Summary
Weefselmanipulatie omvat vaak in vitro expansie om autologe voor weefselregeneratie creëren. Deze studie geeft een werkwijze voor weefselexpansie, regeneratie, reconstructie en in vivo werd ontwikkeld om de verwerking van cellen en biologische materialen buiten het lichaam te minimaliseren.
Introduction
Meest tissue engineering studies op transplantatie in de huid en het urogenitale kanaal omvatten autologe cel oogsten van gezond weefsel en celexpansie in speciaal uitgeruste-cel kweken faciliteiten 1,2.
Na celexpansie, worden cellen gewoonlijk opgeslagen voor later gebruik bij de patiënt bereid de autograft ontvangen. Stikstof diepvriezers mogelijk langdurige opslag bij lage temperaturen van -150 ° C of lager. Het proces van invriezen moet voorzichtig en gecontroleerd zodat de cellen niet te verliezen. Een kans op celdood kristallisatie van intracellulair water tijdens het ontdooien, wat kan leiden tot breuk van de celmembranen. Cel bevriezen wordt meestal uitgevoerd door langzame en gecontroleerde afkoeling (-1 ° C per minuut), onder toepassing van een hoge concentratie van cellen, foetaal runderserum en dimethylsulfoxide. Na het ontdooien, moet de cellen opnieuw worden verwerkt door het verwijderen van bevriezing medium en kweken op celkweek of een plasticbiomateriaal voordat transplantatie terug naar de patiënt.
Alle bovengenoemde stappen zijn tijdrovend, arbeidsintensief en kostbaar 3. Bovendien zijn alle in vitro verwerking van cellen die bestemd zijn voor de patiënt transplantatie zijn sterk gereguleerd en vereist goed opgeleide en geaccrediteerde personen en laboratoria 4. Al met al, om een veilige en betrouwbare productieproces te schaffen, de techniek kan alleen in een zeer klein aantal van de technisch geavanceerde centra worden opgezet en een breder gebruik in voorkomende chirurgische aandoeningen is twijfelachtig.
Om de beperkingen van celcultuur in de laboratoriumomgeving te overwinnen, is het concept van het transplanteren gehakt weefsel voor celexpansie in vivo geïntroduceerd door het lichaam zelf als bioreactor. Daartoe zou autografts voorkeur worden getransplanteerd op een 3D matrijs volgens de vorm die nodig is voor de uiteindelijke reconstructie van het orgaan van iBELANG 5-7.
Oorspronkelijk was het idee van het transplanteren van gehakt epitheel werd gepresenteerd door Meek in 1958, toen hij beschreef hoe epitheel groeit van de randen van een wond. Hij aangetoond dat een klein stukje huid de marges zijn potentieel voor celexpansie zouden verhogen en daardoor met 100% door het snijden van het stuk tweemaal loodrechte richtingen (figuur 1) 8. De theorie wordt ondersteund door het gebruik van mazen gedeeltelijke dikte huidtransplantaties voor huidtransplantatie 9 en in de huid wondgenezing modellen 10.
Figuur 1:. Meek theorie Volgens de theorie Meek, groeit epitheel van de randen van een wond. Door het verhogen van het gebied blootgelegd door het hakken techniek, gehakt weefsel epithelializes wonden van vele plekken.
De huidige studie is gebaseerd op de hypostelling dat hetzelfde principe in het onderhuidse weefsel door het plaatsen gehakt epithelium om een mal kan worden toegepast. De epitheelcellen zou mobiliseren van gehakt transplantaties (reorganiseren), omvatten de wondgebieden (migratie) en delen (vergroten) om een continue neoepithelium die het wondgebied bedekt en scheidt het vreemde lichaam (de matrijs) vanaf het binnenlichaam vormen ( figuur 2).
Figuur 2:. Cartoon van een 3D vorm met gehakt epitheel in vivo intracorporale weefseluitbreiding volgens de theorie van Meek Via gehakt weefsel geplaatst op een mal en vervolgens getransplanteerd in het onderhuidse weefsel is de hypothese dat de epitheelcellen migreren van de randen van gehakt weefsel reorganiseren en te voeren zodat een continue neoepithelium die het wondgebied bedekt en scheidt het vreemde lichaam (de matrijs) vanaf het binnenlichaam vormen.
Hoewel eerdere in vivo studies tonen veelbelovende resultaten, kan verdere verbeteringen worden bereikt door het versterken van de autografts zodat de geregenereerde epitheel mechanisch trauma kon weerstaan beter 7. Voor deze doeleinden zijn belangrijke voorwaarden voor een succesvolle biomateriaal geïdentificeerd, zoals: gemakkelijke diffusie van voedingsstoffen en afvalproducten, mogelijkheid om schimmel in een 3D-wijze en gemak van chirurgische behandeling. Conclusies werden gemaakt dat deze behoeften kan worden voldaan door het toevoegen van een composiet biomateriaal aan gehakt weefsel.
Het huidige onderzoek gericht op de ontwikkeling van een steiger bestaande uit gehakt weefsel in plastic-gecomprimeerde collageen bevattende een versterkende kern van een biologisch afbreekbare stof. Op deze manier kon levensvatbare cellen migreren van het gehakt weefsel deeltjes en vermenigvuldigen met morfologische kenmerken kenmerk van de oorspronkelijke epitheel (huid of urotheel). Met behulp van plastic compressie, het schavot was verminderend in grootte van 1 cm tot ongeveer 420 urn als het gehakte deeltjes ingekapseld in de bovenlaag collageen. De kern kan elk polymeer materiaal zijn, maar moet worden gemodificeerd met een hydrofiel oppervlak om elkaar te verbinden met de betreffende collageenlagen 11.
