDH ₂ हे aspirating के बाद इनक्यूबेटर में पकवान की दुकान। यह अधिक से अधिक दो सप्ताह के लिए भंडारित रखने के लिए नहीं की कोशिश करें।
2. PC12 कोशिकाओं के होते हैं कि एक मध्यम विकास में बड़े हो रहे हैं: Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (कम ग्लूकोज) + 10% भ्रूण गोजातीय सीरम + 5% घोड़े सीरम + 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान। सीओ ₂ इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को सेते (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ _2), और हर दूसरे दिन मध्यम के आधे की जगह। पारित होने कोशिकाओं वे संगम तक पहुँचने से पहले।
   1. महाप्राण मध्यम विकास, और जोड़ने के 2 मिलीलीटर पीबीएस ⁺ (डी पीबीएस + 10 मिलीग्राम मिलीलीटर ^-1 गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) + 10 मिमी EDTA) 37 डिग्री सेल्सियस तक prewarmed। 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेते हैं। धीरे सभी सीई अलग करने के लिए पकवान नलLLS।
   2. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में कोशिकाओं को ले लीजिए। 37 डिग्री सेल्सियस तक prewarmed ताजा डी पीबीएस के 3 मिलीग्राम, साथ पकवान कुल्ला।
   3. 4 मिनट के लिए 150 × छ पर ट्यूब अपकेंद्रित्र।
   4. सतह पर तैरनेवाला महाप्राण, और विकास के माध्यम से 1 मिलीलीटर जोड़ें।
   5. 3-1: दिनचर्या संस्कृति के लिए, कोशिकाओं 1 विभाजित 5।
3. , यूवी संशोधित ओटीएस / ₂ Tio नमूना पर थाली कोशिकाओं सेल घनत्व गिनती और एक 35 मिमी पकवान (चित्रा 1: चरण ई) में 3.0 × 10 ⁵ कोशिकाओं को जोड़ने के लिए। 1-2 दिनों के लिए humidified इनक्यूबेटर में पकवान (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ ₂₎ सेते हैं। दोनों अनुभवहीन और तंत्रिका वृद्धि कारक (NGF) -differentiated PC12 कोशिकाओं patterning के प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। NGF भेदभाव के लिए, 7S-NGF के 100 एनजी मिलीलीटर ^-1 नमूना पर चढ़ाना कोशिकाओं से पहले मध्यम विकास के कई दिनों के लिए कहा है। NGF-भेदभाव PC12 कोशिकाओं की adhesibility बढ़ाने के लिए लगता है और विशेष रूप से इन-सीटू patterning ई में, आसान हैंडलिंग बनाता हैxperiments।

5. में स्वस्थानी सतह patterning

1. पूर्व सीटू संशोधित सतह पर संस्कृति के 1-2 दिन बाद, कोशिकाओं संलग्न और यूवी विकिरणित क्षेत्र पर ही बढ़ रहे हैं, इसकी पुष्टि। 3.4 कदम में वर्णित है, माइक्रोस्कोप सेट करें।
2. मध्यम विकास युक्त एक नया 35 मिमी टिशू कल्चर पकवान के लिए नमूना हस्तांतरण, (NGF-विभेदित कोशिकाओं का उपयोग कर के मामले में) 100 एनजी मिलीलीटर ^-1 NGF, और 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर ^-1 कर्नल-चतुर्थ।
3. खुर्दबीन मंच पर पकवान रखें। उचित स्थिति का पता लगाएं, और 200 जे सेमी ^-2 (चित्रा 1: चरण एफ, जी) की एक खुराक पर पराबैंगनी प्रकाश चमकाना। नव निर्मित अनुमोदक क्षेत्र चित्रा 1 में एक तारांकित साथ संकेत दिया है: चरण जी
4. 30 मिनट के भीतर एक भी नमूने की प्रक्रिया को पूरा करने के लिए प्रयास करें। विकिरण के बाद कर्नल-चतुर्थ के बिना वापस माध्यम में नमूना हस्तांतरण।
5. घन के साथ पकवान उठाकर ले जाते समय बेहद सावधान रहेंltured कोशिकाओं और पकवान से नमूना स्थानांतरित नमूनों कोशिकाओं के detaching को रोकने के लिए पकवान।

