Summary
A engenharia de tecidos muitas vezes inclui expansão in vitro, a fim de criar auto-enxertos para regeneração de tecidos. Neste estudo, um método para a expansão do tecido, a regeneração, e a reconstrução in vivo, foi desenvolvida de modo a minimizar o processamento de materiais biológicos e as células fora do corpo.
Introduction
A maioria dos estudos de engenharia de tecidos de transplante da pele e do tracto urogenital incluem colheitas de células autólogas a partir de tecido saudável e a expansão das células em instalações de cultura de células especialmente equipados 1,2.
Após a expansão das células, as células são geralmente armazenadas para utilização posterior quando o paciente está preparado para receber o auto-enxerto. congeladores de azoto permitir o armazenamento a longo prazo a baixas temperaturas de -150 ° C ou inferior. O processo de congelamento deve ser cuidadosa e controlada, a fim de não perder as células. Um risco de morte celular é a cristalização da água intracelular durante o processo de descongelamento, o que pode levar à ruptura das membranas celulares. congelação das células é normalmente realizada por arrefecimento lento e controlado (-1 ° C por minuto), utilizando uma concentração elevada de células, soro fetal de bovino, e sulfóxido de dimetilo. Após descongelação, as células têm de ser processado de novo por remoção do meio de congelamento e cultura em plástico de cultura de células ou umbiomateriais antes da transplantação de volta para o paciente.
Todos os passos mencionados acima são demorado, laborioso, dispendioso e 3. Além disso, todo o processamento in vitro de células destinados a transplante do paciente são altamente regulamentado e exige pessoal e laboratórios 4 bem treinados e credenciados. Ao todo, de obter um processo de fabricação segura e confiável, a técnica só poderia ser criada em um número muito pequeno de centros tecnicamente avançados e uma utilização mais ampla em transtornos cirúrgicos comuns é duvidosa.
A fim de superar as limitações de cultura de células em ambiente de laboratório, o conceito de transplante de tecido moído para a expansão de células in vivo é introduzido usando o próprio corpo como um biorreactor. Para estes fins, os autoenxertos seria de preferência, ser transplantadas em um molde 3D de acordo com a forma que é necessária para a reconstrução final do órgão de interest 5-7.
Originalmente, a idéia de transplantar epitélio picada foi apresentado por Meek em 1958, quando ele descreveu como epitélio cresce a partir das bordas de uma ferida. Ele demonstrou que um pequeno pedaço de pele iria aumentar as suas margens e, assim, o seu potencial para a expansão de células em 100% por corte da peça duas vezes em direcções perpendiculares (Figura 1) 8. A teoria tem sido apoiada pelo uso de enxertos de pele de espessura parcial em malha para o transplante de pele 9 e na pele ferida modelos 10 de cura.
Figura 1:. Teoria Meek De acordo com a teoria de Meek, epitélio cresce a partir das bordas de uma ferida. Ao aumentar a área exposta pela tecnologia de picagem, tecido moído epithelializes feridas de vários pontos.
O presente estudo é baseado no hipotese de que o mesmo princípio pode ser aplicado ao tecido subcutâneo, colocando epitélio picada em torno de um molde. As células epiteliais que mobilizar de transplantes de picada (reorganizar), cobrir as áreas de feridas (migrar) e divisão (expansão), a fim de formar um neoepithelium contínua que cobre a área da ferida e separa o corpo estranho (o molde) do corpo interior ( Figura 2).
Figura 2:. Dos desenhos animados de um molde 3D com epitélio picada para a expansão de tecidos in vivo intracorporal de acordo com a teoria de Meek Usando tecido moído colocado sobre um molde e, em seguida transplantadas para o tecido subcutâneo, a hipótese é a de que as células epiteliais migrar a partir da bordos do tecido moído, reorganizar, e expandir de modo a formar um neoepithelium contínua que cobre a área da ferida e separa o corpo estranho (o molde) a partir do corpo interior.
Embora estudos anteriores in vivo mostram resultados promissores, mais melhorias poderia ser alcançado através do reforço da auto-enxertos para que o epitélio regenerado poderia suportar trauma mecânico melhor 7. Para esses fins, foram identificados requisitos importantes para um biomaterial de sucesso, tais como: fácil difusão de nutrientes e produtos residuais, possibilidade de molde de uma maneira 3D e facilidade de manipulação cirúrgica. Conclusões foram feitas que essas necessidades podem ser satisfeitas através da adição de um biomaterial compósito para o tecido moído.
O presente estudo visa o desenvolvimento de um andaime composta de tecido picada em colágeno plástico de comprimido contendo um núcleo de reforço de um tecido biodegradável. Por estes meios, as células viáveis pode migrar das partículas O tecido triturado e proliferar com características morfológicas características originais do epitélio (pele ou urotélio). Utilização de compressão de plástico, o andaime foi reduzird em tamanho de 1 cm a cerca de 420 uM como as partículas foram picados envolto em colagénio da camada superior. O pano de núcleo pode ser qualquer polímero, mas precisa ser modificado com uma superfície hidrófila de modo a interligar com a cobertura 11 camadas de colagénio.