De werkwijze verschaft een verbeterd scaffold integriteit doordat een gebreid gaas bestaande uit poly (ε-caprolacton) (PCL) binnen twee plastic gecomprimeerd collageen gels gebruikt als een steiger voor het kweken gehakt blaasmucosa of gehakt huid van varkens. Het construct werd in celkweek omstandigheden gedurende tot 6 weken in vitro, demonstreren succesvolle vorming van een gelaagde, meerlaagse urotheel of squameus epitheel huid op de bovenkant van een goed geconsolideerd hybride construct. Het construct was gemakkelijk te hanteren en kan plaats gehecht voor blaas augmentatie doeleinden of deksel van defecten. Alle delen van het weefsel scaffold zijn FDA goedgekeurd en de techniekkunnen worden gebruikt voor eentraps procedures weefsel oogsten, hakken, plastic compressie en transplanteren naar de patiënt als eenmalig gefaseerde interventie. De procedure kan worden uitgevoerd voor weefselexpansie en wederopbouw onder steriele omstandigheden in een algemene chirurgie unit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dieren protocollen werden vooraf goedgekeurd door de County Comite Stockholm on Animals en alle procedures voldeden aan de regels voor diergeneeskundig gebruik, alsmede relevante federale statuten.
1. Dierlijke Procedures
- De voorbereiding van de Animal voor Heelkunde
- Bereid de operatietafel alle materialen en instrumenten die voor de werking onder steriele omstandigheden. Voer de operatie uitsluitend onder steriele omstandigheden het risico op infectie te verminderen en optimaliseren van de omstandigheden in overleving chirurgie.
- Vasten de dieren gedurende 12 uur vóór de operatie en meet het gewicht. Dien een intramusculaire injectie van azaperon (2 mg / kg) voor premedicatie. Verdoven het dier met intramusculaire injecties van tiletamine hypochloride (2,5 mg / kg), zolazepam hypochloride (2,5 mg / kg), medetomidine (25 ug / kg) en atropine (25 ug / kg).
- Injecteer phenobarbiturate (15 mg / kg) voorafgaand aan endotracheal intubatie en verder algemene anesthesie met 0,8% -2% isofluraan. Plaats een perifere ader katheter in een oor en trekken glucose (25 mg / ml) intraveneus gedurende de procedure om het welzijn van het dier te handhaven.
- Plaats monitoren apparaten op het oor of staart aan de temperatuur, bloeddruk, verzadiging, en perifere pols controleren. Controle verdoving met pijn stimulatie van de oren of hoeven. Toepassen zalf ogen tot droog voorkomen terwijl onder verdoving.
- Excisie van Blaas biopt
- Katheteriseren de blaas met een 10-French siliconen katheter door de invoering van een speculum om de urethra te bekijken en een katheter via de urethra en in de urineblaas om de urine onder semi-steriele omstandigheden legen. Vul de blaas met steriele zoutoplossing tot een druk van 20-25 cm H2O, ongeveer 100-300 ml, en vervolgens leeg 20 cm H2O (ong. 8 ml / kg lichaamsgewicht).
- met the varken voorzichtig gedraaid een zijligging Voer een basis preoperatieve sterilisatie van de huid met toepassing van chloorhexidine gluconaat. Breng een diathermie plaat om de schouder na het verwijderen van de vacht met het scheren schaar.
- Draai het varken voorzichtig in een liggende positie en verwijder de buik vacht met behulp van het scheren schaar en doe een eenvoudige preoperatieve sterilisatie van de buikhuid met toepassing van chloorhexidine gluconaat.
- Insluiten uiteinden met zachte kleding om het risico van hyperextensie beschadiging van de gewrichten in de extremiteiten minimaliseren. Steriliseer de abdominale huid van het dier met opeenvolgende toepassingen van chloorhexidine gluconaat en plaats steriel draperen rond het operatiegebied.
- Vóór huid incisie, breng een intraveneuze analgeticum bestaat uit buprenorfine (45 ug / kg), carprofen (3 mg / kg) en de lokale injectie van lidocaïne in de middellijn onder de navel. Controleer of pijn reactie door het grijpen van de skmet pincet. Maak een lagere middellijn incisie door de fascia en het buikvlies met behulp van diathermie voor de controle van bloeden. Lokaliseren van de blaas dat een volledig intraperitoneale positie in het varken heeft en kan vrij worden blootgesteld door het mobiliseren van het door de chirurgische wond.
- Pak de blaas met de tang en meet het met een gesteriliseerde meetlint en markeer een elliptische vorm biopt ongeveer 2 cm in de lengte en 1 cm in dwarsrichting, of kleiner, met behulp van een gesteriliseerde pen (het varken tolereert een kwart reductie van de blaas omvang erg goed). Uitsnijden het aangegeven gebied, met behulp van een scalpel, en plaats de blaas biopt in DMEM onder steriele omstandigheden.
- Voer autotransplantatie met de Biotransplant of sluit de blaas door het hechten van het met 5-0 Vicryl in twee lagen. Sluit de abdominale fascia zorgvuldig met 2-0 of 3-0 hardlopen Vicryl. Sluit de subcutis met 3-0 Vicryl en de huid met 3-0 Ethilon. Plaats een dressing op de wond en zorgvuldig opde neiging om het dier totdat hij voldoende uit de narcose hersteld is en niet tot expressie pijn.
