Summary
При помощи этой технологии часто включает в пробирке расширения, чтобы создать аутотрансплантатов для регенерации ткани. В этом исследовании способ расширения ткани, регенерации, и реконструкции в естественных условиях была разработана для того, чтобы свести к минимуму обработку клеток и биологических материалов вне тела.
Introduction
Большинство тканевой инженерии исследования по трансплантации кожи и мочеполового тракта включают аутологичных урожаи клеток из здоровых тканей и расширение клеток в специально оборудованных клеточных культивирования объектов 1,2.
После расширения клеток, клетки обычно сохраняется для последующего использования, когда пациент готов получить аутотрансплантата. морозильники азота позволяют длительное хранение при низких температурах -150 ° С или ниже. Процесс замораживания должен быть осторожным и контролировать, чтобы не потерять клетки. Один из рисков гибели клеток вне кристаллизация внутриклеточной воды в процессе оттаивания, которое может привести к разрыву клеточных мембран. Сотовый замораживания обычно выполняется путем медленного и регулируемого охлаждения (-1 ° С в мин), используя высокую концентрацию клеток, фетальной бычьей сыворотки и диметилсульфоксида. После оттаивания эти клетки должны быть обработаны снова удаления среды замерзания и культивирование клеток на пластике культуры или егобиоматериала перед трансплантацией обратно пациенту.
Все вышеупомянутые шаги трудоемким, трудоемким и дорогостоящим 3. Кроме того, все в пробирке обработка клеток, предназначенных для трансплантации пациенту тщательно регулируются и требует хорошо подготовленных и аккредитованных персонала и лабораторий 4. В общем, чтобы обеспечить безопасную и надежную производственный процесс, технология может быть установлена только в очень небольшом количестве технически передовых центров и более широкое использование в распространенных хирургических заболеваний сомнительна.
Для того чтобы преодолеть ограниченность культивирования клеток в лабораторных условиях, понятие пересадки измельченной ткани для расширения клеток в естественных условиях вводят с помощью самого тела как биореактор. Для этих целей, как аутографты преимущественно будут пересажены на 3D плесени в соответствии с формой, которая необходима для окончательного восстановления органа Iпроценты 5-7.
Первоначально, идея пересадки фарш эпителий был представлен Миком в 1958 году, когда он описал, как эпителий растет от краев раны. Он показал, что маленький кусочек кожи приведет к увеличению рентабельности и тем самым его потенциал для расширения клеток на 100% за счет сокращения кусок дважды в перпендикулярных направлениях (рисунок 1) 8. Эта теория была поддержана использования отверстиями частичных протезов толщина кожи для трансплантации кожи 9 и в коже ранозаживляющие модели 10.
Рисунок 1:. Мик теория Согласно теории кроток, в эпителий растет от краев раны. Увеличивая площадь воздействия по технологии мясорубки, измельченной ткани epithelializes раны от многих местах.
Настоящее исследование основано на гипо-тезис, что тот же принцип может быть применен к подкожной клетчатке, помещая измельченный эпителий вокруг формы. Эпителиальные клетки мобилизует из рубленого трансплантатов (реорганизовать), охватывают участки раневые (миграцию) и деления (развернуть) для того, чтобы сформировать непрерывную neoepithelium который покрывает область раны и отделяет постороннее тело (пресс-формы) с внутренним корпусом ( Рисунок 2).
Рисунок 2:. Мультфильм 3D формы с рубленым эпителия для расширения в естественных интракорпоральной ткани в соответствии с теорией Меек При использовании измельченной ткани, размещенный на форме и затем пересаживают в подкожной клетчатке, гипотеза о том, что эпителиальные клетки мигрируют из края фарша ткани, реорганизовать и расширить таким образом, чтобы образовывать непрерывную neoepithelium который покрывает область раны и отделяет постороннее тело (пресс-формы) с внутренним корпусом.
Хотя предыдущие исследования в естественных условиях показывают многообещающие результаты, дальнейшие улучшения могут быть достигнуты путем укрепления аутотрансплантатов, так что регенерированный эпителий может выдерживать механическую травму лучше 7. Для этих целей, были определены важные предпосылки для успешного биоматериала, такие как: легкий диффузии питательных веществ и отходов, возможность плесени в 3D образом и легкости хирургического обработки. Выводы были сделаны, что эти потребности могут быть удовлетворены путем добавления композитный биоматериал для фарша ткани.
Данное исследование направлено на развитие леску, состоящую из измельченной ткани в пластиковый сжатые коллаген, содержащий армирующий стержень биоразлагаемого материала. С помощью этих средств, жизнеспособные клетки могут мигрировать из рубленого частиц тканей и размножаются с морфологические черты, характерные для оригинальной эпителия (кожи или уротелии). Используя пластиковую сжатие, подмости был снизитьд в размере от 1 см до примерно 420 мкм, как из рубленого частиц были помещены в коллагене верхнего уровня. Ядро ткани может быть любой полимер, но должна быть изменена с гидрофильной поверхностью, с тем чтобы соединяются друг с другом с покрывающими коллагеновых слоев 11.