O método forneceu um andaime integridade melhorada através da incorporação de uma malha tricotada que consiste em poli (ε-caprolactona) (PCL) no prazo de dois géis de colagénio de plástico comprimida usando-o como um andaime para a cultura de mucosa da bexiga picada ou picada da pele de porcos. A construção foi mantida em condições de cultura de células durante até 6 semanas in vitro, demonstrando a formação bem sucedida de um estratificado em camadas múltiplas urotélio ou epitélio escamoso da pele no topo de uma construção híbrida bem consolidada. O constructo foi fácil de manusear e pode ser suturado no lugar para fins de aumento de bexiga ou recobrimento de defeitos da pele. Todas as partes do andaime de tecido são aprovados pela FDA ea técnicapoderia ser usado para procedimentos de estágio único pela colheita de tecidos, picagem, compactação de plástico, e transplante de volta para o paciente como uma intervenção single-encenado. O procedimento pode ser realizado para a expansão do tecido e reconstrução em condições estéreis em qualquer unidade de cirurgia geral.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os protocolos de animais foram pré-aprovados pelo Comitê County a Estocolmo em animais e todos os procedimentos conformes com os regulamentos para o uso de animais, bem como leis federais relevantes.
1. Procedimentos de Animais
- Preparando o animal para a cirurgia
- Preparar a mesa cirúrgica com todos os materiais e instrumentos necessários para a operação em condições de esterilidade. Realizar a cirurgia exclusivamente sob condições estéreis, para reduzir o risco de infecção e optimizar as condições de sobrevivência em cirurgia.
- Jejuar o animal durante 12 horas antes da cirurgia e medir o seu peso. Administrar uma injecção intramuscular de azaperona (2 mg / kg) para a pré-medicação. Anestesiar o animal com injecções intramusculares de hipoclorito de tiletamina (2,5 mg / kg), hipoclorito de zolazepam (2,5 mg / kg), medetomidina (25 ug / kg) e atropina (25 mg / kg).
- Injectar phenobarbiturate (15 mg / kg) antes da endotracheal intubação e continuar anestesia geral com 0,8% -2% de isoflurano. Inserir um cateter na veia periférica de um ouvido e infundir glucose (25 mg / ml) por via intravenosa durante o procedimento para manter o bem-estar do animal.
- Coloque monitorar dispositivos na orelha ou da cauda para verificar a temperatura, pressão arterial, saturação e pulso periférico. anestesia controle por estimulação dor de ouvidos ou cascos. Aplicar pomada para os olhos para evitar a secura e sob anestesia.
- Excisão de bexiga biópsia Specimen
- Cateterize da bexiga usando um cateter de silicone 10-French através da introdução de um espéculo para visualizar a uretra e inserir o cateter através da uretra e na bexiga urinária de esvaziar a urina em condições de semi-esterilidade. Encher a bexiga com solução salina estéril a uma pressão de 20-25 cm de H2O, a cerca de 100-300 mL, e depois esvaziar a 20 cm de H 2 O (aprox. 8 mL / kg de peso corporal).
- com the porco cuidadosamente virou-se para uma posição lateral, realizar uma esterilização pré-operatória de base da pele com aplicação de gluconato de clorexidina. Aplicar uma placa diathermy para o ombro após a remoção da pelagem com tesouras de corte.
- Vire o porco cuidadosamente em decúbito dorsal e remover a pelagem abdominal usando tesouras para maquiagem e fazer uma esterilização pré-operatório básico da pele abdominal com a aplicação de gluconato de clorexidina.
- Incorporar as extremidades com o vestuário suave para minimizar o risco de danos para a hiperextensão das articulações nas extremidades. Esterilizar a pele abdominal do animal com aplicações sucessivas de gluconato de clorexidina e colocar drapeados esterilizada em torno do campo cirúrgico.
- Antes da incisão da pele, aplicar um analgésico que consiste intravenosa de buprenorfina (45 ug / kg), o carprofeno (3 mg / kg) e a injecção local de lidocaína na linha média abaixo do umbigo. Verifique se há reação de dor, segurando o skna com uma pinça. Faça uma incisão na linha média inferior através da fáscia e peritoneu utilizando diathermy para controle de sangramento. Localizar a bexiga, que tem uma posição totalmente intraperitoneal no porco e pode ser livremente exposto através da mobilização de que através da ferida cirúrgica.
- Ter de segurar a bexiga com a pinça e medir com uma fita métrica esterilizado e marcar uma forma de elípticas biópsia aproximadamente 2 cm no sentido longitudinal e 1 cm transversalmente, ou menor, usando uma caneta esterilizado (o porco tolera uma redução trimestre de tamanho da bexiga muito bem). Extirpar da área marcada, usando um bisturi, e coloque a partir de biópsia da bexiga em DMEM em condições estéreis.
- Execute autotransplante com a BioTransplant ou fechar a bexiga suturando-o com 5-0 Vicryl em duas camadas. Feche a fáscia abdominal cuidado com 2-0 ou 3-0 correndo Vicryl. Feche o tecido subcutâneo com Vicryl 3-0 ea pele com 3-0 Ethilon. Coloque um curativo na ferida e cuidadosamente comtendem para o animal até que tenha recuperado suficientemente da anestesia e não expressa a dor.
- Mover o animal para a instalação de cuidados com animais para garantir condições para cuidados pós-operatórios. Coloque o animal em uma única gaiola com uma lâmpada de aquecimento e assistir ao animal até a recuperação total da anestesia e, em seguida, deixar que os animais ser parado em pares.
