Abstract
Les contaminants organiques adsorbés à la surface du dioxyde de titane (TiO 2) peuvent être décomposés par photocatalyse sous rayonnement ultraviolet (UV). Nous décrivons ici un nouveau protocole employant la photocatalyse du TiO 2 à modifier localement affinité des cellules de la surface du substrat. Pour cette expérience, un film mince de TiO 2 est revêtu par pulvérisation sur une lamelle de verre, et la surface de TiO 2 a ensuite été modifié par une monocouche organosilane dérivé de l'octadécyltrichlorosilane (OTS), qui inhibe l'adhérence cellulaire. L'échantillon a été immergé dans un milieu de culture cellulaire, et concentre la lumière UV a été irradié à une région de forme octogonale. Quand un neuronales cellules PC12 lignée de cellules ont été étalées sur l'échantillon, les cellules adhèrent seulement sur la zone irradiée aux UV. On montre en outre que cette modification de surface peut également être réalisée in situ, autrement dit, même lorsque les cellules sont en croissance sur le substrat. Modification appropriée de la surface nécessaire une matrice extracellulaire protein collagène d'être présent dans le milieu au moment de l'irradiation UV. La technique présentée ici peut éventuellement être utilisé dans plusieurs types de cellules pour la construction de structuration des systèmes de co-culture ou de manipuler arbitrairement cellules dans la culture.
Introduction
Semiconductor processus de lithographie et de ses dérivés tels que la photolithographie - 1,2, la lithographie par faisceau d'électrons 3-6 et microcontact impression 7-10 - sont devenus un outil créé en biologie cellulaire pour cultiver des cellules vivantes dans une position définie et la géométrie. Procédé de formation de motifs repose sur l'utilisation de substrats micro-usinés, comprenant des micro-île de revêtement permissive de cellules dans un arrière-plan non permissive. Un tel substrat sert de matrice à motif cellules. Ces technologies nous ont fourni les nouvelles méthodes pour modifier des cellules et leur fonction à un niveau mono et multi-cellulaire, pour extraire les propriétés intrinsèques des cellules, et d'augmenter le débit de base de cellules criblage de médicaments 11.
Le degré de liberté dans un patron de cellules augmenterait considérablement si la géométrie du motif de modèle pourrait être modifié in situ, à savoir, tandis que les cellules sont cultivées sur des sta tête. Les procédés classiques de formation de motif ne peut pas être directement appliquées ici, étant donné qu'ils traitent les échantillons dans une atmosphère ou sous vide. Par conséquent diverses nouvelles techniques de modification de surface ont été proposées, qui sont basées, par exemple, sur des composés photo-réactifs 12,13 ou ablation laser 5,14, juste pour en nommer quelques-uns. Les méthodes proposées ont été bien examiné par Robertus et al. 15, et plus récemment par Choi et al. 16 et 17 par Nakanishi.
Ici, dans cet article, nous décrivons un nouveau protocole de modification in situ surface, qui tire parti de la dégradation photocatalytique de molécules organiques sur un dioxyde de titane (TiO 2) de surface 18,19. Dans ce procédé, un film de TiO 2 est insérée entre le substrat de verre et le film organique qui assure l'interface des cellules, et le film organique est décomposé in situ en irradiant localement ultraviolet (UV)la lumière pour une région d'intérêt (λ <388 nm). Nous montrons que le nouveau protocole peut être utilisé pour créer micropatterns de protéines de la matrice extracellulaire et des cellules vivantes ex situ et in situ. TiO 2 est biocompatible, chimiquement stable, et optiquement transparents, caractéristiques de ce qui le rend sympathique à introduire dans des expériences de culture cellulaire. Ce protocole fournit une alternative de matériaux à base scientifique pour modifier les échafaudages de culture cellulaire en milieu de culture cellulaire.