- Verplaats het dier om het dier zorginstelling aan de voorwaarden voor postoperatieve zorg veilig te stellen. Zet het dier in één kooi met een warmtelamp en wonen aan het dier tot volledig herstel van de narcose en laat de dieren worden vastgelopen in paren.
- Geef een rustig herstel over pijn en welzijn en dienen buprenorfine (45 ug / kg) intramusculair voor postoperatieve analgesie en trimethoprim (4 mg / kg) en sulfonamide (20 mg / kg) tweemaal per dag gedurende drie dagen eenmaal daags gedurende vijf dagen om het risico op postoperatieve infecties.
- Excisie van de huid biopt
- Bereid de chirurgische tafel met alle benodigde materialen. Verdoven het dier zoals eerder beschreven in 1.1. Verwijder de vacht met behulp van wax, wassen en steriliseren van de incisie met betadine en 70% alcohol en plaats steriel draperen around de incisiegebied.
- Gebruik een dermatoom een 0,3 mm gedeeltelijke dikte van de huid biopt te oogsten. Plaats de huid model in DMEM voordat hakken, zoals beschreven in 2.2. Bedek de wond met vette zalf en een dressing.
2. Gehakt Tissue Voorbereiding
- blaasmucosa
- Was de blaas biopsie tweemaal in DMEM. Plaats de blaas biopt op een gesteriliseerde dissectie bord met het slijmvlies naar boven en zet één van de zijden van de plaat met behulp van dissectie pinnen.
- Scheid het mucosale weefsel van de detrusor spier met behulp van fijne schaar en pincet (figuur 3) en houd de mucosa vochtig drip zoutoplossing of DMEM overheen.
- Gebruik het hakken apparaat door het op de mucosa en vervolgens de inrichting van de ene naar de andere verticaal en horizontaal aanbrengen manuele druk stukjes gehakt weefsel van 0,8 mm x 0,8 mm te verkrijgen (0,8 mm is de afstand tussen de rotating messen).
- Huid
- Als de huid biopsis zijn dik: plaats de huid op een steriele dissectie plaat en gebruik chirurgische schaar om de epidermis van onderhuids vet en dermis te scheiden. De epidermis is dun en doorzichtig (ong. 0,3 mm) wanneer het klaar voor hakken.
- Gebruik de hakken apparaat door het op de opperhuid. Met druk langs de inrichting van de ene naar de andere verticaal en horizontaal stukjes gehakt weefsel van 0,8 mm x 0,8 mm te verkrijgen.
3. Voorbereiding van Plastic Compressed PCL / Collageen Autografts
- Doe alle ingrediënten op ijskoud te houden. Keukengerei die nodig is: Falcon buis, 10x DMEM, 1x DMEM, 1 N NaOH en rattenstaart collageen type 1.
- Meng 2 ml DMEM 10x (voorzichtig om luchtbellen te vermijden) met 12 ml van collageen type 1. Voeg 1 N NaOH druppelsgewijs aan tot pH 7,4-8 (kleur in het medium brengen moet de pH aangeven door het veranderen van intense geel naar pink). Daarnaast gebruikt u een pH-strip.
- Voeg voorzichtig 2 ml 1x DMEM en meng de oplossing. Plaat ongeveer 2 ml collageen in elk putje van de stalen rechthoekige vorm (20x30x10 mm) en incubeer bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende 10 minuten.
Opmerking: De concentratie van collageen dient 2,06 mg / ml in 0,6% azijnzuur en de hoeveelheid collageen 1 ml / cm2. - Zodra het collageen wordt in de mal plaatst het biomateriaal (PCL) bovenop de collageengel (20 mm x 30 mm) en giet de resterende collageen (ongeveer 6 ml) bovenop. Incubeer bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende 20 minuten.
- Leg het gehakte weefselmassa (1: 6 expansie) bovenop collageengel. Druk op het water uit het construct door mechanische kracht met behulp van plastic compressie als volgt (figuur 3 en 4).
- Leg een dikke laag gaasjes op een steriel oppervlak. Plaats een roestvrijstalen gaas (400 urn dik) bovenop de gauze pads en dan een blad van nylon mesh (110 micrometer dik). Breng voorzichtig het collageen gel / gehakt weefsel op de nylon mesh en verwijder voorzichtig de rechthoekige stalen mallen.
- Plaats een nieuwe laag nylon gaas bovenop de collageengel / gehakt weefsel. Plaats een tweede stalen gaas op de top van de nylon mesh. Plaats in de positie van de druk of het laden plaat met een gewicht van minimaal 120 g (dat wil zeggen, een glasplaat) gedurende 5 minuten.
- Verwijder het gewicht, nylon en stalen mazen. De autografts zijn nu klaar om te worden gehecht aan de varkensblaas in de full-dikte van de huid wonden of gekweekt in vitro.
- Voor in vitro kweken, snijd de dunne construct in kleine stukken passen 12-well platen. Voeg 1 ml van keratinocyten medium. Plaats de platen in de incubator bij 37 ° C, 5% CO 2 en kweek tot 6 weken en veranderen het medium 3 maal per week.
4. Suture van Autografts
- Suture van autograft metgehakt blaas slijmvlies aan de varkensblaas
- Houd de autograft vochtig in DMEM gedurende de wachttijd. Hecht de autograft met fijne lopende monofilament hechtingen. Gebruik niet absorbeerbare 5-0 Ethilon voor onderzoeksdoeleinden.