- Fornecer uma recuperação sem intercorrências em relação à dor e bem-estar e administrar buprenorfina (45 mg / kg) por via intramuscular para analgesia pós-operatória e trimetoprim (4 mg / kg) e sulfonamida (20 mg / kg) duas vezes ao dia por três dias e uma vez por dia durante cinco dias para reduzir o risco de infecções pós-operatórias.
- Excisão de pele Biópsia Specimen
- Prepare a mesa cirúrgica com todos os materiais necessários. Anestesiar o animal, tal como anteriormente descrito em 1.1. Remova a pelagem usando cera, lavar e esterilizar a área da incisão com betadine e álcool 70% e, em seguida, colocar drapeados estéril around área da incisão.
- Use um dermátomo para colher um 0,3 mm de espessura parcial biópsia da pele. Coloque a amostra de pele em DMEM antes da picagem, conforme descrito em 2.2. Cobrir a área da ferida com unguento gordo, e um curativo.
2. Picada Preparação de tecidos
- bexiga Mucosa
- Lava-se a biópsia da bexiga duas vezes em DMEM. Coloque as amostras de biópsia da bexiga para uma placa de dissecação esterilizado com a mucosa virada para cima e fixar um dos lados para a placa utilizando uma dissecção dos pinos.
- Separa-se o tecido da mucosa do músculo detrusor utilizando uma tesoura fina e uma pinça (Figura 3) e manter a mucosa húmida por gotejamento de solução salina ou DMEM sobre ele.
- Usar o dispositivo de picar, colocando-o sobre a mucosa e, em seguida, passar o dispositivo de uma ponta à outra verticalmente e horizontalmente, aplicando uma pressão manual para se obter peças de tecido picada de 0,8 mm x 0,8 milímetros (0,8 mm é a distância entre a rotação dg lâminas de corte).
- Pele
- Se o Biopsis pele são grossos: colocar a pele em um prato de dissecação estéril e usar uma tesoura cirúrgica para separar a epiderme de gordura subcutânea e derme. A epiderme é fina e translúcida (aprox. 0,3 milímetros) quando ele está pronto para picagem.
- Use o dispositivo picagem, colocando-o sobre a epiderme. Com a pressão, o dispositivo de passar de um lado para o outro na vertical e na horizontal para se obter peças de tecido picada de 0,8 mm x 0,8 milímetros.
3. Preparação de plásticos comprimidos PCL / colágeno Autoenxertos
- Coloque todos os ingredientes em gelo para manter frio. Utensílios necessários: tubo Falcon, 10x DMEM, 1x DMEM, NaOH 1 N e cauda de rato colágeno tipo 1.
- Misturar 2 ml de 10x DMEM (com cuidado para evitar bolhas de ar) com 12 ml de colagénio do tipo 1. Adicionar NaOH 1 N, gota a gota, para levar o pH até 7,4-8 (cor no meio deve indicar o pH ao passar de intensa amarelo ao pinok). Além disso, use uma faixa de pH.
- Adiciona-se cuidadosamente 2 ml de 1x DMEM e misturar a solução. Placa de aproximadamente 2 ml de colagénio em cada cavidade do molde de aço rectangular (20x30x10 mm) e incuba-se a 37 ° C em 5% de CO 2 durante 10 min.
NOTA: A concentração de colagénio deve ser de 2,06 mg / ml em ácido acético 0,6% e a quantidade de colagénio de 1 ml / cm2. - Uma vez que o colagénio define no interior do molde, colocar o biomaterial (PCL) no topo do gel de colagénio (20 mm x 30 mm) e despeje o restante colagénio (cerca de 6 ml) em cima dela. Incubar a 37 ° C em 5% de CO 2 durante 20 min.
- Colocar o tecido moído (para 1: 6 de expansão) na parte superior do gel de colagénio. Pressione a água para fora da construção pela força mecânica usando compressão de plástico como se segue (Figuras 3 e 4).
- Coloque uma espessa camada de gaze esterilizada sobre uma superfície. Coloque uma malha de aço inoxidável (400 mm de espessura) sobre o topo de Gauze almofadas e, em seguida, uma folha de nylon mesh (110 um de espessura). Transferir cuidadosamente o / tecido picada gel de colágeno para a malha de nylon e remova cuidadosamente o molde de aço retangular.
- Colocar uma nova camada de malha de nylon no topo do gel de colagénio / tecido moído. Colocar uma segunda malha de aço por cima da malha de nylon. Colocar em posição a placa de pressão ou de carga pesando um mínimo de 120 g (ou seja, uma placa de vidro) durante 5 min.
- Retirar as malhas de peso, nylon e aço. Os auto-enxertos está agora pronto para ser suturado à bexiga de porco nas feridas de espessura total de pele ou cultivadas in vitro.
- Por cultura in vitro, cortar o construto fino em pequenas peças de encaixe placas de 12 poços. Adicionar 1 ml de meio de queratinócitos. Colocar as placas na incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2 e a cultura até 6 semanas e mudar o meio 3 vezes por semana.
4. Sutura de Autoenxertos
- Sutura de auto-enxerto commucosa da bexiga picada para a bexiga de porco
- Mantenha o auto-enxerto úmida em DMEM durante o tempo de espera. Suturar o auto-enxerto com suturas running monofilamento finas. Use não absorvível 5-0 Ethilon para fins de pesquisa.