समग्र प्रक्रिया के 1. योजनाबद्ध चित्रण चित्रा। जानकारी के लिए पाठ देखें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Representative Results

चित्रा 2A धूम-जमा ₂ Tio फिल्म के एक पार के अनुभागीय स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) छवि को दर्शाता है। अवलोकन से, फिल्म की मोटाई लगभग 150 समुद्री मील दूर होने का अनुमान लगाया गया था। यहां ध्यान देने योग्य जमा ₂ Tio फिल्म की उदासी है। परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) से आगे के विश्लेषण से सतह की जड़ मतलब वर्ग (आरएमएस) खुरदरापन 0.2 एनएम (चित्रा 2 बी) था कि पता चला।

₂ Tio सतह ओटीएस के साथ संशोधित और फिर एक सीरम युक्त मध्यम विकास में डूब जाता है, सीरम albumins ओटीएस सतह पर सोखना और बाद में प्रोटीन सोखना और कोशिका आसंजन ^18,20 रोकती हैं। ध्यान केंद्रित पराबैंगनी प्रकाश की सतह के लिए विकिरणित है जब इसके बाद, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) ₂ Tio पर ओटीएस आत्म इकट्ठे monolayer (एसएएम) विघटित और सैम और adsorbed के एक हटाने जो ₂ Tio सतह ²¹ में उत्पन्न कर रहे हैंसतह से lbumins। इस हाइड्रोफिलिक और प्रोटीन सोखना के अनुमोदक विकिरणित क्षेत्र प्रदान करता है। Albumins साथ आरओएस के प्रत्यक्ष बातचीत के एक साथ होने वाली हो सकती है, लेकिन ओटीएस सैम एल्बुमिन और ₂ Tio interfacing है के बाद से ओटीएस के अपघटन, मुख्य प्रतिक्रिया होना चाहिए। वर्तमान प्रोटोकॉल में, एक बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन कर्नल-चतुर्थ विकिरण के दौरान मध्यम में पूरक है, और कर्नल-चतुर्थ albumins हटा रहे हैं जहां यूवी विकिरणित क्षेत्र (चित्रा 3) को रियायत के adsorbs। ऐसे फ़ाइब्रोनेक्टिन के रूप में अन्य प्रोटीन इस दृष्टिकोण की बहुमुखी प्रतिभा का संकेत है, एक ही प्रोटोकॉल (चित्रा 3 बी) में नमूनों की जा सकती है।

यह भी पराबैंगनी विकिरण के समय में मध्यम में मौजूद हैं, जो सीरम albumins ने भी विकिरणित क्षेत्र पर सोखना चाहिए, लेकिन परिणाम राशि बरकरार ओटीएस सैम पर उस के रूप में उच्च नहीं है कि सुझाव। इस बात की पुष्टि करने के लिए, हम बीएसए की आत्मीयता में अंतर की जांच कीडाई लेबल बीएसए के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा यूवी किरणित और बरकरार ओटीएस सैम करने के लिए। इस प्रयोग के लिए, ध्यान केंद्रित यूवी प्रकाश सीरम युक्त मध्यम में डूबे नहीं किया गया है कि ओटीएस / ₂ Tio नमूना करने के लिए किरणित किया गया था, और उसके बाद नमूना लेबल fluorescein- का एक समाधान में डूब गया था बीएसए। चित्रा 3 सी की सोखना पैटर्न से पता चलता है बीएसए। यूवी विकिरणित क्षेत्र से भी बरकरार ओटीएस सैम क्षेत्र में उज्जवल प्रतिदीप्ति adsorbed बीएसए की राशि बरकरार क्षेत्र में अधिक है कि इंगित करता है। तरजीही सोखना के तंत्र दोनों क्षेत्रों के hydrophobicity में अंतर से समझा जा सकता है। बीएसए सोखना की राशि हाइड्रोफोबिक सतहों ²² पर अधिक हो जाता है, और बरकरार ओटीएस सैम क्षेत्र यूवी विकिरणित क्षेत्र ^{में 18} से अधिक हाइड्रोफोबिक है।