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Protocol
1. Préparation de TiO 2 revêtues de verre Coverslip
- Nombre les lamelles à l'aide d'une pointe à tracer de diamant. Cela permet non seulement de garder une trace de chaque lamelles, mais aussi pour veiller à ce que le bon côté de l'échantillon est orientée vers le haut. Nettoyer les lamelles couvre-objet, d'abord sous exécutant ddH 2 O, puis en les immergeant dans une solution de piranha (H 2 SO 4: H 2 O 2 = 4: 1). Après 10 minutes, rincez soigneusement les lamelles, 8 fois en ddH 2 O. Sécher les lamelles sous N2 flux.
- Ensemble de TiO 2 dans la cible de radiofréquence (RF) de système de pulvérisation. Fixez les lamelles sur un support de l'équipement de pulvérisation à l'aide d'un ruban de polyimide de l'échantillon. Placez le porte-échantillon dans la chambre de pulvérisation. Évacuer la chambre jusqu'à ce que la pression atteint 2,0 × 10 -4 Pa.
- Introduire du gaz Ar dans la chambre et régler la pression de dépôt à 4,0 mTorr. Tout en gardant l'obturateur fermé, augmenter progressivementla puissance RF à 70 W.
- Ouvrir le volet et par pulvérisation cathodique pendant 15 min pour obtenir un film d'une épaisseur de 120 à 150 nm (Figure 1: Etape A). Taux de croissance du film doit être dérivé pour chaque machine.
2. Revêtement de surface avec Cell-répulsif Film
- Rendre hydrophile la surface de TiO 2 par traitement de l'échantillon avec du plasma O 2, en suivant les instructions fournies par le fabricant du réacteur à plasma. Nous traitons l'échantillon pendant 5 min à 200 W avec O 2 débit de 100 sccm. Immerger l'échantillon dans le trou DDH 2 O et de confirmer que la surface est superhydrophile. Séchez soigneusement la surface sous le N 2 flux.
- Préparez 1 mM octadécyltrichlorosilane (OTS) solution par addition de 39,6 OTS pi à 100 ml de toluène. Immerger l'échantillon dans la solution pendant 1 heure à température ambiante. Effectuer cette étape l'intérieur d'un sac à gants 2 -filled N (Figure 1: Étape B).
- Pour éliminer les molécules physisorbées, sonicate l'échantillon dans le toluène, l'acétone, l'éthanol, et ddH 2 O pendant 5 minutes chacune, dans cet ordre. Rincer l'échantillon quatre fois en frais ddH 2 O et sécher la surface sous le N 2 flux. La surface doit être hydrophobe avec un angle de 100-110 ° de contact.
3. Ex-Situ structuration de surface
- Travailler dans une hotte à flux laminaire, tirer plusieurs traces de rayures avec un abonné de diamant sur la surface. Les marques aident à garder la trace des régions traitées et également mettre au point des microscopes. Stériliser le TiO 2 revêtu OTS en plongeant l'échantillon dans de l'éthanol 70% pendant 5 min. Puis rincer l'échantillon deux fois dans stérilisée ddH 2 O.
- Placer l'échantillon dans un plat de 35 mm, et ajouter 2 ml de milieu de croissance de PC12 (voir l'étape 4.2). Incuber pendant plus de 3 heures dans un incubateur à CO 2 (37 ° C). Cette procédure est destinée à laisser sérumalbumines absorbent sur la surface. Albumines adsorbées inhibent l'adsorption ultérieure d'autres proteins et des cellules (Figure 1: l'étape c).
- En attendant, mettre en place le microscope inversé à fluorescence.
- Allumez la lampe à arc, insérez le cube de filtre UV, et définir l'objectif de 20X.
- Mesurer l'intensité lumineuse I (W cm -2) au moyen d'un compteur d'intensité UV, et de calculer la durée d'irradiation t (en secondes) pour une dose de d (en cm -2 J) en tant que: t = d / I.
Par exemple, pour irradier à une dose de 200 J cm -2 utilisant une source lumineuse de 600 mW cm -2, 333 secondes d'irradiation est nécessaire. - Utilisez un micromètre et fermer le diaphragme de champ pour définir la taille de la région à irradier, par exemple, 200 um.
- Après l'incubation de trois heures, de compléter le milieu avec 200 ul de 3,0 mg ml-1 de type IV collagène (Col-IV; concentration finale de 300 ug ml-1).