- Verifique se estanque através do preenchimento da bexiga com solução salina através do cateter vesical de demora. Se possível, cobrir a auto-enxerto com uma camada de omento maior. Fechar a parede abdominal, subcutâneo e pele, tal como descrito em 1.2.6. Aplique um curativo.
- Sutura do auto-enxerto com epiderme da pele picada a uma ferida de espessura total
- Mantenha o auto-enxerto úmida em DMEM durante o tempo de espera.
- Suturar o auto-enxerto para a parte inferior da pele de espessura total da ferida por sutura interrompida nos cantos e no centro de auto-enxerto para manter o auto-enxerto intimamente ligado à superfície subjacente.
- Cobrir a ferida com um curativo de plástico que mantém a ferida húmida.
- Sedar o animal com injeção intramuscular de hipoclorito de zolazepam (2,5 mg / kg) e medetomidina (25 ug / kg) antes da rescisão e aplicar dispositivos de monitorização à orelha ou da cauda para verificar se há pulso e pressão arterial.
- Eutanásia do animal por administração de uma dose letal de pentobarbital de sódio (60-140 mg / kg) por via intravenosa. Verificar o pulso e pressão arterial até que tenha ocorrido a morte.
6. Cultura Vitro Em
NOTA: Para avaliar histologicamente a progressão do tecido moído nas construções de PCL / colagénio in vitro, as colagénio / PCL / patches picadas são cultivadas em placas de 12 poços em meio de cultura de queratinócitos.
- Preparação de meio de queratinócitos:
- Esterilizar uma garrafa de vidro de 500 ml.
- Misturar 400 mL de DMEM com 100 ml de F12 de Ham (mistura a 4: 1). Suplemento com soro fetal bovino a 10%, 5 ug / ml de insulina,0,4 ug / ml de hidrocortisona, 21 ug / ml de adenina, 10 -10 mol / L a toxina da cólera, 2 x 10 -9 mol / L-tri-iodotironina, 5 ug / ml de transferrina, 10 ng / ml de factor de crescimento epidérmico, 50 U / ml de penicilina e 50 ug / ml de estreptomicina.
- Esterilizar por filtração através de um filtro de 0,2 ^ m e recolher o filtrado num frasco estéril de 500 ml.
7. Imuno-histoquímica
NOTA: O protocolo de imuno-histoquímica é geralmente dividida nas seguintes etapas: (1) a fixação e inclusão em parafina, (2) de micro-corte a 5 um fatias, a colocação em lâminas, desparafinagem, e re-hidratação, (3) antigénio de desmascaramento, a coloração e de montagem . Antes de iniciar os últimos passos no processo de imuno-histoquímica, preparar os buffers de lavagem e a solução desmascaramento antigénio (ver detalhes materiais separados). Preparar a solução complexa ABC, pelo menos, 30 min antes do uso.
- Fixação
NÃOTE: No final da cultura in vitro, corrigir as manchas como se segue:- Prepare tubos Eppendorf com 1 ml de formaldeído a 4% tamponada (PFA) (Atenção:. Formaldeído é tóxico Por favor, leia as fichas de dados de segurança do material antes de trabalhar com este produto químico Usar luvas e óculos de segurança e preparar a solução dentro de um exaustor.).
- Transferir cada um dos remendos de colagénio a um tubo Eppendorf contendo 4% de PFA. Corrigir durante a noite à temperatura ambiente.
- Colocar as amostras em etanol a 70% para armazenamento a longo prazo, a 4 ° C. As amostras estão agora prontos para a desidratação e incorporação em blocos de parafina antes do corte.
- reidratação
- Colocar as lâminas em uma tina de coloração com solv X-tra para 15 min. Repita usando uma nova tina de coloração com solv X-tra. Colocar as lâminas em uma tina de coloração com etanol absoluto durante 10 min. Repetir usando um novo frasco de coloração com etanol absoluto. Colocar as lâminas em uma tina de coloração com 95% de etanol para 10 min e, posteriormente,em um frasco de coloração com etanol a 70% durante 10 min. Finalmente lavar as lâminas duas vezes durante 5 min com água destilada.
- antígeno Unmasking
- Coloque os slides em um frasco Coplin com TE-solução e colocar o frasco num banho de água a ferver durante 20 minutos. Leve o frasco do banho de água com cuidado. Arrefecer as lâminas à temperatura ambiente durante 30 min e lava-se duas vezes durante 5 min em tampão Tris. Colocar as lâminas em uma tina de coloração com 3% de peróxido de hidrogênio para 10 min. Lavar as lâminas duas vezes durante 5 min em tampão Tris. Desenhar um círculo em torno das amostras usando uma pena de marcação repelente de água.
- Bloquear a ligação não específica do anticorpo com 100-300 ul de solução de bloqueio. Remover a solução de bloqueio e adicionar 100-300 uL de anticorpo primário dissolvido na concentração recomendada em tampão Tris. Incubar durante a noite. Remover a solução de anticorpos e lavar secções em tampão Tris duas vezes durante 5 min.
- Incubar com anticorpo secundário durante 1 h à temperat quartoure. Lavar duas vezes durante 5 min em tampão Tris. Incubar 30 min utilizando o kit ABC Elite (siga as instruções do fabricante). Lavar duas vezes em tampão Tris.
- Desenvolver reacção anticorpo utilizando o kit de vector VIP, seguindo as instruções do fabricante (1-7 minutos de incubação geralmente produz uma intensidade de cor violeta clara). Colocar as lâminas em água destilada. Contracoloração com hematoxilina de Mayer durante 30 segundos.