Способ обеспечил повышенную целостность эшафот путем включения вязаную сетку, состоящую из поли (-капролактон) (PCL) в течение двух пластиковых сжатый коллагеновых гелей с использованием его в качестве каркаса для культивирования фарш слизистая оболочка мочевого пузыря или фарш кожу от свиней. Конструкция поддерживалась в условиях культуры клеток до 6 недель в пробирке, демонстрируя успешное формирование слоистой, многослойной уротелии или плоского эпителия кожи на верхней части сплоченный гибридной конструкции. Конструкт был прост в обращении и может быть зашивается в месте для целей дополнения пузыря или покрытия дефектов кожи. Все части эшафот тканевой FDA одобрен и техникаможет быть использован для процедур одноступенчатых путем сбора ткани, мясорубки, пластической сжатия, и трансплантировать обратно пациенту в виде одной-ступенчатую вмешательства. Процедура может быть выполнена для расширения тканей и реконструкции в стерильных условиях в любом общем блоке хирургии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все протоколы животных были предварительно одобрены графства комитета Стокгольме животных и все процедуры соответствовали нормативам по использованию животных, а также соответствующими федеральными законами.
1. Процедуры животных
- Подготовка животных для хирургии
- Подготовьте операционный стол со всеми материалами и инструментами, необходимыми для работы в стерильных условиях. Выполните операцию исключительно в стерильных условиях, чтобы снизить риск инфекции и оптимизировать условия в хирургии выживания.
- Быстрое животное в течение 12 ч до операции и измерить свой вес. Администрирование внутримышечную инъекцию azaperone (2 мг / кг) в течение премедикации. Обезболить животное с внутримышечных инъекций tiletamine гипохлорида (2,5 мг / кг), zolazepam гипохлорида (2,5 мг / кг), медетомидин (25 мкг / кг) и атропин (25 мкг / кг).
- Вводят phenobarbiturate (15 мг / кг) до endotracheаль интубации и продолжить общий наркоз с 0,8% -2% изофлуран. Вставьте периферийную катетер вены в одно ухо и влить глюкозу (25 мг / мл) внутривенно во время процедуры для поддержания благосостояния животного.
- Поместите устройства на уху или хвоста контроля для проверки температуры, артериального давления, насыщенности и периферическую пульс. анестезия управления болью стимуляции ушах или копыт. Применять мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
- Удаление мочевого биопсии
- Катетеризировать мочевой пузырь с использованием 10-французский силиконовый катетер с помощью введения расширитель для просмотра уретры и вставить катетер через уретру и в мочевой пузырь, чтобы опорожнить мочу под полу-стерильных условиях. Заполните пузырь с стерильным физиологическим раствором до давления 20-25 см H 2 O, примерно 100-300 мл, а затем пустой до 20 см Н2О (прибл. 8 мл / кг массы тела).
- С гое свиньи тщательно повернулся к боковой позиции, выполнить основную предоперационной стерилизацию кожи с применением хлоргексидина глюконата. Нанесите диатермия пластину к плечу после удаления шерсть с бритвенными ножниц.
- Включите свинью тщательно в положении лежа на спине и снять брюшной волосяной покров с использованием бритья ножницы и сделать основной предоперационной стерилизацию кожи живота с применением хлоргексидина глюконата.
- Встраивание конечностей с мягкой одежды, чтобы свести к минимуму риск повреждения гиперэкстензии суставов в конечностях. Стерилизовать кожу с брюшка животного с последовательным применением глюконата хлоргексидина и поместите стерильный драпировке вокруг операционного поля.
- До кожного разреза, применяются внутривенные анальгетик, состоящую из бупренорфина (45 мкг / кг), Carprofen (3 мг / кг) и местной инъекции лидокаина в средней линии ниже пупка. Проверьте болевой реакции, взявшись за SKв щипцами. Сделать более низкую срединный разрез через фасции и брюшины с помощью диатермии для остановки кровотечений. Локализация в мочевой пузырь, который имеет полностью внутрибрюшинную положение в свинью и может быть свободно предоставляемый мобилизации его через операционную рану.
- Возьмитесь мочевого пузыря с помощью пинцета и измерить его стерилизованной рулетка и пометить биопсии эллиптической формы около 2 см в продольном направлении и 1 см в поперечном направлении, или меньше, используя стерилизованный ручку (свинья терпит сокращение четверти размера пузыря очень хорошо). Вырежьте отмеченную область, используя скальпель, и поместите биопсии мочевого пузыря в DMEM в стерильных условиях.
- Выполните аутотрансплантации с biotransplant или закрыть мочевой пузырь путем наложения швов его 5-0 Викрил в два слоя. Закройте брюшной фасции осторожно 2-0 или 3-0 работает викрил. Закройте подкожного с 3-0 Викрил и кожу 3-0 Ethilon. Поместите повязку на рану и осторожно накак правило, животного, пока она не придет в себя достаточно от наркоза и не выражает боль.
- Перемещение животное объекте по уходу за животными, чтобы обеспечить условия для послеоперационного ухода. Положите животное в одном клетке с нагревательным лампы и посещать животному до полного восстановления от наркоза, а затем пусть животные застопорился в парах.
- Обеспечить беспрецедентный восстановление отношении боли и благополучия и администрировать бупренорфин (45 мкг / кг) внутримышечно для послеоперационного обезболивания и trimetoprim (4 мг / кг) и сульфонамида (20 мг / кг) два раза в день в течение трех дней и один раз в день в течение пяти дней чтобы снизить риск послеоперационных инфекций.