- Transférer le plat de 35 mm de la platine du microscope. Trouver le scratch marche, focaliser le microscope sur la surface de l'échantillon, et irradier la lumière UV à une dose de 200 J cm -2 (Figure 1: Etape D). La zone d'irradiation UV peut être modifiée, soit en ajustant l'ouverture du diaphragme de champ ou par le remplacement du diaphragme de champ avec un masque métallique de géométrie d'arbitrage.
- Remplacez le milieu avec un milieu de croissance frais (sans Col-IV), et placer l'échantillon dans l'incubateur.
4. Culture Cellulaire
- Culture de routine de cellules PC12 est effectuée sur une boîte en matière plastique revêtue de collagène.
- Pour revêtir un plat de culture de tissu de 60 mm avec Col-IV, mouiller d'abord la surface avec le trou DDH 2 O et aspirer tous ddH 2 O.
- Préparer 300 ng ml -1 Col-IV en diluant la solution initiale (3 mg ml -1) 10x avec ddH 2 O.
- Ajouter 200 pi de 300 pg ml -1 Col-IV par 60 mm plat. Laissez la solution se propager à travers la surface.
- À sec til plat dans une hotte à flux laminaire pendant environ 1 heure.
- Rincer la surface deux fois avec 4 ml de tampon phosphate salin de Dulbecco la (D-PBS). Lorsqu'ils ne sont pas immédiatement d'utiliser le plat enduit, rincez le plat une fois avec 4 ml de ddH 2 O. Après aspiration ddH 2 O, stocker le plat dans l'incubateur. Essayez de ne pas le garder stocké pendant plus de deux semaines.
- Les cellules PC12 sont cultivées dans un milieu de croissance qui se compose de: moyen (faible taux de glucose) de Eagle modifié par Dulbecco + sérum solution à 1% de pénicilline-streptomycine + 10% de sérum de veau foetal 5% + cheval. Incuber les cellules dans un incubateur à CO 2 (37 ° C, 5% CO 2), et remplacer la moitié du milieu tous les deux jours. Passage cellules avant qu'elles atteignent la confluence.
- Aspirer le milieu de croissance, et ajouter 2 ml de PBS + (D-PBS + 10 mg ml -1 d'albumine de sérum bovin (BSA) + 10 mM d'EDTA) préchauffé à 37 ° C. Incuber pendant 5 min à 37 ° C. Tapoter doucement le plat de détacher tous les CELLS.
- Recueillir les cellules dans un tube conique de 15 ml. Rincer le plat avec 3 ml de frais D-PBS, préchauffée à 37 ° C.
- Centrifuger le tube à 150 g pendant 4 min.
- Aspirer le surnageant et ajouter 1 ml de milieu de croissance.
- Pour la culture de routine, diviser les cellules 1: 3 à 1: 5.
- Pour étaler les cellules sur l'échantillon modifié-UV OTS / TiO 2, comptez densité cellulaire et ajouter 3,0 × 10 5 cellules dans une boîte de 35 mm (Figure 1: Étape E). Incuber le plat au incubateur humidifié (37 ° C, 5% CO 2) pendant 1-2 jours. Les deux facteurs de croissance et naïf nerf (NGF) cellules PC12 -differentiated peuvent être utilisées pour les expériences de mise en forme. Pour la différenciation NGF, 100 ng ml -1 de 7S-NGF est ajouté à la croissance moyenne plusieurs jours avant l'étalement des cellules sur l'échantillon. NGF-différenciation semble augmenter le adhesibility des cellules PC12 et facilite la manipulation, en particulier dans le modelage in situ eXperiments.
5. In-Situ structuration de surface
- Après 1-2 jours de culture sur la surface modifiée ex-situ, confirment que les cellules attachent croissant et seulement sur la région irradiée aux UV. Mettre en place le microscope, comme décrit dans l'étape 3.4.
- Transférer l'échantillon dans une nouvelle boîte de culture tissulaire de 35 mm contenant du milieu de croissance, 100 ng ml-1 NGF (dans le cas de l'utilisation de cellules différenciées NGF), et 100 ug ml-1 Col-IV.