- Lavar em água corrente durante 5 min. Colocar as lâminas em uma tina de coloração com etanol 70% durante 1 min. Repetir usando um novo frasco de coloração com 70% de etanol. Colocar as lâminas em uma tina de coloração com 95% de etanol durante 1 min. Repetir usando um novo frasco de coloração com 95% de etanol.
- Colocar as lâminas em uma tina de coloração com solv X-tra por 5 min. Retirar, um de cada vez para manter úmido. Coloque uma gota de meio de montagem no topo de cada slide e colocar uma tampa de vidro no topo (fazê-lo com cuidado para evitar bolhas de ar). Deixe que as lâminas secar durante a noite e exibir slides sob um microescopo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Este estudo apresenta um método que mostra como produzir um biomaterial para transplante usando compressão de plástico de colágeno e tecido picada.
Mucosa da bexiga e da pele pode ser colhida e, em seguida, triturada mecanicamente em partículas pequenas (Figura 3). Por compressão de plástico, as partículas trituradas são incorporados dentro do andaime compósito composto por um polímero biodegradável colocado centralmente que é mecanicamente forte dentro de camadas exteriores de um gel de colagénio (Figura 4). O tecido triturado partículas podem ser separadas para permitir que uma mistura 1: taxa de expansão 6. Ao pressionar para fora o conteúdo de água do colagénio, um BioTransplant para cirurgia reconstrutiva autólogo está concluída.
Biotransplants pode ser usado para auto-transplante para o animal para estudos in vivo em investigação ou cultivadas num meio de cultura de células normais para estudos in vitro.
T ele auto-enxerto composto permite agarrar e sutura e sustenta a manipulação cirúrgica (Figura 5). O processo de colheita de tecidos e preparação do auto-enxerto contendo células para a cirurgia reconstrutiva leva aproximadamente 20 minutos e é destinada a ser realizado como um procedimento single-encenado.
Em estudos in vitro, as células migram, expandir e reorganizar à superfície de auto-enxerto numa camada contínua de uma única célula em duas semanas. Após quatro semanas, o epitélio contínua é de cerca de 4 camadas de células de espessura (Figura 6). A imuno-histoquímica em diferentes pontos no tempo, revela que as células proliferam, migram e reorganizar num epitélio contínua com um micro-arquitectura típica para o fenótipo da célula. Os mesmos resultados se aplicam para auto-enxertos, com o epitélio da pele picada como para a mucosa da bexiga picada.
1 / 53061fig3.jpg "/>
Figura 3:. Triturada preparação do tecido e a compressão de plástico A preparação de mucosa da bexiga (UM) para picagem (C) e compactação de plástico (D - F), utilizando o dispositivo de picagem em (B) e o molde em (D) para produzir um transplante de 420 mícrons de espessura (H). Note-se que o colagénio é em si uma boa matriz extracelular, mas é difícil de manusear mecanicamente (L); colocando um tecido biodegradável como um reforço do núcleo, o transplante torna-se fácil de agarrar (H).
Figura 4: A compressão de plástico a um desenho animado mostrando o processo de compressão de plástico com partículas picada..
Figura 5:. Tratamento cirúrgico modelo de espessura total pele ferida em um biomaterial plástico de comprimidos demonstrando rato suturada com a pele picada para autotransplante marcado como T (auto-enxerto transplantado) biomaterial suturada sem pele picada marcado como S (sham). Neste caso, picada epitélio da pele foi transplantado para uma mistura 1: 3 taxa de expansão.
Figura 6: marcação imuno-histoquímica para visualizar a progressão da cultura 3D na pele e bexiga picada mucosa colagénio-biomaterial (A - D) coloração de hematoxilina / eosina de (A) a pele nativa, (B) da bexiga nativo, (C) picada. pele após 5 semanas em cultura e (D) da bexiga picados após 6 semanas em cultura. A expressão de marcadores epiteliais e de proliferação com MNF116 (E) e Kl 67 anticorpos (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este estudo apresenta uma abordagem easy-to-use para produzir manchas de parede da bexiga com tecido autólogo para o transplante na mesa cirúrgica. As manchas são formados pela combinação de um tricô polímero biodegradável no meio e colagénio com e sem tecido moído nas superfícies exteriores em combinação com compressão de plástico. Compressão plástica é um método previamente descrito por outros autores e pode ser definido como uma expulsão rápida do fluido a partir de géis de colagénio 12,13. O tecido triturado de mucosa da bexiga ou da pele é semeada para este andaime e a formação de uma bexiga ou epitélio da pele pode ser seguido durante 6 semanas. As análises de imuno-histoquímica mostrou a formação de equivalentes características de tecido normal. Estes resultados permitem não só um modelo in vitro para estudar a re-epitelização e cicatrização de feridas, mas também constitui um biomaterial para o transplante autólogo de tecido. O mais importante para fins de urologia, o autografts pode ser utilizado para aplicações in vivo de engenharia de tecidos em urologia reconstrutiva como manchas de tecidos autólogos modificados, sem o requisito para a cultura in vitro antes da transplantação 11.