इस प्रकार बनाया कर्नल-चतुर्थ के पैटर्न कोशिका आसंजन के लिए एक पाड़ के रूप में कार्य करता है। चित्रा -4 ए एक पर सुसंस्कृत NGF विभेदित PC12 कोशिकाओं से पता चलता है एन एक्स सीटू एक दिन के लिए इस क्षेत्र के नमूनों। इसके बाद, पराबैंगनी प्रकाश एक micropattern की ओर करने के लिए किरणित किया गया था, और कोशिकाओं अतिरिक्त 5 दिनों के लिए सुसंस्कृत थे। चित्रा 4 बी-डी में दिखाया गया है, कोशिकाओं को आगे सतह की सेल आत्मीयता सफलतापूर्वक सेल संस्कृति वातावरण में संशोधित किया गया था यह दर्शाता है कि संशोधित क्षेत्र के लिए चले।

चित्रा ₂ Tio फिल्म की 2. विशेषता। (ए) नमूना के क्रॉस अनुभागीय SEM छवि। ₂ Tio सतह (बी) AFM छवि। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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यूवी विकिरणित क्षेत्र पर प्रोटीन की चित्रा 3. साइट चयनात्मक सोखना। (ए) Fluorescein लेबल कोलेजन (200 माइक्रोन अष्टकोणीय पैटर्न) और (बी) rhodamine- लेबल फ़ाइब्रोनेक्टिन (100 माइक्रोन वर्ग पैटर्न)। इन प्रोटीनों की तरजीही सोखना प्रोटीन सोखना (सी) कि ब्लॉक albumins की अनुपस्थिति पर निर्भर करता है। (सी) में ध्यान दें कि, ओटीएस सैम fluorescein लेबल बीएसए के आवेदन करने से पहले सीरम युक्त मध्यम में डूबे नहीं किया गया था। स्केल सलाखों, 100 माइक्रोन (ए) और 50 माइक्रोन (बी, सी)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4 एक्स-सीटू और PC12 कोशिकाओं के यथास्थान patterning। एक पूर्व सीटू नमूनों क्षेत्र पर PC12 कोशिकाओं (ए) आसंजन। बिंदीदार अष्टकोण में सीटू पराबैंगनी विकिरण की साइट इंगित करता है। (बी - डी) विकिरण के बाद 2 दिन (बी), 3 दिन (सी), और 5 दिन (डी) में इन-सीटू नमूनों क्षेत्र के लिए PC12 कोशिकाओं के प्रवासन,। स्केल बार, 200 माइक्रोन। यामामोटो एट अल। ¹⁸ से अनुमति के साथ संशोधित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

हमारे वर्तमान प्रोटोकॉल में, ₂ Tio फिल्म आरएफ मैग्नेट्रान sputtering द्वारा बनाई गई थी। यह हमें reproducibly एक उप-एनएम खुरदरापन के साथ एक photocatalytic ₂ Tio फिल्म तैयार करने के लिए अनुमति देता है के बाद से हम जमाव की इस विधि के पक्ष में। बयान धूम प्रक्रियाओं सामग्री वैज्ञानिकों और इलेक्ट्रॉनिक इंजीनियर्स के लिए परिचित हैं, यद्यपि यह जीव के लिए काफी सुलभ नहीं हो सकता। उस मामले में, स्पिन में लिपटे ₂ Tio फिल्म एक वैकल्पिक विकल्प ²³ होगा। इस विधि में, एक विलायक में भंग ₂ Tio नैनोकणों केन्द्रापसारक बल द्वारा एक सब्सट्रेट सतह पर फैला हुआ है। आवश्यक विशेष उपकरणों एक sputtering प्रणाली की तुलना में बहुत सस्ती है, जो एक स्पिन coater है। हम खुद के लिए एक स्पिन में लिपटे ₂ Tio nanoparticle फिल्म का इस्तेमाल किया है और इस फिल्म में भी इसी तरह के प्रयोगों से बाहर ले जाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि इस बात की पुष्टि की है (डेटा) नहीं दिखाया। स्पिन में लिपटे ₂ Tio फिल्म की सतह कई दस में से एक आरएमएस खुरदरापन के साथ तुलनात्मक रूप से किसी न किसी तरह हैएनएम की है, और यह reproducibly विशेष रूप से कई स्पिन कोटिंग्स मोटी फिल्मों प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं जब समान रूप से कोट करने के लिए सब्सट्रेट कुछ अभ्यास लेता है। फिर भी, विधि जीव के लिए पहले उम्मीदवार हो सकता है।