- Placez le plat sur la platine du microscope. Trouver la position appropriée, et irradier la lumière UV à une dose de 200 J cm -2 (Figure 1: Etape F, G). La région permissive nouvellement créé est indiqué par un astérisque dans la figure 1: Etape G.
- Essayer de terminer le traitement d'un seul échantillon dans les 30 min. Après irradiation, transférer l'échantillon de nouveau dans le milieu sans Col-IV.
- Soyez extrêmement prudent lors de la réalisation du plat avec cultured cellules et le transfert de l'échantillon de plat à plat pour éviter le détachement des cellules motifs.
Figure 1. Représentation schématique de l'ensemble du processus. Voir le texte pour plus de détails. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Representative Results
La figure 2A montre une image au microscope électronique à balayage en coupe transversale (SEM) de la pellicule de TiO 2 déposée par pulvérisation cathodique. De l'observation, l'épaisseur du film a été estimée à environ 150 nm. Notable ici est la planéité de la couche de TiO 2 déposée. Une analyse plus poussée par microscopie à force atomique (AFM) a révélé que la rugosité racine carrée moyenne (RMS) de la surface était de 0,2 nm (figure 2B).
Lorsque la surface de TiO 2 est modifié avec OTS et ensuite immergée dans un milieu de croissance contenant du sérum, les albumines sériques sont adsorbés sur la surface OTS et inhibent l'adsorption subséquente de la protéine et l'adhérence cellulaire 18,20. Par la suite, lorsque la lumière UV concentré est irradiée à la surface, les espèces réactives de l'oxygène (ROS) sont produites à la surface de TiO 2 21, qui se décomposent l'OTS auto-assemblé monocouche (SAM) de TiO 2 et retirez le SAM et le adsorbé unlbumins de la surface. Cela rend la région irradiée hydrophile et permissive à l'adsorption des protéines. L'interaction directe du ROS avec albumines pourrait se produire simultanément, mais la décomposition de l'OTS devrait être la réaction principale, depuis OTS SAM est en interface albumine et TiO 2. Dans le protocole courant, une protéine de la matrice extracellulaire Col-IV est complétée dans le milieu pendant l'irradiation, et Col-IV adsorbe préférentiellement à la région irradiée aux UV où les albumines sont enlevés (figure 3A). D'autres protéines telles que la fibronectine peuvent être modelés dans le même protocole (figure 3B), indiquant la polyvalence de cette approche.
Les albumines de sérum, qui sont également présents dans le milieu au moment de l'irradiation UV, devraient également adsorber sur la région irradiée, mais les résultats suggèrent que le montant ne soit pas aussi élevé que le SAM OTS intact. Pour confirmer cela, nous avons étudié la différence dans l'affinité de BSAà irradier aux UV et OTS SAM intactes par microscopie de fluorescence du colorant BSA marquée. Pour cette expérience, la lumière UV concentré a été irradié à l'OTS / TiO 2 échantillon qui n'a pas été immergée dans le milieu contenant du sérum, puis l'échantillon a été immergé dans une solution de fluorescéine marqué BSA. La figure 3C montre le schéma d'adsorption de BSA. Plus lumineux fluorescence dans la région OTS SAM intact à la surface irradiée aux UV indique que la quantité de BSA adsorbée est plus élevée dans la région intacte. Le mécanisme d'adsorption préférentielle peut être comprise par la différence de caractère hydrophobe de ces deux régions. La quantité de BSA adsorption est connue pour être plus élevée sur des surfaces hydrophobes 22, et la région intacte OTS SAM est plus hydrophobe que la région irradiée aux UV 18.
Le motif de Col-IV ainsi créé sert d'échafaudage pour l'adhésion cellulaire. La figure 4A montre les cellules PC12 différenciées en culture NGF sur une n ex-situ région motif pendant 1 jour. Ensuite, la lumière UV est irradiée à l'autre d'un motif fin, et les cellules ont été cultivées pendant 5 jours supplémentaires. Comme représenté sur la figure 4B-D, les cellules ont migré plus loin de la région modifiée, ce qui indique que l'affinité de la surface de la cellule a été modifié avec succès dans un environnement de culture cellulaire.