Em relação à expansão celular e em técnicas de cultivo in vitro, epitélio da pele e partilham características comuns uroepithelium. O motivo para apresentar a técnica de compressão de plástico e picagem para ambos os tecidos epiteliais neste estudo foi de que a colheita e estudos in vivo para o epitélio da pele é mais fácil do que para uroepithelium bexiga. Por este meio, biomateriais e epitélio da pele pode ser estudada como um primeiro passo para confirmar biocompatibilidade e propriedades físicas antes da realização dos estudos mais invasivos nos órgãos urogenitais.
Na anterior, em estudos in vivo, utilizando o conceito de tecido picada com mucosa da bexiga para a regeneração do tecido de condutas, as conclusões foram que the pequenas partículas transplantados necessário algum suporte mecânico para suportar trauma mecânico e para ficar no lugar durante a tomada inicial das partículas picadas transplantados e durante o processo de cicatrização e regeneração de tecidos 6,7.
A fim de superar essas deficiências, o estudo visa o desenvolvimento de um híbrido construir com um núcleo biodegradável de um tecido de malha de polímero e colágeno plástico comprimido 11,14. O colagénio proporciona uma superfície favorável para a fixação e crescimento das células e permite a integração directa e rápida do tecido moído no andaime. No entanto, uma vez que as propriedades mecânicas de colagénio, mesmo após a compressão de plástico, ainda são fracos e não iria manter as contracções e extensões dos movimentos naturais da bexiga, foi adicionado um núcleo de suporte de andaime para o colagénio. Para as estruturas mais complexas, o tecido transplantado pode ser expandido em torno de um molde pré-fabricado para produzir um EP tridimensionalestrutura ithelialized com um lúmen central.
Nestes estudos utilizou-se PCL como um polímero estabilizador e o núcleo do biograft. PCL é amplamente utilizado em uma variedade de dispositivos biomédicos, como obturações dentárias, malhas cirúrgicas sintéticas absorvíveis e materiais de sutura 14. A fim de obter a maturação do tecido regenerado, isto é, a inervação, tecido do músculo liso e matriz extra-celular, nós escolhemos um polímero PCL com uma taxa de degradação lenta ao longo de vários meses. No entanto, a taxa de degradação pode ser regulada por escolha do polímero, espessura e densidade de 11,16.
O colagénio foi escolhido como um componente da construção do compósito devido à biocompatibilidade bem conhecido, a segurança e boas características de cura. O colágeno promove o crescimento interno de tecido de granulação, re-modelação e maturação da matriz extra-celular 15. Como o colagénio é degradada, neovascularização e tecido de granulação suporta o transplanteed picada partículas que reorganizar, migrar e expandir 5-7,11,16. Além disso, o colagénio é um dos principais componentes naturais da matriz extracelular, tanto na pele e na bexiga e foi usado para a criação de andaimes, tanto in vitro e in vivo, incluindo estudos de cicatrização de feridas e reconstruções do sistema urogenital 17,18.
Os passos críticos no âmbito do protocolo são facilmente gerenciáveis. Em primeiro lugar, as amostras de biópsia devem ser mantidos sob condições de humidade e favoráveis antes da inserção no transplante ou crescimento celular mais vai ser atrasada ou ausente. A segunda armadilha pode envolver recebendo a solidez direita do colágeno. É preciso se certificar de que o colágeno torna-se rígida durante a preparação do auto-enxerto, evitando bolhas no interior do gel de colágeno. As bolhas são evitados por pipetagem cuidadosa e pequenas bolhas pode ser rompida com uma agulha. Colágeno com bolhas deve ser descartada.
É umlso importante para obter o tamanho certo do tecido picada; antes de picar o tecido, certifique-se que apenas a mucosa da bexiga fina é usado em casos de expansão bexiga ou apenas a epiderme em casos de expansão de pele. A armadilha é passado quando a sutura: certifique-se de que se movem perpendicularmente ao transplante com a agulha, a fim de evitar a separação das diferentes camadas. Bordas do auto-enxerto também precisam ser manuseados com cuidado para não separar o colagénio a partir do polímero. Depois de suturar as folhas serão mais difíceis de separar. Estes são problemas comuns que podem surgir quando aprender a técnica.
Uma limitação desta técnica é que as células em que as partículas trituradas depende da difusão de nutrientes e de oxigénio. Por conseguinte, a espessura da auto-enxerto tem de ser inferior a 1 mm e tem de ser colocado num local bem vascularizado. Isto pode ser uma desvantagem devido ao risco de fuga de urina através da parte transplantado da bexiga. Dependendo da PlastIC compressão, diferentes constantes de permeabilidade pode ser alcançado. No nosso caso, o valor de permeabilidade hidráulica (K) foi de 0,034 de acordo com estudos anteriores 19. Em um ambiente clínico prevemos que seria necessário para manter a bexiga vazia com cateteres durante cerca de 1-2 semanas, a fim de dar tempo para as células uroteliais para construir uma urothelium contínua multi-camadas que fazem o patch não-permeável antes ativa uso.
Outra limitação é a suposição de um órgão saudável para a colheita de tecidos e expansão. Nos casos mais graves quando a bexiga está faltando ou está imprópria para expansão, por exemplo, quando afetada pelo câncer, a técnica pode não ser adequado.
Quanto a outras estruturas celulares da engenharia de tecidos, as conclusões finais sobre os resultados funcionais e morfológicas só pode ser respondida no longo prazo estudos in vivo. Nosso próximo passo será analisar os resultados dos estudos em animais a longo prazo no que diz respeito à VIABility e características fisiológicas pós-transplante.