- Удаление кожи биопсии
- Подготовьте операционный стол со всеми необходимыми материалами. Обезболить животное, как описано выше в пункте 1.1. Снимите шерсть с помощью воска, мыть и стерилизовать области разреза бетадин и 70% -ным спиртом, а затем поместить стерильный драпировки arounD области разреза.
- Используйте дерматома собрать биопсии кожи частичная толщиной 0,3 мм. Поместите образец кожи в DMEM, прежде мясорубки, как описано в пункте 2.2. Обложка области раны с жирной мази и повязки.
2. Фарш Подготовка ткани
- Мочевой пузырь Слизистая
- Промыть биопсию мочевого пузыря в два раза в DMEM. Поместите биопсии мочевого пузыря на стерилизованной рассекает пластины со слизистой оболочкой вверх и зафиксировать одну из сторон к плите с помощью рассечение булавки.
- Отделить ткани слизистой от детрузора с использованием тонких ножниц и щипцов (Рисунок 3) и держать слизистую влажной путем капает физиологический раствор или DMEM над ним.
- Используйте устройство мясорубки, поместив его на слизистую оболочку, а затем передать устройство одного конца до другого по вертикали и горизонтали, применяя ручной давление, чтобы получить кусочки фарша ткани 0,8 мм х 0,8 мм (0,8 мм расстояние между rotatinг режущие лезвия).
- кожа
- Если biopsis кожи толщиной: поместите кожу помещается в стерильный рассекает пластины и использовать хирургические ножницы, чтобы отделить эпидермис от подкожного жира и дермы. Эпидермис тонкий и полупрозрачный (ок. 0,3 мм), когда он готов к мясорубки.
- Используйте мясорубки устройство, поместив его на эпидермис. С давлением, проходить устройство от одного конца до другого по вертикали и горизонтали, чтобы получить кусочки фарша ткани 0,8 мм х 0,8 мм.
3. Подготовка пластических сжатых PCL / Коллаген аутотрансплантатов
- Поместите все ингредиенты на льду держать холод. Посуда, необходимые: трубки сокола, 10x DMEM, 1x DMEM, 1 N NaOH и крысиный хвост коллагена типа 1.
- Смешайте 2 мл 10х DMEM (осторожно, чтобы избежать пузырей) с 12 мл коллагена типа 1. Добавьте 1 N NaOH, капля за каплей, чтобы принести рН до 7.4-8 (цвета в среде следует указать рН путем перехода от интенсивной желтый к контактук). Кроме того, использование рН полоску.
- Осторожно добавьте 2 мл 1x DMEM и перемешать раствор. Пластина примерно 2 мл коллагена в каждую лунку стального прямоугольного формы (20x30x10 мм) и инкубируют при 37 ° C в 5% CO 2 в течение 10 мин.
Примечание: Концентрация коллагена должно быть 2,06 мг / мл в 0,6% -ной уксусной кислотой и количество коллагена 1 мл / см 2. - После того, как коллаген устанавливает в форму, поставить биоматериал (PCL) на верхней части коллагеновый гель (20 мм х 30 мм) и залить оставшейся коллаген (около 6 мл) поверх него. Инкубировать при 37 ° С в 5% CO 2 в течение 20 мин.
- Поместите фарш ткани (за 1: 6 расширение) на верхней части коллагеновым гелем. Нажмите воду из конструкции механической силы с использованием пластиковой сжатие следующим образом (Рисунки 3 и 4).
- Поместите толстый слой марли колодки на стерильной поверхности. Поместите один сетка из нержавеющей стали (400 мкм) на верхней части gauzе колодки и затем лист нейлоновую сетку (110 мкм толщиной). Тщательно передачи коллаген гель / фарш ткани на нейлоновую сетку и осторожно удалите прямоугольный стальной формы.
- Поместите новый слой нейлоновую сетку на верхней части коллагена гель / фарша ткани. Поместите вторую металлическая сетка на верхней части нейлоновую сетку. Поместите в положении давлений или загрузки пластины весом минимум 120 г (т.е. стеклянной пластины) в течение 5 мин.
- Удалите вес, нейлоновые и стальные сетки. В аутографты теперь готовы быть пришит к свиньи пузыря в полную толщину кожных ран или культивировали в пробирке.
- Для культивирования в пробирке, разрезать тонкую конструкцию на мелкие кусочки, установленных 12-луночных планшетах. Добавьте 1 мл кератиноцитов среды. Место пластин в инкубаторе при 37 ° С, 5% СО 2 и культуры до 6 недель и изменения носителя 3 раза в неделю.
4. Шов аутотрансплантатов
- Шов из аутотрансплантата сфарш слизистой оболочки мочевого пузыря, чтобы свиньи пузыря
- Держите аутотрансплантатом влажный в DMEM в течение времени ожидания. Шовный аутотрансплантата с мелкими пробег мононити швов. Используйте нерассасывающегося 5-0 Ethilon для исследовательских целей.
- Проверьте водонепроницаемыми путем заполнения мочевого пузыря физиологическим раствором через рентгеноконтрастных мочевого катетера. Если это возможно, покрывают аутотрансплантата со слоем большого сальника. Закройте брюшной стенки, подкожную клетчатку и кожу, как описано в 1.2.6. Применить для перевязки ран.