Figure 2. Caractérisation de la couche de TiO 2. (A) de l'image transversale SEM de l'échantillon. L'image (B) de l'AFM de la surface de TiO 2. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 3. Site sélectif adsorption des protéines sur la région irradiée-UV. (A) collagène marqué à la fluorescéine (200 um modèle octogonale) et (B) marqué à la rhodamine fibronectine (100 um de motif carré). Adsorption préférentielle de ces protéines repose sur l'absence d'albumines qui bloquent l'adsorption des protéines (C). Notez que dans (C), OTS SAM n'a pas été immergée dans milieu contenant du sérum avant l'application de la BSA marquée à la fluorescéine. Les barres d'échelle, 100 um (A) et 50 um (B, C). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. ex-situ et in situ un motif de cellules PC12. (A) Adhérence des cellules PC12 sur une région à motif ex-situ. Octogone en pointillés indique le site de l'irradiation in situ UV. (B - D) Migration des cellules PC12 de la région à motif in situ, à partir de 2 jours (B), 3 jours (C), et 5 jours (d) après l'irradiation. La barre d'échelle, 200 um. Modifié avec la permission de Yamamoto et al. 18. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Dans notre protocole actuel, TiO 2 film a été formé par RF-pulvérisation magnétron. Nous privilégions cette méthode de dépôt, car il nous permet de préparer de façon reproductible un film photocatalytique de TiO 2 avec une rugosité sous-nm. Bien que les processus de dépôt par pulvérisation sont familiers aux spécialistes des matériaux et des ingénieurs en électronique, il peut ne pas être tout à fait accessible aux biologistes. Dans ce cas, TiO 2 film spin-enduit serait un choix alternatif 23. Dans ce procédé, des nanoparticules de TiO 2 dissous dans un solvant est étalé sur une surface du substrat par la force centrifuge. Équipement spécial requis est une tournette, qui est beaucoup plus abordable que d'un système de pulvérisation. Nous avons utilisé pour nous-mêmes un TiO 2 film de nanoparticules de spin-couché et avons confirmé que le film peut également être utilisé pour réaliser des expériences similaires (données non présentées). La surface du TiO 2 film spin-enduit est relativement rugueuse avec une rugosité RMS de plusieurs dizainess de nm, et il faut une certaine pratique pour enrober uniformément le substrat reproductible en particulier lorsque plusieurs revêtements de spin sont nécessaires pour obtenir des films d'épaisseur. Néanmoins, la méthode pourrait être le premier candidat pour les biologistes.
Jusqu'à présent, nous avons utilisé ce procédé dans un motif non seulement les cellules PC12 du pancréas mais aussi une lignée de cellules de cancer humain AsPC-1 et les neurones primaires obtenues à partir d'hippocampes de rats embryonnaires 19. Adhesibility de AsPC-1 cellules sont beaucoup plus forte que celle des cellules PC12 ou neurones de l'hippocampe, et la supplémentation de molécules d'échafaudage, tels que le collagène, n'a pas été nécessaire de les structurer. Nous notons encore que l'adhérence non spécifique des cellules à la région non irradié a été observé à l'occasion, ce qui est probablement dû à des défauts de l'OTS SAM.
Neurones primaires structuration étaient beaucoup plus difficile depuis leur adhesibility est faible. En fait, l'étape critique du procédé actuel réside dans l'adsorption appropriéd'échafaudage de molécules. Un simple supplémentation de collagène ou de la laminine était insuffisante pour augmenter l'affinité de la région modifiée pour les neurones. Culture conventionnelle de neurones de l'hippocampe repose sur chargé positivement peptide poly-lysine à revêtir la surface de la lamelle 24. Dans ce contexte, l'induction sélective de la fixation de poly-lysine à la zone irradiée aux UV est souhaitée, mais est impossible puisque poly-lysine adsorbée sur la région intacte ainsi OTS SAM. Nous avons essayé d'autres revêtements de surface, tels que le polyethylene glycol-silane et le perfluoro-SAM SAM silane, de trouver qu'aucun d'entre eux étaient antisalissure à la poly-lysine. Pour résoudre ce problème, nous avons très récemment montré qu'une molécule réticulation pourrait être utilisé pour induire l'adsorption active des molécules d'échafaudage sur la région irradiée-UV 19. Une telle sélection de molécules d'échafaudage et l'optimisation de sa concentration doit être effectuée pour chaque expérience.