O significado da técnica apresentada é a possibilidade de expansão de tecido in vivo, após apenas um único procedimento cirúrgico. Outras técnicas actualmente a ser avaliados são todos dependentes de expansão das células in vitro antes do transplante. Os procedimentos in vitro têm a desvantagem de estarem associados a custos elevados, exigindo pessoal avançadas de laboratório, e ser demorado. Pode levar até 2 meses entre a colheita de tecidos ou células e uma auto-enxerto da engenharia de tecidos; em oposição a menos de 1 hora, de acordo com a técnica descrita neste estudo.
No futuro, o tecido triturado em técnicas de colagénio comprimido pode ser expandido e utilizado em outros órgãos, tais como defeitos de parede abdominal, hérnias do diafragma, e outras condições em que um defeito não é facilmente reconstituídas com o tecido existente.
in vivo. O procedimento para a preparação de um autoenxerto é fácil de fazer e pode ser usado sob condições estéreis num cenário cirúrgico comum. O auto-enxerto resiste a manipulação cirúrgica e é biodegradável. O núcleo de auto-enxerto pode ser composto por diferentes polímeros biodegradáveis, dependendo das preferências no que respeita à taxa de degradação e outras características, tais como a elasticidade, espessura e porosidade, e de acordo com as necessidades específicas do paciente. Em um ambiente clínico, o paciente sofreria colheita de tecidos, preparação de auto-enxerto composto e autotransplante como um processo de fase única. Além disso, todas as partes das bioconstructs contendo as células estão actualmente aprovado pela FDA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicone catheter 10-French | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| DMEM 10x | Gibco | 31885-023 | Plastic compression section 4 |
| 24 well plates | Falcon | 08-772-1 | Plastic compression section 4 |
| 3',3',5-Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | IRMM469 | In vitro culture; Section 5 |
| 4% PFA | Labmed Solutions | 200-001-8 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| 70% ethanol | Histolab | Immunocytochemistry; Section 6 | |
| ABC Elite kit: Biotin-Streptavidin detection kit | Vector | PK6102 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Absolute ethanol | Histolab | 1399.01 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A8626 | In vitro culture; Section 5 |
| Atropine 25 μg/kg | Temgesic, RB Pharmaceuticals, Great Britain | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Azaperone 2 mg/kg | Stresnil, Janssen-Cilag, Pharma, Austria | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Biosafety Level 2 hood | Plastic compression; Section 4 | ||
| Blocking solution: Normal serum from the same species as the secondary secondary antibody was generated in. | Vector | The blocking solution depends of the origin of first antibody | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Buprenorphine 45 μg/kg | Atropin, Mylan Inc, Canonsburg, PA | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Carprofen 3 mg/kg | Rimadyl, Orion Pharma, Sweden | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Chlorhexidine gluconate | Hibiscrub 40 mg/mL, Regent Medical, England | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | In vitro culture; Section 5 |
| Coplin jar: staining jar for boiling | Histolab | 6150 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Stainless mold (33 mm x 22 mm x 10 mm) custom made | Plastic compression; Section 4 | ||
| DMEM | Gibco | 3188-5023 | Plastic compression section 4. Keep on ice when using it in plastic compression |
| Epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E9644 | In vitro culture; Section 5 |
| Ethilon (non-absorbable monofilament for skin sutures) | Ethicon | Surgery, Section 1 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10437-036 | Plastic compression section 4 |
| Forceps (Adison with tooth) | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Gauze (Gazin Mullkompresse) | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Ham's F12 | Gibco | 31765-027 | Plastic compression section 4 |
| Hematoxylin | Histolab | 1820 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Humidity chamber | DALAB | Immunocytochemistry; Section 6 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | In vitro culture; Section 5 |
| Hydrogen peroxide Solution 30% | Sigma-Aldrich | H1009 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I3536 | In vitro culture; Section 5 |
| Isoflurane | Isoflurane, Baxter, Deerfield, IL | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Lidocaine 5 mg/ml | Xylocaine, AstraZeneca, Sweden | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Lucose 25 mg/ml | Baxter, Deerfield, IL | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Marker pen pap pen | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Medetomidine 25 μg/kg | Domitor, Orion Pharma, Sweden | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Mincing device | Applied Tissue Technologies LLC | Minced tissue preparation, section 2 | |
| Monocryl (absorbable monofilament) | Ethicon | Surgery, Section 1 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| NaOH 1 N | Merck Millipore | 106462 | Plastic compression section 4 and cell culture |
| Nylon mesh, 110 μM thick pore size 0.04 sqmm | Plastic compression; Section 4 | ||
| Oculentum simplex APL: ointment for eye protection | APL | Vnr 336164 | Surgery, Section 1 |
| PBS | Gibco | 14190-094 | Plastic compression section 4 |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Plastic compression section 4 |
| Phenobarbiturate 15 mg/kg | Pentobarbital, APL, Sweden | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| PCL Knitted fabric | Plastic compression; Section 4 | ||
| Rat-tail collagen | First LINK, Ltd, UK | 60-30-810 | Plastic compression section 4, keep on ice |
| Scalpel blade - 15 | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Shaving shears | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Stainless stell mesh, 400 μM thick pore size | Plastic compression; Section 4 | ||
| Steril gloves | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Sterile gowns | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Sterile drapes | |||
| Sterilium | Bode Chemie HAMBURG | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Suture Thread Ethilon | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| TE-solution (antigen unmasking solution) consist of 10 mM Tris and 1 mM EDTA, pH 9.0 | 10 mM Tris/1 mM EDTA, adjust pH to 9.0 | ||
| Tiletamine hypochloride 2.5 mg/kg | Preparing the animal for surgery, Section 1 | ||
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | In vitro culture; Section 5 |
| Trizma Base, H2NC | Sigma-Aldrich | T6066 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Vector VIP kit: Enzyme peroxidase substrate kit | Vector | SK4600 | Immunocytochemistry; Section 6 |
| Vicryl (absorbable braded) | Ethicon | Surgery, Section 1 | |
| Tris buffer pH 7.6 (washing buffer) | TE solution: Make 10x (0.5 M Tris, 1.5 M NaCl) by mixing: 60.6 g Tris (Trizma Base, H2NC(CH2OH)3, M=121.14 g/mol), add 800 ml distilled water adjust the pH till 7.6, add 87.7 g NaCl and fill to 1,000 ml with distilled water. Dilute to 1x with distilled water. | ||
| X-tra solv (solvent) | DALAB | 41-5213-810 | Immunocytochemistry; Section 6. Use under fume hood |
| Zolazepam hypochloride | Zoletil, Virbac, France | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Depilatory wax strips | Veet | Preparing the animal for surgery, Section 1 | |
| Pentobarbital sodium | Lundbeck | Termination, Section 3 |
References
- Rheinwald, J. G., Green, H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell. 6, 331-343 (1975).