इस प्रकार अब तक, हम patterning न केवल PC12 कोशिकाओं लेकिन यह भी एक मानव अग्नाशय के कैंसर कोशिका लाइन ASPC-1 और भ्रूण चूहे hippocampi ¹⁹ से प्राप्त प्राथमिक न्यूरॉन्स में इस पद्धति का उपयोग किया है। ASPC-1 कोशिकाओं की Adhesibility PC12 कोशिकाओं या हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स, और मचान अणुओं, ऐसे कोलेजन के रूप में, उन्हें patterning में आवश्यकता नहीं थी की पूरकता की तुलना में ज्यादा मजबूत कर रहे हैं। हम अभी तक की वजह से ओटीएस सैम में दोष के है, जो शायद कभी-कभी मनाया गया unirradiated क्षेत्र, करने के लिए कोशिकाओं की है कि गैर विशिष्ट आसंजन ध्यान दें।

उनकी adhesibility कमजोर है क्योंकि patterning प्राथमिक न्यूरॉन्स बहुत अधिक चुनौतीपूर्ण थे। वास्तव में, मौजूदा प्रक्रिया के महत्वपूर्ण कदम उचित सोखना में निहित हैके अणुओं मचान। कोलेजन या laminin का एक सरल पूरकता न्यूरॉन्स के लिए संशोधित क्षेत्र की आत्मीयता बढ़ाने के लिए अपर्याप्त था। हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की परम्परागत संस्कृति कोट के लिए coverslip ²⁴ की सतह सकारात्मक आरोप लगाया पेप्टाइड पाली lysine पर निर्भर करता है। इस संदर्भ में, यूवी विकिरणित क्षेत्र के पाली lysine के उत्प्रेरण चयनात्मक लगाव वांछित है, लेकिन साथ ही बरकरार ओटीएस सैम क्षेत्र पर पाली lysine adsorbed के बाद से असंभव था। हम इनमें से कोई नहीं है कि विरोधी दूषण थे पाली lysine को खोजने के लिए, इस तरह के पॉलीथीन ग्लाइकोल-silane SAMs और perfluoro-silane SAMs के रूप में अन्य सतह कोटिंग्स, की कोशिश की। इस मुद्दे को हल करने के लिए, हम बहुत हाल ही में एक पार से जोड़ने के अणु यूवी विकिरणित क्षेत्र ¹⁹ पर मचान अणुओं के सक्रिय सोखना प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि पता चला है। मचान अणुओं और अपनी एकाग्रता के अनुकूलन के इस तरह के चयन एक प्रयोग के लिए बाहर किया जाना चाहिए।

पराबैंगनी विकिरण खुराकयह दृढ़ता से प्रोटीन सोखना की राशि को प्रभावित करता है, क्योंकि यह भी अनुकूलित किया जाना चाहिए। हमारे मामले में, प्रतिदीप्ति तीव्रता माप 200 जम्मू सेमी ^{-2 18} के एक इष्टतम यूवी खुराक प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। मूल्य ऐसे मोटाई और TiO ₂ फिल्म की स्फटिकता के रूप में प्रयोगात्मक मापदंडों के आधार पर भिन्न होने की संभावना है।