- Controleer of waterdicht door het vullen van de blaas met een zoutoplossing door middel van de inwonende blaaskatheter. Indien mogelijk, bedek de autograft met een laagje omentum majus. Sluit de buikwand, subcutaan weefsel en huid zoals beschreven in 1.2.6. Breng een wondverband.
- Suture van de Autograft met gehakt huidepidermis naar een Full-dikte Wound
- Houd de autograft vochtig in DMEM gedurende de wachttijd.
- Hechten de autograft onderaan de huid volledige dikte vereffening onderbroken hechtingen in de hoeken en in het midden van de autograft de autograft nauw contact met de ondergrond te houden.
- Bedek de wond met een plastic dressing dat houdt de wond vochtig.
- Sedate het dier met intramusculaire injectie van zolazepam hypochloride (2,5 mg / kg) en medetomidine (25 ug / kg) voorafgaand aan beëindiging en bewakingsinrichtingen voor het oor of staart toepassing op controle van de hartslag en bloeddruk.
- Euthanaseren het dier door toediening van een dodelijke dosis pentobarbital natrium (60-140 mg / kg) intraveneus. Controleer hartslag en bloeddruk tot de dood heeft plaatsgevonden.
6. In vitro kweek
OPMERKING: histologisch evalueren van de voortgang van het gehakte weefsel in de PCL / collageen constructen in vitro, de collageen / PCL / gehakt pleisters gekweekt in 12-well platen middels keratinocyten medium.
- Voorbereiding van de keratinocyten medium:
- Steriliseren een 500 ml glazen fles.
- Meng 400 ml DMEM met 100 ml Ham's F12 (4: 1 mengsel). Aangevuld met 10% foetaal runderserum, 5 ug / ml insuline,0,4 ug / ml hydrocortison, 21 ug / ml adenine, 10 -10 mol / L choleratoxine, 2 x 10 -9 mol / L triiodothyronine, 5 ug / ml transferrine, 10 ng / ml epidermale groeifactor, 50 U / ml penicilline en 50 ug / ml streptomycine.
- Steriliseren in filtreren door een 0,2 pm filter en het verzamelen van het filtraat in de steriele 500 ml fles.
7. Immunohistochemie
OPMERKING: De immunohistochemie protocol wordt algemeen onderverdeeld in de volgende stappen: (1) fixeren en inbedden in paraffine, (2) micro snijden tot 5 urn plakjes plaatsing op objectglaasjes deparaffinering en rehydratie, (3) antigeen ontmaskering, vlekken en montage . Voor aanvang van de laatste stappen in de immunohistochemie procedure, de voorbereiding van de wassen buffers en het antigeen ontmaskering oplossing (zie apart materiaal details). Bereid de ABC complex oplossing ten minste 30 minuten voor gebruik.
- bevestiging
NEETE: Aan het einde van de in vitro kweek, stelt de patches als volgt:- Bereid Eppendorf buisjes met 1 ml 4% gebufferde formaldehyde (PFA) (Let op:. Formaldehyde is giftig Lees veiligheidsinformatiebladen voordat u gaat werken met deze chemische Draag handschoenen en een veiligheidsbril en de voorbereiding van de oplossing in een zuurkast.).
- Transfer elke collageen pleisters een Eppendorf buis met 4% PFA. Fix 's nachts bij kamertemperatuur.
- Leg monsters in 70% ethanol voor langdurige opslag bij 4 ° C. Monsters zijn nu klaar voor dehydratie en inbedding in paraffine blokken voor het snijden.
- rehydratatie
- Plaats de objectglaasjes in een kleuring pot met X-tra solv gedurende 15 min. Herhaal dit met behulp van een nieuwe kleuring pot met X-tra SOLV. Plaats de objectglaasjes in een kleuring pot met absolute ethanol gedurende 10 minuten. Herhaal dit met behulp van een nieuwe kleuring pot met absolute ethanol. Plaats de objectglaasjes in een kleuring pot met 95% ethanol gedurende 10 minuten en daarnaeen kleuring pot met 70% ethanol gedurende 10 minuten. Tenslotte was de dia tweemaal gedurende 5 minuten met gedestilleerd water.
- antigen ontmaskeren
- Zet dia's in een Coplin pot met TE-oplossing en zet de pot in een waterbad aan de kook gedurende 20 min. Neem de pot uit het waterbad voorzichtig. Koel de dia tot kamertemperatuur gedurende 30 min en tweemaal wassen gedurende 5 minuten in Tris-buffer. Plaats de objectglaasjes in een kleuring pot met 3% waterstofperoxide gedurende 10 minuten. Was de dia tweemaal gedurende 5 minuten in Tris-buffer. Omcirkel de monsters met een waterafstotende markeerstift.
- Blok-specifieke binding van het antilichaam middels 100-300 pl blokkeeroplossing. Verwijder de blokkerende oplossing en voeg 100-300 gl primair antilichaam opgelost in de aanbevolen concentratie in Tris buffer. Incubeer overnacht. Verwijder de antilichaamoplossing en was secties in Tris buffer tweemaal gedurende 5 minuten.
- Incubeer met tweede antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur temperature. Was tweemaal gedurende 5 minuten in Tris-buffer. Incubeer 30 min met behulp van de ABC Elite Kit (volg de instructies van de fabrikant). Twee keer wassen in Tris-buffer.
- Ontwikkelen antilichaamreactie met de VIP Vector Kit, volgens de instructies van de fabrikant (1-7 min incubatie algemeen produceert een heldere violette intensiteit). Zet de glaasjes in gedestilleerd water. Tegenkleuring met hematoxyline Mayer voor 30 sec.