- Fossum, M., Nordenskjold, A., Kratz, G. Engineering of multilayered urinary tissue in vitro. Tissue Engineering. 10, 175-180 (2004).
- Salmikangas, P., et al. Manufacturing, characterization and control of cell-based medicinal products: challenging paradigms toward commercial use. Regen Med. 10, 65-78 (2015).
- Guidelines of 7 March 2013 on Good Distribution Practice of medicinal products for human use (OJ C 343/1, 23.11.2013). 7, Retrieved from: http://ec.europa.eu/health/human-use/good_distribution_practice/index_en.htm (2013).
- Fossum, M., et al. Minced skin for tissue engineering of epithelialized subcutaneous tunnels. Tissue Engineering. Part A. 15, 2085-2092 (2009).
- Fossum, M., et al. Minced urothelium to create epithelialized subcutaneous conduits. The Journal of Urology. 184, 757-761 (2010).
- Reinfeldt Engberg, G., Lundberg, J., Chamorro, C. L., Nordenskjold, A., Fossum, M. Transplantation of autologous minced bladder mucosa for a one-step reconstruction of a tissue engineered bladder conduit. BioMed Research International. 2013, 212734 (2013).
- Meek, C. P. Successful microdermagrafting using the Meek-Wall microdermatome. Am J Surg. 96, 557-558 (1958).
- Tanner, J. C., Vandeput, J., Olley, J. F. The Mesh skin graft. Plastic and Reconstructive Surgery. 34, 287-292 (1964).
- Svensjo, T., et al. Autologous skin transplantation: comparison of minced skin to other techniques. The Journal of Surgical Research. 103, 19-29 (2002).
- Ajalloueian, F., Zeiai, S., Rojas, R., Fossum, M., Hilborn, J. One-stage tissue engineering of bladder wall patches for an easy-to-use approach at the surgical table. Tissue Engineering. Part C, Methods. 19, 688-696 (2013).
- Engelhardt, E. M., et al. A collagen-poly(lactic acid-co-varepsilon-caprolactone) hybrid scaffold for bladder tissue regeneration. Biomaterials. 32, 3969-3976 (2011).
- Brown, R. A., Wiseman, M., Chuo, C. B., Cheema, U., Nazhat, S. N. Ultrarapid engineering of biomimetic materials and tissues: fabrication of nano- and microstructures by plastic compression. Adv Funct Mater. 15, 1762-1770 (2005).
- Fumagalli Romario, U., Puccetti, F., Elmore, U., Massaron, S., Rosati, R. Self-gripping mesh versus staple fixation in laparoscopic inguinal hernia repair: a prospective comparison. Surg Endosc. 27, 1798-1802 (2013).
- Muangman, P., et al. Complex Wound Management Utilizing an Artificial Dermal Matrix. Annals of Plastic Surgery. 57, 199-202 (2006).
- Ajalloueian, F., Zeiai, S., Fossum, M., Hilborn, J. G. Constructs of electrospun PLGA, compressed collagen and minced urothelium for minimally manipulated autologous bladder tissue expansion. Biomaterials. 35, 5741-5748 (2014).
- Orabi, H., AbouShwareb, T., Zhang, Y., Yoo, J. J., Atala, A. Cell-seeded tubularized scaffolds for reconstruction of long urethral defects: a preclinical study. Eur Urol. 63, 531-538 (2013).
- Blais, M., Parenteau-Bareil, R., Cadau, S., Berthod, F. Concise review: tissue-engineered skin and nerve regeneration in burn treatment. Stem Cells Transl Med. 2, 545-551 (2013).
- Serpooshan, V., Muja, N., Marelli, B., Nazhat, S. N. Fibroblast contractility and growth in plastic compressed collagen gel scaffolds with microstructures correlated with hydraulic permeability. J Biomed Mater Res A. 96, 609-620 (2011).