- Шов из аутотрансплантата с мясным эпидермиса кожи до полного толщины рану
- Держите аутотрансплантатом влажный в DMEM в течение времени ожидания.
- Шовный аутотрансплантата к нижней части кожи на полную толщину раневой по узловыми швами по углам и в середине аутотрансплантата держать аутотрансплантата тесно прикрепленный к подстилающей поверхности.
- Накройте рану пластиковой повязки, которая держит рана влажная.
- Седативный животное с внутримышечной инъекцией zolazepam гипохлорида (2,5 мг / кг) и медетомидина (25 мкг / кг) до прекращения и применять контрольные устройства к уху или хвоста для проверки пульса и артериального давления.
- Эвтаназии животное путем введения смертельной дозы пентобарбитала натрия (60-140 мг / кг) внутривенно. Проверьте пульс и артериальное давление, пока смерть не произошло.
6. In Vitro Культура
Примечание: Чтобы оценить гистологически прогрессирование фарша ткани в PCL / коллагеновых конструктов в пробирке, коллагеновые / PCL / фарш пластыри культивируют в 12-луночных планшетах с использованием кератиноцитов среды.
- Получение кератиноцитов среды:
- Стерилизовать стеклянную бутылку емкостью 500 мл.
- Смешайте 400 мл DMEM с 100 мл F12 Хэма (смесь 4: 1). Дополнение с 10% фетальной телячьей сыворотки, 5 мкг / мл инсулина,0,4 мкг / мл гидрокортизона, 21 мкг / мл аденина, 10 -10 моль / л холерный токсин, 2 х 10 -9 моль / л трийодтиронин, 5 мкг / мл трансферрина, 10 нг / мл эпидермального фактора роста, 50 ед / мл пенициллина и 50 мкг / мл стрептомицина.
- Стерилизовать фильтрованием через фильтр с размером пор 0,2 мкм и собирать фильтрат в стерильный 500 мл флакон.
7. Иммуногистохимия
Примечание: Протокол иммуногистохимии, как правило, делится на следующие этапы: (1) фиксация и парафин, (2) микро-секционирования до 5 мкм ломтиками, размещения на слайдах, депарафинизации и повторной гидратации, (3) антиген разоблачения, окрашивания и монтажа , Перед началом последние шаги в процедуре иммуногистохимии, подготовить стиральные буферов и разоблачающий раствора антигена (см отдельные детали материала). Подготовьте комплексное решение ABC, по крайней мере за 30 минут до использования.
- фиксация
НЕТТЕ: В конце культуре в пробирке, устранить пятна следующим образом:- Подготовьте пробирки Эппендорф 1 мл 4% буферном растворе формальдегида (PFA) (Внимание:. Формальдегид токсичен ознакомьтесь паспорт по технике, прежде чем работать с этим химикатом Надевайте перчатки и защитные очки и приготовления раствора внутри вытяжного шкафа.).
- Передача каждого из коллагеновых пластырей в пробирку Эппендорф, содержащего 4% PFA. Устранить в течение ночи при комнатной температуре.
- Место образцы в 70% этаноле в течение длительного хранения при температуре 4 ° С. Образцы теперь готовы для обезвоживания и вложение в парафиновые блоки, прежде чем секционирования.
- Регидратация
- Поместите слайды в окрашивания банку с X-TRA SOLV в течение 15 мин. Повторите с помощью нового окрашивания банку с X-тра SOLV. Поместите слайды в окрашивания банку с абсолютным этанолом в течение 10 мин. Повторите с помощью нового окрашивания банку с абсолютным этанолом. Поместите слайды в окрашивания банку с 95% -ным этанолом в течение 10 мин, а после этогов сосуд для окрашивания с 70% этанола в течение 10 мин. Наконец мыть слайды дважды в течение 5 мин с дистиллированной водой.
- Антиген Разоблачение
- Поместите слайды в баночке Коплин с ТЕ-растворе и положить банку в водяной бане до кипения в течение 20 мин. Возьмем баночку из водяной бане тщательно. Охладить слайды до комнатной температуры в течение 30 мин и мыть дважды в течение 5 мин в буфере Трис. Поместите слайды в окрашивания банку с 3% -ной перекиси водорода в течение 10 мин. Промыть слайды дважды в течение 5 мин в буфере Трис. Нарисуйте круг вокруг образцов с использованием водоотталкивающими маркером.
- Блок неспецифическое связывание антитела с использованием 100-300 мкл блокирующего раствора. Удалите блокирующий раствор и добавьте 100-300 мкл первичного антитела, растворенного в рекомендуемой концентрации в Трис-буфере. Выдержите в течение ночи. Удалить раствор антител и мыть секций в трис-буфере в два раза в течение 5 мин.
- Инкубируйте с вторичными антителами в течение 1 ч при комнатной TEMPERATЮр. Промыть два раза в течение 5 мин в буфере Трис. Выдержите 30 минут с использованием набора ABC Elite (следовать инструкциям производителя). Промыть два раза в Трис-буфере.
- Разработка антитела реакцию с помощью VIP Kit вектор, следуя инструкциям производителя (1-7 мин инкубации обычно производит четкое интенсивность фиолетового). Поместите слайды в дистиллированной воде. Контрастное гематоксилином Майера в течение 30 сек.