Dose d'irradiation UVdoit également être optimisée car elle affecte fortement la quantité de protéine adsorption. Dans notre cas, la mesure de l'intensité de fluorescence a été utilisée pour calculer une dose d'UV optimale de 200 J cm -2 18. La valeur est susceptible de varier en fonction des paramètres expérimentaux tels que l'épaisseur et la cristallinité du film de TiO 2.
Parmi les diverses techniques de modification de surface in situ développées jusqu'ici, l'avantage majeur de la présente méthode est qu'elle ne nécessite pas la synthèse de molécules organiques spécialisés pour le traitement de surface. La méthode présentée ici est, en principe, compatible avec les films organiques préparés à partir de la grande bibliothèque de polymères disponibles dans le commerce, des peptides, et des précurseurs de SAM. Il est également favorable en ce sens que le processus de modification de surface peut être effectué en utilisant un équipement de laboratoire classique, par exemple un microscope à fluorescence à grand champ équipé d'une lampe à arc de mercure, comme cela a été illustré ici. Utilisationun laser UV comme source de lumière, la résolution subcellulaire jusqu'à 3 ~ um peut être obtenu (données non présentées).
Certaines limites de la méthode actuelle incluent l'irréversibilité de la modification de surface, nécessité de compléter les molécules d'échafaudage dans le milieu, et la génération de ROS. Le processus décrit ici est applicable aux non-permissive à la conversion permissive de la surface, mais la conversion est à sens unique et ne peut être annulée. Pour les expériences qui nécessitent une conversion de l'inversion de l'affinité des cellules, d'autres méthodes 15 doivent être considérés. De plus, notre procédé nécessite des molécules d'échafaudage, tels que le collagène à bain-appliquée au milieu de culture cellulaire. Puisque la population de cellules pré-modelé serait inévitablement exposé à des molécules, ce qui peut limiter une application de ce processus. Photocatalyzed génération de ROS, tels que les radicaux hydroxyles, à la région irradiée-UV peut être toxique pour les cellules voisines, mais, au moins, cet effet n'a pas étéobservé dans nos expériences. Même si cela devient important pour d'autres applications, ce problème doit être résolu en le complétant absorbeurs d'oxygène dans un milieu de croissance. Etant donné que la récupération des molécules d'oxygène ne serait pas situé entre le TiO 2 et les molécules non permissives sur sa surface, ils devraient éliminer excessive des ROS sans affecter la cinétique du procédé de formation de motif.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass coverslip | Warner Instruments | CS-15R15 | 15 mm diameter, #1.5 thickness |
| Diamond scriber | Ogura Jewel Industry | D-Point Pen | |
| RF sputtering system | ANELVA | SPC350 | |
| TiO2 sputtering target | Kojundo Chemical Lab | Titanium (IV) oxide, target | Purity, 99.9% |
| Plasma reactor | Yamato | PR301 | |
| n-octadecyltrichlorosilane (OTS) | Aldrich | 104817 | |
| Toluene | Wako | 204-01866 | |
| Tissue-culture dish (35 mm) | Greiner | 627160 | |
| Tissue-culture dish (60 mm) | BD Falcon | 353002 | |
| Type-IV collagen | Nitta Gelatin | Cellmatrix Type IV | |
| D-PBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | Heat-inactivate and pass through a 0.22 μm filter before use |
| Horse serum | Gibco | 26050-088 | Pass through a 0.22 μm filter before use |
| Penicillin-streptomycin (100x) | Nacalai tesque | 26253-84 | |
| 7S nerve growth factor (NGF) | Alomone Labs | N-130 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| EDTA | Dojindo | N001 | Stock solution in 0.5 M |
| TiO2 nanoparticle | Tayca | TKD-701 |
References
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