अब तक विकसित में सीटू सतह संशोधन की विभिन्न तकनीकों के अलावा, वर्तमान पद्धति का प्रमुख लाभ यह है कि सतह के प्रसंस्करण के लिए विशेष अणुओं के कार्बनिक संश्लेषण की आवश्यकता नहीं होती है। यहाँ प्रस्तुत विधि वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध पॉलिमर, पेप्टाइड्स, और सैम व्यापारियों के विशाल पुस्तकालय से तैयार जैविक फिल्मों के साथ संगत, सिद्धांत रूप में है। यह भी यहां दिखाया गया था के रूप में सतह संशोधन की प्रक्रिया, इस तरह के एक पारा चाप दीपक के साथ सुसज्जित एक विस्तृत क्षेत्र प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के रूप में, पारंपरिक प्रयोगशाला के उपकरण का उपयोग किया जा सकता है कि एक अर्थ में अनुकूल है। का प्रयोगप्रकाश स्रोत के रूप में एक यूवी लेजर, ~ 3 माइक्रोन से नीचे subcellular संकल्प प्राप्त किया जा सकता है (डेटा) नहीं दिखाया।

वर्तमान पद्धति की कुछ सीमाओं में आरओएस के, मध्यम में मचान अणुओं का सप्लीमेंट के लिए जरूरत सतह संशोधन के irreversibility, और पीढ़ी शामिल हैं। यहाँ वर्णित प्रक्रिया सतह के अनुमोदक रूपांतरण करने के लिए गैर-अनुमोदक के लिए लागू है, लेकिन रूपांतरण एक तरीका है और वापस नहीं लिया जा सकता है। सेल आत्मीयता के उलट रूपांतरण की आवश्यकता है कि प्रयोगों के लिए, अन्य तरीकों ¹⁵ विचार किया जाना चाहिए। इसके अलावा, हमारी प्रक्रिया सेल संस्कृति के माध्यम से स्नान लागू किया जा करने के लिए इस तरह के कोलेजन के रूप में मचान अणुओं की आवश्यकता है। पूर्व नमूनों कोशिकाओं की आबादी अनिवार्य रूप से अणुओं को उजागर किया जाएगा के बाद से, यह इस प्रक्रिया के कुछ आवेदन सीमित कर सकता है। यूवी विकिरणित क्षेत्र में इस तरह हाइड्रॉक्सिल कण के रूप में आरओएस के Photocatalyzed पीढ़ी, आस-पास की कोशिकाओं को विषाक्त हो सकता है, लेकिन कम से कम इस आशय नहीं थाहमारे प्रयोगों में मनाया। यह अन्य अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण हो जाता है, भले ही इस समस्या मध्यम विकास में ऑक्सीजन मैला ढोने वालों का सप्लीमेंट द्वारा हल किया जाना चाहिए। अणुओं सफाई ऑक्सीजन ₂ Tio और इसकी सतह पर गैर अनुमोदक अणुओं के बीच स्थित होना नहीं होता है, वे patterning प्रक्रिया कैनेटीक्स को प्रभावित किए बिना अत्यधिक आरओएस को खत्म करने की उम्मीद कर रहे हैं।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass coverslip	Warner Instruments	CS-15R15	15 mm diameter, #1.5 thickness
Diamond scriber	Ogura Jewel Industry	D-Point Pen
RF sputtering system	ANELVA	SPC350
TiO2 sputtering target	Kojundo Chemical Lab	Titanium (IV) oxide, target	Purity, 99.9%
Plasma reactor	Yamato	PR301
n-octadecyltrichlorosilane (OTS)	Aldrich	104817
Toluene	Wako	204-01866
Tissue-culture dish (35 mm)	Greiner	627160
Tissue-culture dish (60 mm)	BD Falcon	353002
Type-IV collagen	Nitta Gelatin	Cellmatrix Type IV
D-PBS	Gibco	14190-144
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)	Gibco	11885-084
Fetal bovine serum	Gibco	12483-020	Heat-inactivate and pass through a 0.22 μm filter before use
Horse serum	Gibco	26050-088	Pass through a 0.22 μm filter before use
Penicillin-streptomycin (100x)	Nacalai tesque	26253-84
7S nerve growth factor (NGF)	Alomone Labs	N-130
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A2153
EDTA	Dojindo	N001	Stock solution in 0.5 M
TiO2 nanoparticle	Tayca	TKD-701