- Wassen in stromend water gedurende 5 min. Plaats de objectglaasjes in een kleuring pot met 70% ethanol gedurende 1 minuut. Herhaal met behulp van een nieuwe kleuring pot met 70% ethanol. Plaats de objectglaasjes in een kleuring pot met 95% ethanol gedurende 1 minuut. Herhaal met behulp van een nieuwe kleuring pot met 95% ethanol.
- Plaats de objectglaasjes in een kleuring pot met X-tra solv gedurende 5 min. Verwijderen, een voor een vochtig te houden. Een druppel van montage medium bovenop elkaar glijden en zet een dekglaasje geplaatst (doen voorzichtig om luchtbellen te vermijden). Laat de dia's drogen 's nachts en dia's onder een microscope.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze studie presenteert een methode die laat zien hoe een biomateriaal voor transplantatie te produceren met behulp van plastic compressie van collageen en gehakt weefsel.
Blaasslijmvlies en huid kunnen worden geoogst en vervolgens mechanisch in kleine deeltjes gehakt (figuur 3). Door kunststof compressie, worden de gehakte deeltjes opgenomen in de samengestelde steiger bestaande uit een centrale bioafbreekbaar polymeer dat mechanisch sterke binnen buitenlagen van een collageengel (figuur 4). Gehakt weefsel deeltjes kunnen worden gescheiden om een 1 toe te staan: 6 uitbreiding tarief. Door op het watergehalte van het collageen, wordt een Biotransplant autologe reconstructieve chirurgie voltooid.
Biotransplants kan worden gebruikt voor autotransplantatie om het dier in vivo onderzoeken of gekweekt in een gewone celkweek omgeving voor verdere in vitro studies.
T Hij samengestelde autograft kunt grijpen en hechten en onderhoudt chirurgische behandeling (Figuur 5). Het proces uit weefsel oogst en voorbereiding van de celbevattende autograft reconstructieve operatie duurt ongeveer 20 minuten en is bedoeld om te worden uitgevoerd als een single-gefaseerde procedure.
In in vitro studies cellen migreren, uitbreiden en reorganiseren om het oppervlak van de autograft in een eencellige continue laag in twee weken. Na vier weken, de continue epitheel ongeveer 4 cellagen dik (figuur 6). Immunohistochemie op verschillende tijdstippen blijkt dat cellen prolifereren, te migreren en reorganiseren in een continue epitheel met een microarchitectuur kenmerkend voor de cel fenotype. Dezelfde resultaten gelden voor autografts met gehakt huid epitheel als voor gehakt blaas slijmvliezen.
1 / 53061fig3.jpg "/>
Figuur 3:. Gehakt weefselpreparatie en kunststof compressie De bereiding van blaasmucosa (A) voor hakken (C) en kunststof compressie (D - F), via het hakken inrichting (B) en de matrijs (D) een produceren 420 urn dikke transplantatie (H). Merk op dat collageen zelf een goede extracellulaire matrix maar is moeilijk mechanisch te verwerken (G); door een biologisch afbreekbare stof als een versterkende kern, de transplantatie wordt het gemakkelijk te begrijpen (H).
Figuur 4: Plastic compressie Een geanimeerde cartoon toont het proces van plastic compressie met gehakt deeltjes..
Figuur 5:. Chirurgische behandeling volledige dikte van de huid wond model in een rat te tonen gehecht plastic-gecomprimeerde biomateriaal met gehakt huid voor autotransplantatie gemarkeerd als T (getransplanteerd autograft) Gehechte biomateriaal zonder gehakt huid gemarkeerd als S (sham). In dit geval werd gehakt huidepitheel getransplanteerd naar een 1: 3 expansiesnelheid.
Figuur 6: Immunohistochemische kleuring om de progressie van de 3D cultuur visualiseren in het collageen-biomateriaal gehakt huid en blaasmucosa (A - D) hematoxyline / eosine kleuring van (A) natieve huid, (B) natief blaas, (C) gehakt. huid na 5 weken in de cultuur en (D) gehakt blaas na 6 weken in de cultuur. De expressie van epitheliale en proliferatiemerkers met MNF116 (E) en Ki 67 antilichamen (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze studie geeft een gemakkelijk te gebruiken benadering blaaswand vlekken met autologe weefsels voor transplantatie produceren de operatietafel. De pleisters worden gevormd door de combinatie van een biologisch afbreekbaar polymeer breien in het midden en collageen met en zonder gehakt weefsel in de buitenvlakken kunststof verbonden met compressie. Plastic compressie is een methode eerder beschreven door andere auteurs en kan worden gedefinieerd als een snelle verwijdering van vocht uit collageen gels 12,13. Gehakt weefsel van de blaas slijmvlies of de huid wordt uitgezet in deze steiger en de vorming van een blaas of de huid epitheel gedurende 6 weken gevolgd kon worden. Immunohistochemische analyse toonde de vorming van equivalenten aan de normale weefsel. Deze resultaten laten niet alleen een in vitro model voor de studie re-epithelisatie en wondgenezing, maar vormt ook een biomateriaal voor autologe weefseltransplantatie. Belangrijker voor urologie doeleinden, de autografts kan worden toegepast voor in vivo toepassingen van weefselmanipulatie in reconstructieve urologie gemanipuleerde autoloog weefsel pleisters zonder de noodzaak voor in vitro kweek vóór transplantatie 11.