- Промыть в проточной воде в течение 5 мин. Поместите слайды в окрашивания банку с 70% этанола в течение 1 мин. Повторите с помощью нового окрашивания банку с 70% этанола. Поместите слайды в окрашивания банку с 95% этанола в течение 1 мин. Повторите с помощью нового окрашивания банку с 95% этанола.
- Поместите слайды в окрашивания банку с X-TRA SOLV в течение 5 мин. Удалить, по одному за раз, чтобы сохранить влажный. Поместите каплю монтажа среды на верхней части каждого слайда и положить покровное стекло сверху (сделать это осторожно, чтобы избежать воздушных пузырей). Пусть слайды высохнуть в течение ночи и просматривать слайды под микрообъем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Это исследование представляет собой метод, который показывает, как производить биоматериал для трансплантации с использованием пластиковой сжатие коллагена и измельченной ткани.
Слизистой оболочки мочевого пузыря и кожи могут быть собраны, а затем механически измельчали на мелкие частицы (рисунок 3). По пластиковой сжатия, фарш частицы включены в композитной эшафот, состоящей из расположенной в центре биоразлагаемого полимера, который механически прочным пределах внешних слоев геля коллагена (Рисунок 4). Измельченные частицы ткани могут быть отделены, чтобы позволить 1: скорость расширения 6. По отжав содержание воды в коллагене, A biotransplant для аутологичных реконструктивной хирургии завершен.
Biotransplants может быть использован для аутотрансплантации животному для исследований в естественных условиях исследовательских или культивируют в обычной среде для культивирования клеток для дальнейших исследований в пробирке.
Т он композитный аутотрансплантата позволяет захвата и ушивание и поддерживает хирургического обработку (рисунок 5). Процесс от сбора урожая ткани и приготовления клеточной содержащих аутотрансплантатом для реконструктивной хирургии занимает примерно 20 мин и направлена быть выполнены как единое поставленное процедуры.
В исследованиях в пробирке клетки мигрируют, расширить и реорганизовать к поверхности аутотрансплантата в непрерывный слой одноклеточного в течение двух недель. После четырех недель, непрерывный эпителий толщиной приблизительно 4 клеточные слои (рис.6). Иммуногистохимия в различных точках во времени показывает, что клетки пролиферируют, мигрируют, и реорганизовать в непрерывный эпителия с микроархитектуры типичной для фенотипа клеток. Те же результаты применимы для аутотрансплантатов с рубленой кожи эпителия как для фарша слизистой оболочки мочевого пузыря.
1 / 53061fig3.jpg "/>
Рисунок 3:. Фарш подготовки ткани и пластика сжатия Получение слизистой оболочки мочевого пузыря (А) для измельчения (С) и пластиковой сжатия (D - F), используя устройство мясорубки в (B) и пресс-формы в (D) с получением 420-мкм толщиной трансплантации (Н). Следует отметить, что само по себе коллаген является хорошим внеклеточный матрикс, но трудно обрабатывать механически (G); путем размещения биоразлагаемый материал в качестве армирующего сердечника, пересадка становится легко понять (H).
Рисунок 4: пластик сжатия мультика, показывающая процесс пластической сжатия с рублеными частиц..
Рисунок 5:. Хирургическое обработки Полная толщина кожи модель рана на крысиной демонстрирующее зашивается пластиком сжатый биоматериала с рубленым кожи для аутотрансплантации, помеченный как T (пересаживают аутотрансплантатом) ушивают биоматериала без фарша кожи, помеченный как S (мнимого). В этом случае, фарш эпителий кожи пересадили на 1: 3 скорости расширения.
Рисунок 6: Иммуногистохимическое окрашивание визуализировать прогрессирование 3D культуры в коллаген-биоматериал фарш кожи и мочевого пузыря слизистой (А - Д) гематоксилин / эозином (А) родной коже, (B) родной мочевого пузыря, (С) фарш. кожа после 5 недель в культуре и (D) рубленого пузыря после 6 недель в культуре. Выражение эпителиальных и распространения маркеров с MNF116 (Е) и Ki 67 антител (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Это исследование представляет собой простой в использовании подход к производству стенки мочевого пузыря пластырей с аутологичной ткани для трансплантации в хирургическом столе. Пластыри образованы комбинацией биоразлагаемого полимера вязания в середине и коллагена с и без фарша ткани в наружных поверхностях в сочетании с пластиковой сжатия. Пластиковые сжатия является способ, ранее описаны другими авторами и могут быть определены как быстрое изгнание жидкости из коллагеновых гелей 12,13. Фарш ткань слизистой оболочки мочевого пузыря или кожи высевали в этом помосте и формирование мочевого пузыря или кожи эпителия может последовать в течение 6 недель. Иммуногистохимическое анализ показал образование эквивалентов характерных нормальной ткани. Эти результаты позволяют не только модель в пробирке для изучения реэпителизации и заживление ран, но также формирует биоматериал для трансплантации аутологичных тканей. Самое главное для целей урологии, то автografts могут быть использованы для приложений в естественных условиях тканевой инженерии в реконструктивной урологии как сконструированных пластырей аутологичных тканей без необходимости культуры в пробирке перед трансплантацией 11.