Met betrekking tot cel expansie en in vitro kweektechnieken, huid epitheel en uroepithelium delen gemeenschappelijke kenmerken. Het motief de techniek presenteren plastic compressie en hakken zowel epitheliale weefsels in deze studie was dat oogsten en in vivo studies huidepitheel gemakkelijker dan blaas uroepithelium. Door deze middelen kunnen biomaterialen en huidepitheel worden bestudeerd als een eerste stap om biocompatibiliteit en fysische eigenschappen bevestigen alvorens meer invasieve studies in de urogenitale organen.
In voorgaande in vivo studies, met behulp van het concept van het gehakt weefsel met blaas slijmvlies voor weefselregeneratie van leidingen, bevindingen waren dat the kleine getransplanteerde deeltjes vereist een aantal mechanische ondersteuning om mechanische trauma te weerstaan en om te verblijven in plaats tijdens de eerste opname van de getransplanteerde gehakt deeltjes en tijdens het genezingsproces en weefselregeneratie 6,7.
Om deze tekortkomingen te overwinnen, het onderzoek gericht op het ontwikkelen van een hybride construct met een biologisch afbreekbare kern van een polymeer breiwerk en kunststof-gecomprimeerde collageen 11,14. Het collageen zorgt voor een gunstig oppervlakte voor celhechting en groei en maakt directe en snelle integratie van het gehakt weefsel in het schavot. Omdat de mechanische eigenschappen van collageen, ook na plastische samendrukking, nog zwak en niet de weeën en uitbreidingen van de natuurlijke blaas bewegingen sustain een ondersteunende kern matrix voor het collageen toegevoegd. Voor meer complexe structuren kan getransplanteerde weefsel worden uitgebreid om een geprefabriceerde vorm om een driedimensionaal ep producerenithelialized structuur met een centraal lumen.
In deze studies gebruikten we PCL als stabiliserende polymeer en de kern van de biograft. PCL wordt veel gebruikt in uiteenlopende biomedische apparaten zoals tandvullingen, synthetische absorbeerbare chirurgische mazen en hechtmateriaal 14. Met het oog op de rijping van het aangetaste weefsel, dat wil zeggen innervatie, glad spierweefsel en extracellulaire matrix te schaffen, kozen we voor een PCL-polymeer met een langzame afbraaksnelheid over meerdere maanden. Echter, de afbraaksnelheid worden geregeld door de keuze van polymeer, de dikte en dichtheid 11,16.
Collageen werd gekozen als een component van de samengestelde construct door bekende biocompatibiliteit, veiligheid en goede genezing eigenschappen. Het collageen stimuleert ingroei van granulatieweefsel, re-modellering en rijping van extracellulaire matrix 15. Collageen wordt afgebroken, neovascularisatie en granulatieweefsel ondersteunt de transplantatieed gehakt deeltjes die reorganiseren, migreren en uit te breiden 5-7,11,16. Daarnaast collageen is een belangrijke natuurlijke component van de extracellulaire matrix zowel in de huid en in de blaas en is gebruikt voor het maken van steigers zowel in vitro als in vivo studies waaronder wondgenezing en reconstructies in het urogenitale systeem 17,18.
De kritische stappen in het protocol zijn gemakkelijk hanteerbaar. Ten eerste, de biopsie exemplaren hebben onder vochtige en gunstige voorwaarden voor het inbrengen worden gehouden in het transplantaat of anders celgroei zal worden vertraagd of afwezig zijn. Een tweede valkuil kan inhouden om de juiste stevigheid van het collageen. Men moet ervoor zorgen dat het collageen stijf tijdens de voorbereiding van de autograft door het vermijden van luchtbellen in het collageen gel. Bubbles worden vermeden door zorgvuldige pipetteren en kleine belletjes kan worden verbroken met een naald. Collageen met bubbels moet worden weggegooid.
Het is eenLSO belangrijk om de juiste omvang van het gehakt weefsel te krijgen; voordat hakken het weefsel, zorg ervoor dat alleen de dunne blaas slijmvlies wordt gebruikt in geval van blaas uitbreiding of alleen de epidermis in het geval van de huid expansie. De laatste valkuil is wanneer hechten: zorg loodrecht naar de transplantatie van de naald om te voorkomen dat het scheiden van de verschillende lagen. Randen van de autograft moeten ook zorgvuldig worden behandeld om het collageen niet te scheiden van het polymeer. Na het hechten van de platen zal moeilijker te scheiden zijn. Dit zijn veel voorkomende problemen die zich kunnen voordoen bij het leren van de techniek.
Een beperking van deze techniek is dat de cellen in het gehakte deeltjes afhankelijk diffusie van voedingsstoffen en zuurstof. Daarom is de dikte van de autograft moet minder dan 1 mm en heeft een goed gevasculariseerd site worden geplaatst. Dit kan een nadeel gezien het risico op lekken van urine door het getransplanteerde gedeelte van de blaas. Afhankelijk van de plastic compressie kunnen verschillende permeabiliteit constanten worden bereikt. In ons geval was de hydraulische permeabiliteit (k) 0,034 waarde volgens eerdere studies 19. In een klinische setting verwachten we dat we nodig hadden om de blaas te legen met katheters voor ongeveer 1-2 weken op orde te houden om tijd te geven voor de urotheelcellen het opbouwen van een multi-layered continue urotheel dat voordat de patch actieve niet-doorlaatbaar te maken gebruik.
Een andere beperking is de veronderstelling van een gezond orgaan voor weefsel oogst en expansie. In ernstiger gevallen wanneer de blaas ontbreekt of niet geschikt is voor expansie, bijvoorbeeld als getroffen door kanker, de techniek mogelijk niet geschikt.