В отношении расширения клеток и в пробирке методами культивирования эпителия кожи и uroepithelium общие характеристики. Мотив представить методику пластической сжатия и измельчения для обоих эпителиальных тканей в этом исследовании было то, что заготовка и в естественных условиях исследования для эпителия кожи легче, чем для uroepithelium мочевого пузыря. С помощью этих средств, биоматериалы и эпителий кожи могут быть изучены в качестве первого шага, чтобы подтвердить биосовместимость и физические свойства перед выполнением более инвазивных исследований в мочеполовых органах.
В Предыдущее в естественных условиях исследования, используя концепцию фарша ткани с слизистой оболочки мочевого пузыря для регенерации ткани трубопроводов, результаты были, что гое маленькие пересаженные частицы требуется некоторое механическую поддержку для того, чтобы выдерживать механическую травму и оставаться на месте в течение начального дубля трансплантированных рублеными частиц и во время процесса заживления и регенерации тканей 6,7.
Для того чтобы преодолеть эти недостатки, исследование направлено на развитие гибридной конструкции с биоразлагаемого ядро полимерной трикотажа и пластической сжатые коллагена 11,14. Коллаген обеспечивает благоприятную поверхность для прикрепления клеток и роста и позволяет осуществлять прямую и быструю интеграцию фарша ткани в эшафот. Однако, поскольку механические свойства коллагена, даже после пластической сжатия, все еще слабы и не выдержали бы схватки и расширения движений природных мочевого пузыря, был добавлен вспомогательный сердечник каркас для коллагена. Для более сложных структур, пересаживают ткань может быть расширена вокруг сборного кристаллизатора для получения трехмерного ерithelialized структура с центральным просветом.
В этих исследованиях мы использовали PCL в качестве стабилизирующего полимера и сердцевины biograft. PCL широко используется в различных биомедицинских устройствах, таких как зубные пломбы, рассасывающихся синтетических хирургических сеток и шовных материалов 14. Для того, чтобы закупать созревание регенерированного ткани, т.е. иннервации, гладкой мышечной ткани и внеклеточного матрикса, мы выбрали PCL полимера с низкой скоростью деградации в течение нескольких месяцев. Тем не менее, скорость разложения может регулироваться по выбору полимера, толщины и плотности 11,16.
Коллаген был выбран в качестве компонента составного конструкции вследствие известной биосовместимостью, безопасности и хороших целебными свойствами. Коллагена способствует врастанию грануляционной ткани, повторное моделирование и созревания внеклеточного матрикса 15. Как коллаген деградирует, образование новых сосудов и грануляционной ткани поддерживает трансплантатред фарш частицы, которые реорганизовать, миграции и расширения 5-7,11,16. Кроме того, коллаген является одним из основных естественный компонент внеклеточного матрикса как в коже, так и в мочевом пузыре и была использована для создания каркасов в пробирке и в естественных условиях, включая заживления ран исследований и реконструкций в мочеполовой системе 17,18.
Критические шаги в протоколе легко управляемым. Во-первых, биоптаты должны храниться во влажных и благоприятных условиях до введения в трансплантации или роста еще клеток будет отложен или отсутствует. Вторая ловушка может включать получение права монолитность коллагена. Надо убедиться, что коллаген становится жесткой при подготовке аутотрансплантата, избегая пузырьков внутри геля коллагена. Пузыри избежать путем пипетирования и небольшие пузырьки можно разрушалось с иглой. Коллаген с пузырьками должны быть отброшены.
ЭтоРБП важно получить правильный размер фарша ткани; Перед мясорубки ткани, чтобы убедиться, что только тонкий слизистой оболочки мочевого пузыря используется в случаях расширения мочевого пузыря или только эпидермиса в случаях расширения кожи. Прошлом недостатком является то, когда ушивание: убедитесь, чтобы переместить перпендикулярно пересадки с иглой для того, чтобы избежать разделения различных слоев. Края аутотрансплантата также должны быть обработаны тщательно, чтобы не отделить коллаген из полимера. После наложения швов листов будет труднее отделить. Эти общие проблемы, которые могут возникнуть при изучении техники.
Одним из ограничений этого метода является то, что клетки в фарш частиц полагаются на диффузии питательных веществ и кислорода. Поэтому толщина аутотрансплантата должен быть менее 1 мм и должен быть помещен в хорошо развитую сосудистую сеть сайта. Это может быть недостатком из-за риска утечки мочи через пересаженной части мочевого пузыря. В зависимости от PlastСжатие IC, различные константы проницаемости может быть достигнуто. В нашем случае значение гидравлическую проницаемость (К) 0,034 соответствии с предыдущими исследованиями 19. В клинических условиях мы ожидаем, что мы должны были бы держать мочевой пузырь пустой с катетерами в течение примерно 1-2 недель, чтобы дать время для уротелиальных клеток выстроить многоуровневую непрерывную уротелия, которые делают патч не-проницаемой, прежде чем активный использовать.
Другим ограничением является предположение о здоровом органе для урожая ткани и расширения. В более тяжелых случаях, когда мочевой пузырь отсутствует или непригодным для расширения, например, при воздействии рака, метод может не подходить.
Что касается других тканей инженерии конструкций клеточных, окончательные выводы о функциональных и морфологических результатов можно ответить только в долгосрочной перспективе в естественных условиях исследования. Наш следующий шаг будет заключаться в анализе наших результатов в долгосрочных исследованиях на животных по отношению к viability и физиологические характеристики после трансплантации.
Значимость представленной методики является возможность расширения ткани в живом организме после только одной хирургической процедуры. Другие методы в настоящее время оценивается все зависит от расширения клеток в пробирке перед трансплантацией. Процедуры в пробирке имеют оборотную сторону, связаны с высокими затратами, требуя передовые лабораторный персонал, и, будучи много времени. Это может занять до 2-х месяцев между заготовкой ткани или клеток и аутотрансплантатом тканевой инженерии; в отличие от менее 1 часа, в соответствии с методикой, описанной в данном исследовании.
В будущем, измельченной ткани в прессованные методов коллагеновых может быть расширена и использована в других органах, таких как брюшной дефекты стен, диафрагмальными грыж и других условий, когда дефект не легко реконструированных с существующей ткани.
расширяться в естественных условиях. Порядок подготовки аутотрансплантата легко сделать и может быть использован в стерильных условиях в обычном хирургических вмешательствах. Аутотрансплантата сопротивляется хирургического обработку и биологическому разложению. Ядро аутотрансплантата может состоять из различных биоразлагаемых полимеров в зависимости от предпочтений, касающихся скорость деградации и другие характеристики, такие как эластичность, толщина и пористость, и в соответствии с конкретными потребностями пациента. В клинических условиях, пациент будет проходить урожай ткани, подготовку сводного аутотрансплантатом и аутотрансплантации как одноступенчатую процедуру. Кроме того, все части клеточных содержащие bioconstructs в настоящее время одобрены FDA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicone catheter 10-French | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| DMEM 10x | Gibco | 31885-023 | Plastic compression section 4 |
| 24 well plates | Falcon | 08-772-1 | Plastic compression section 4 |
| 3',3',5-Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | IRMM469 | In vitro culture; Section 5 |
| 4% PFA | Labmed Solutions | 200-001-8 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| 70% ethanol | Histolab | Immunocytochemistry; Section 6 | |
| ABC Elite kit: Biotin-Streptavidin detection kit | Vector | PK6102 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Absolute ethanol | Histolab | 1399.01 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A8626 | In vitro culture; Section 5 |
| Atropine 25 μg/kg | Temgesic, RB Pharmaceuticals, Great Britain | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Azaperone 2 mg/kg | Stresnil, Janssen-Cilag, Pharma, Austria | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Biosafety Level 2 hood | Plastic compression; Section 4 | ||
| Blocking solution: Normal serum from the same species as the secondary secondary antibody was generated in. | Vector | The blocking solution depends of the origin of first antibody | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Buprenorphine 45 μg/kg | Atropin, Mylan Inc, Canonsburg, PA | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Carprofen 3 mg/kg | Rimadyl, Orion Pharma, Sweden | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Chlorhexidine gluconate | Hibiscrub 40 mg/mL, Regent Medical, England | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | In vitro culture; Section 5 |
| Coplin jar: staining jar for boiling | Histolab | 6150 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Stainless mold (33 mm x 22 mm x 10 mm) custom made | Plastic compression; Section 4 | ||
| DMEM | Gibco | 3188-5023 | Plastic compression section 4. Keep on ice when using it in plastic compression |
| Epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E9644 | In vitro culture; Section 5 |
| Ethilon (non-absorbable monofilament for skin sutures) | Ethicon | Surgery, Section 1 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10437-036 | Plastic compression section 4 |
| Forceps (Adison with tooth) | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Gauze (Gazin Mullkompresse) | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Ham's F12 | Gibco | 31765-027 | Plastic compression section 4 |
| Hematoxylin | Histolab | 1820 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Humidity chamber | DALAB | Immunocytochemistry; Section 6 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | In vitro culture; Section 5 |
| Hydrogen peroxide Solution 30% | Sigma-Aldrich | H1009 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I3536 | In vitro culture; Section 5 |
| Isoflurane | Isoflurane, Baxter, Deerfield, IL | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Lidocaine 5 mg/ml | Xylocaine, AstraZeneca, Sweden | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Lucose 25 mg/ml | Baxter, Deerfield, IL | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Marker pen pap pen | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Medetomidine 25 μg/kg | Domitor, Orion Pharma, Sweden | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Mincing device | Applied Tissue Technologies LLC | Minced tissue preparation, section 2 | |
| Monocryl (absorbable monofilament) | Ethicon | Surgery, Section 1 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| NaOH 1 N | Merck Millipore | 106462 | Plastic compression section 4 and cell culture |
| Nylon mesh, 110 μM thick pore size 0.04 sqmm | Plastic compression; Section 4 | ||
| Oculentum simplex APL: ointment for eye protection | APL | Vnr 336164 | Surgery, Section 1 |
| PBS | Gibco | 14190-094 | Plastic compression section 4 |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Plastic compression section 4 |
| Phenobarbiturate 15 mg/kg | Pentobarbital, APL, Sweden | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| PCL Knitted fabric | Plastic compression; Section 4 | ||
| Rat-tail collagen | First LINK, Ltd, UK | 60-30-810 | Plastic compression section 4, keep on ice |
| Scalpel blade - 15 | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Shaving shears | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Stainless stell mesh, 400 μM thick pore size | Plastic compression; Section 4 | ||
| Steril gloves | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Sterile gowns | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Sterile drapes | |||
| Sterilium | Bode Chemie HAMBURG | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Suture Thread Ethilon | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| TE-solution (antigen unmasking solution) consist of 10 mM Tris and 1 mM EDTA, pH 9.0 | 10 mM Tris/1 mM EDTA, adjust pH to 9.0 | ||
| Tiletamine hypochloride 2.5 mg/kg | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | In vitro culture; Section 5 |
| Trizma Base, H2NC | Sigma-Aldrich | T6066 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Vector VIP kit: Enzyme peroxidase substrate kit | Vector | SK4600 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Vicryl (absorbable braded) | Ethicon | Surgery, Section 1 | |
| Tris buffer pH 7.6 (washing buffer) | TE solution: Make 10x (0.5 M Tris, 1.5 M NaCl) by mixing: 60.6 g Tris (Trizma Base, H2NC(CH2OH)3, M=121.14 g/mol), add 800 ml distilled water adjust the pH till 7.6, add 87.7 g NaCl and fill to 1,000 ml with distilled water. Dilute to 1x with distilled water. | ||
| X-tra solv (solvent) | DALAB | 41-5213-810 | Immunocytochemistry; Section 6. Use under fume hood |
| Zolazepam hypochloride | Zoletil, Virbac, France | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Depilatory wax strips | Veet | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Pentobarbital sodium | Lundbeck | Termination, Section 3 |
References
- Rheinwald, J. G., Green, H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell. 6, 331-343 (1975).