Net als voor andere weefselmanipulatieproducten celpreparaten, definitieve conclusies over de functionele en morfologische resultaten kunnen alleen worden in de lange termijn beantwoord in vivo studies. Onze volgende stap zal zijn om onze resultaten op lange termijn dierstudies te analyseren ten opzichte van Viabiliteit en fysiologische kenmerken na transplantatie.
De betekenis van de gepresenteerde techniek is het mogelijk om weefsel in vivo uitbreiding na een chirurgische ingreep. Andere technieken momenteel geëvalueerd zijn allemaal afhankelijk van de uitbreiding van cellen in vitro voor transplantatie. De in vitro procedures hebben de keerzijde van wordt geassocieerd met hoge kosten, behoefte hebben aan geavanceerde laboratorium personeel, en het zijn tijdrovend. Het kan tot 2 maanden tussen het oogsten van weefsel of cellen en een tissue-engineered autograft; in tegenstelling tot minder dan 1 uur, volgens de in deze studie beschreven techniek.
In de toekomst kan gehakt weefsel samengedrukt collageen technieken worden ontwikkeld en gebruikt in andere organen, zoals buikwanddefecten, hernia diaphragmatica en andere aandoeningen waarbij een defect niet gemakkelijk gereconstrueerd met bestaande weefsel.
in vivo. De werkwijze van het bereiden van een autograft gemakkelijk te doen en kan onder steriele omstandigheden worden gebruikt in een gewone chirurgische ingreep. De autograft weerstaat chirurgische behandeling en is biologisch afbreekbaar. De kern van de autograft kan uit verschillende biologisch afbreekbare polymeren afhankelijk van de voorkeuren met betrekking tot de afbraaksnelheid en andere kenmerken, zoals elasticiteit, dikte en porositeit, en volgens de specifieke behoeften van de patiënt. In een klinische setting, zou de patiënt weefsel oogst, de voorbereiding van de samengestelde autograft en autotransplantatie als een single-stage te ondergaan. Bovendien zijn alle onderdelen van de celbevattende bioconstructs nog FDA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicone catheter 10-French | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| DMEM 10x | Gibco | 31885-023 | Plastic compression section 4 |
| 24 well plates | Falcon | 08-772-1 | Plastic compression section 4 |
| 3',3',5-Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | IRMM469 | In vitro culture; Section 5 |
| 4% PFA | Labmed Solutions | 200-001-8 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| 70% ethanol | Histolab | Immunocytochemistry; Section 6 | |
| ABC Elite kit: Biotin-Streptavidin detection kit | Vector | PK6102 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Absolute ethanol | Histolab | 1399.01 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A8626 | In vitro culture; Section 5 |
| Atropine 25 μg/kg | Temgesic, RB Pharmaceuticals, Great Britain | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Azaperone 2 mg/kg | Stresnil, Janssen-Cilag, Pharma, Austria | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Biosafety Level 2 hood | Plastic compression; Section 4 | ||
| Blocking solution: Normal serum from the same species as the secondary secondary antibody was generated in. | Vector | The blocking solution depends of the origin of first antibody | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Buprenorphine 45 μg/kg | Atropin, Mylan Inc, Canonsburg, PA | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Carprofen 3 mg/kg | Rimadyl, Orion Pharma, Sweden | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Chlorhexidine gluconate | Hibiscrub 40 mg/mL, Regent Medical, England | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | In vitro culture; Section 5 |
| Coplin jar: staining jar for boiling | Histolab | 6150 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Stainless mold (33 mm x 22 mm x 10 mm) custom made | Plastic compression; Section 4 | ||
| DMEM | Gibco | 3188-5023 | Plastic compression section 4. Keep on ice when using it in plastic compression |
| Epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E9644 | In vitro culture; Section 5 |
| Ethilon (non-absorbable monofilament for skin sutures) | Ethicon | Surgery, Section 1 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10437-036 | Plastic compression section 4 |
| Forceps (Adison with tooth) | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Gauze (Gazin Mullkompresse) | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Ham's F12 | Gibco | 31765-027 | Plastic compression section 4 |
| Hematoxylin | Histolab | 1820 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Humidity chamber | DALAB | Immunocytochemistry; Section 6 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | In vitro culture; Section 5 |
| Hydrogen peroxide Solution 30% | Sigma-Aldrich | H1009 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I3536 | In vitro culture; Section 5 |
| Isoflurane | Isoflurane, Baxter, Deerfield, IL | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Lidocaine 5 mg/ml | Xylocaine, AstraZeneca, Sweden | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Lucose 25 mg/ml | Baxter, Deerfield, IL | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Marker pen pap pen | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Medetomidine 25 μg/kg | Domitor, Orion Pharma, Sweden | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Mincing device | Applied Tissue Technologies LLC | Minced tissue preparation, section 2 | |
| Monocryl (absorbable monofilament) | Ethicon | Surgery, Section 1 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| NaOH 1 N | Merck Millipore | 106462 | Plastic compression section 4 and cell culture |
| Nylon mesh, 110 μM thick pore size 0.04 sqmm | Plastic compression; Section 4 | ||
| Oculentum simplex APL: ointment for eye protection | APL | Vnr 336164 | Surgery, Section 1 |
| PBS | Gibco | 14190-094 | Plastic compression section 4 |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Plastic compression section 4 |
| Phenobarbiturate 15 mg/kg | Pentobarbital, APL, Sweden | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| PCL Knitted fabric | Plastic compression; Section 4 | ||
| Rat-tail collagen | First LINK, Ltd, UK | 60-30-810 | Plastic compression section 4, keep on ice |
| Scalpel blade - 15 | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Shaving shears | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Stainless stell mesh, 400 μM thick pore size | Plastic compression; Section 4 | ||
| Steril gloves | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Sterile gowns | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Sterile drapes | |||
| Sterilium | Bode Chemie HAMBURG | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Suture Thread Ethilon | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| TE-solution (antigen unmasking solution) consist of 10 mM Tris and 1 mM EDTA, pH 9.0 | 10 mM Tris/1 mM EDTA, adjust pH to 9.0 | ||
| Tiletamine hypochloride 2.5 mg/kg | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | In vitro culture; Section 5 |
| Trizma Base, H2NC | Sigma-Aldrich | T6066 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Vector VIP kit: Enzyme peroxidase substrate kit | Vector | SK4600 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Vicryl (absorbable braded) | Ethicon | Surgery, Section 1 | |
| Tris buffer pH 7.6 (washing buffer) | TE solution: Make 10x (0.5 M Tris, 1.5 M NaCl) by mixing: 60.6 g Tris (Trizma Base, H2NC(CH2OH)3, M=121.14 g/mol), add 800 ml distilled water adjust the pH till 7.6, add 87.7 g NaCl and fill to 1,000 ml with distilled water. Dilute to 1x with distilled water. | ||
| X-tra solv (solvent) | DALAB | 41-5213-810 | Immunocytochemistry; Section 6. Use under fume hood |
| Zolazepam hypochloride | Zoletil, Virbac, France | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Depilatory wax strips | Veet | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Pentobarbital sodium | Lundbeck | Termination, Section 3 |
References
- Rheinwald, J. G., Green, H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell. 6, 331-343 (1975).
- Fossum, M., Nordenskjold, A., Kratz, G. Engineering of multilayered urinary tissue in vitro. Tissue Engineering. 10, 175-180 (2004).
- Salmikangas, P., et al. Manufacturing, characterization and control of cell-based medicinal products: challenging paradigms toward commercial use. Regen Med. 10, 65-78 (2015).
- Guidelines of 7 March 2013 on Good Distribution Practice of medicinal products for human use (OJ C 343/1, 23.11.2013). 7, Retrieved from: http://ec.europa.eu/health/human-use/good_distribution_practice/index_en.htm (2013).
- Fossum, M., et al. Minced skin for tissue engineering of epithelialized subcutaneous tunnels. Tissue Engineering. Part A. 15, 2085-2092 (2009).
- Fossum, M., et al. Minced urothelium to create epithelialized subcutaneous conduits. The Journal of Urology. 184, 757-761 (2010).
- Reinfeldt Engberg, G., Lundberg, J., Chamorro, C. L., Nordenskjold, A., Fossum, M. Transplantation of autologous minced bladder mucosa for a one-step reconstruction of a tissue engineered bladder conduit. BioMed Research International. 2013, 212734 (2013).
- Meek, C. P. Successful microdermagrafting using the Meek-Wall microdermatome. Am J Surg. 96, 557-558 (1958).
- Tanner, J. C., Vandeput, J., Olley, J. F. The Mesh skin graft. Plastic and Reconstructive Surgery. 34, 287-292 (1964).
- Svensjo, T., et al. Autologous skin transplantation: comparison of minced skin to other techniques. The Journal of Surgical Research. 103, 19-29 (2002).
- Ajalloueian, F., Zeiai, S., Rojas, R., Fossum, M., Hilborn, J. One-stage tissue engineering of bladder wall patches for an easy-to-use approach at the surgical table. Tissue Engineering. Part C, Methods. 19, 688-696 (2013).
- Engelhardt, E. M., et al. A collagen-poly(lactic acid-co-varepsilon-caprolactone) hybrid scaffold for bladder tissue regeneration. Biomaterials. 32, 3969-3976 (2011).
- Brown, R. A., Wiseman, M., Chuo, C. B., Cheema, U., Nazhat, S. N. Ultrarapid engineering of biomimetic materials and tissues: fabrication of nano- and microstructures by plastic compression. Adv Funct Mater. 15, 1762-1770 (2005).
- Fumagalli Romario, U., Puccetti, F., Elmore, U., Massaron, S., Rosati, R. Self-gripping mesh versus staple fixation in laparoscopic inguinal hernia repair: a prospective comparison. Surg Endosc. 27, 1798-1802 (2013).
- Muangman, P., et al. Complex Wound Management Utilizing an Artificial Dermal Matrix. Annals of Plastic Surgery. 57, 199-202 (2006).
- Ajalloueian, F., Zeiai, S., Fossum, M., Hilborn, J. G. Constructs of electrospun PLGA, compressed collagen and minced urothelium for minimally manipulated autologous bladder tissue expansion. Biomaterials. 35, 5741-5748 (2014).
- Orabi, H., AbouShwareb, T., Zhang, Y., Yoo, J. J., Atala, A. Cell-seeded tubularized scaffolds for reconstruction of long urethral defects: a preclinical study. Eur Urol. 63, 531-538 (2013).
- Blais, M., Parenteau-Bareil, R., Cadau, S., Berthod, F. Concise review: tissue-engineered skin and nerve regeneration in burn treatment. Stem Cells Transl Med. 2, 545-551 (2013).
- Serpooshan, V., Muja, N., Marelli, B., Nazhat, S. N. Fibroblast contractility and growth in plastic compressed collagen gel scaffolds with microstructures correlated with hydraulic permeability. J Biomed Mater Res A. 96, 609-620 (2011).