- Fossum, M., Nordenskjold, A., Kratz, G. Engineering of multilayered urinary tissue in vitro. Tissue Engineering. 10, 175-180 (2004).
- Salmikangas, P., et al. Manufacturing, characterization and control of cell-based medicinal products: challenging paradigms toward commercial use. Regen Med. 10, 65-78 (2015).
- Guidelines of 7 March 2013 on Good Distribution Practice of medicinal products for human use (OJ C 343/1, 23.11.2013). 7, Retrieved from: http://ec.europa.eu/health/human-use/good_distribution_practice/index_en.htm (2013).
- Fossum, M., et al. Minced skin for tissue engineering of epithelialized subcutaneous tunnels. Tissue Engineering. Part A. 15, 2085-2092 (2009).
- Fossum, M., et al. Minced urothelium to create epithelialized subcutaneous conduits. The Journal of Urology. 184, 757-761 (2010).
- Reinfeldt Engberg, G., Lundberg, J., Chamorro, C. L., Nordenskjold, A., Fossum, M. Transplantation of autologous minced bladder mucosa for a one-step reconstruction of a tissue engineered bladder conduit. BioMed Research International. 2013, 212734 (2013).
- Meek, C. P. Successful microdermagrafting using the Meek-Wall microdermatome. Am J Surg. 96, 557-558 (1958).
- Tanner, J. C., Vandeput, J., Olley, J. F. The Mesh skin graft. Plastic and Reconstructive Surgery. 34, 287-292 (1964).
- Svensjo, T., et al. Autologous skin transplantation: comparison of minced skin to other techniques. The Journal of Surgical Research. 103, 19-29 (2002).
- Ajalloueian, F., Zeiai, S., Rojas, R., Fossum, M., Hilborn, J. One-stage tissue engineering of bladder wall patches for an easy-to-use approach at the surgical table. Tissue Engineering. Part C, Methods. 19, 688-696 (2013).
- Engelhardt, E. M., et al. A collagen-poly(lactic acid-co-varepsilon-caprolactone) hybrid scaffold for bladder tissue regeneration. Biomaterials. 32, 3969-3976 (2011).
- Brown, R. A., Wiseman, M., Chuo, C. B., Cheema, U., Nazhat, S. N. Ultrarapid engineering of biomimetic materials and tissues: fabrication of nano- and microstructures by plastic compression. Adv Funct Mater. 15, 1762-1770 (2005).
- Fumagalli Romario, U., Puccetti, F., Elmore, U., Massaron, S., Rosati, R. Self-gripping mesh versus staple fixation in laparoscopic inguinal hernia repair: a prospective comparison. Surg Endosc. 27, 1798-1802 (2013).
- Muangman, P., et al. Complex Wound Management Utilizing an Artificial Dermal Matrix. Annals of Plastic Surgery. 57, 199-202 (2006).
- Ajalloueian, F., Zeiai, S., Fossum, M., Hilborn, J. G. Constructs of electrospun PLGA, compressed collagen and minced urothelium for minimally manipulated autologous bladder tissue expansion. Biomaterials. 35, 5741-5748 (2014).
- Orabi, H., AbouShwareb, T., Zhang, Y., Yoo, J. J., Atala, A. Cell-seeded tubularized scaffolds for reconstruction of long urethral defects: a preclinical study. Eur Urol. 63, 531-538 (2013).
- Blais, M., Parenteau-Bareil, R., Cadau, S., Berthod, F. Concise review: tissue-engineered skin and nerve regeneration in burn treatment. Stem Cells Transl Med. 2, 545-551 (2013).
- Serpooshan, V., Muja, N., Marelli, B., Nazhat, S. N. Fibroblast contractility and growth in plastic compressed collagen gel scaffolds with microstructures correlated with hydraulic permeability. J Biomed Mater Res A. 96, 609-620 (2011).
