Summary
스트레스 저항은 장수의 특징 중 하나이며 유 전적으로 규율하는 것으로 알려져있다. 여기, 우리는 장수 연구에 마우스 모델을 개발하기 위해있는 배아 줄기 세포에 스트레스 저항을 부여 돌연변이 선별 편견 높은 처리량 방법을 개발했다.
Introduction
장수 스트레스 저항과 친밀한 관계를 가지고있다. 일반적으로, 수명이 긴 종들은 과산화수소, 파라콰트 (PQ), UV, 열, 중금속 1,2- 여러 스트레스쪽으로 저항을 증가 보여준다. 대조적으로, 스트레스 증가 감도 짧아 수명 및 / 또는 더 발생하기 쉬운 질환 표현형을 예측하는 경향이있다. 항산화 소기 경로가 긴 동물에게 스트레스 저항성을 부여하는데 중요한 역할을하는 것으로 추측하고있다. 그러나, 거의 예외없이, 다양한 항산화 제 효소 (예를 들면, SOD)의 조작과 형질 전환 동물의 다양한 연구가 산화제 소거 효소의 수준을 증가 시키면 수명 또는 건강 스팬 3을 증가시키지 않음을 나타낸다. 이러한 데이터는 지속적으로 수명이 긴 동물에서 관찰 된 스트레스 저항 특성이 아직 발견되는 다른 세포 경로에 의해 매개되는 것이 좋습니다.
우리는 편견 전달했다방법은 돌연변이 유전자에 배양 배아 줄기 (ES) 세포에서 스트레스 내성 표현형을 부여 할 수있는 유전자를 동정을 행 하였다. ES 세포는이 연구에서 두 가지 장점을 제공한다 : (1) 유전자 정교한 조작이 ES 세포의 게놈을 수정은 가능하다; 및 (2) 스크린으로부터 회수 스트레스 내성 ES 세포는 직접 수명 및 건강 범위를 측정하기 위해 전체 동물 연구에 신속한 변환을 허용 마우스 생산에 사용될 수있다.
이보고에서는, 대립 유전자가 BLM 테트라 사이클린 반응성 소자에 의해 제어 된 C9에 ES 세포주의 사용을 설명했다. 독시 싸이클린 (DOX)의 치료는 일시적으로 자매 염색 분체 교환의 증가 사고로 이어지는 BLM의 발현을 해제. 이 단기적으로는 BLM 노크 아웃 이질 집단 내에서 동형 접합 돌연변이의 생성을 허용 스트레스 저항 열성 돌연변이가 심사 과정에서 캡처 할 수 있도록. 우리또한 무작위 게놈에서 유전자 돌연변이 폴리 트랩 카세트 (PB-UPA)를 삽입 돌연변이로 피기 백 (PB) 트랜스포존의 사용을 설명했다. 폴리 트랩에 의해 유전자의 파괴와 세포 G418 내성이되었고, 유전자 트랩 돌연변이 (유전자 트랩 라이브러리)의 컬렉션을 만들고, 이후에 강한 스트레스했다 돌연변이 클론 상영 될 수 있도록 복구 할 수 있습니다.
선택으로부터 회수 스트레스 내성 클론 삽입의 수 (qPCR에)의 점에서, 분자의 기술에 의해 다소 빠르게 특성화 될 수 삽입 사이트 (splinkerette PCR), 파쇄 유전자 (BLAST)의 신원, 및 그 발현 량 ( RT-qPCR에). PB 삽입은 야생형 DNA 서열을 복원하고, 따라서 응력의 저항 손실을 테스트 할 클론의 MPB 트랜스의 일시적 발현으로 remobilized 될 수있다. 이들은 이전에 수행해야 돌연변이의 인과 관계를 확인하는 강력한 방법이다비싼 마우스 생산. 이전의 연구는 스트레스에 노출 된 세포가 만능의 4,5을 잃은 것으로 나타났다. 따라서,이 프로토콜에서, 스트레스로 처리되지 않는다 돌연변이 세포의 집합 복제, 보존 성공적인 마우스 생산에 중요하다.
우리 연구소는 모두 요청에 따라 다른 연구자가 사용할 수있는, C9 ES 세포 라인과 PB-UPA 벡터를 설계하고있다. 여기에보고 된 프로토콜은 스트레스 내성 클론 (그림 1B)를 분리하기 위해 복제 도금과 스트레스의 선택에 따라 PB-UPA (그림 1A)와 유전자 갇혀 ES 세포의 드 노보 라이브러리의 생성에 의해 시작됩니다. 우리는 파라콰트, 세포 내부의 강력한 활성 산소 발생기 선택을 보여 주었다. 사실상, 예를 들어 임의의 세포 독성 화합물 또는 독소, ER 스트레스 요인 (예, 및 쌥시 가르 긴 tunicamycin), 신경 세포의 산화제 (예를 들어, MPP +, 6- 히드 록시 도파민 및 로테 논), 열, 또는 무거운금속 (예를 들면, CD, SE는) 각각 내성 돌연변이 체에 대해 선택하는 방법에 적용 할 수있다.
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Protocol
피기 백 트랜스포존을 사용하여 1. 유전자 갇혀 ES 셀 라이브러리 생성
- ES 세포 배양에 대한 피더 1 차 마우스 배아 섬유 아세포 (PMEF)를 준비
- 37 ° C의 물을 욕조에 마이 토마 이신 C-불 활성화 PMEF (5.0 × 10 6)의 한 병을 녹여. DMEM은 15 % FBS를 함유하는 ES 세포 배지 5 ㎖ (1,000 유닛 / 백혈병 억제 인자 ㎖, 100 μM 비 필수 아미노산, 2 mM의 글루타민, 55 μM 2- 머 캅토 에탄올, 25 유닛 / ㎖ 페니실린 / 스트렙토 마이신으로 세포를 전송할 ), 5 분 동안 100 XG에 원심 분리기.
- 상등액을 흡인하고 두 T25 플라스크 (5 ㎖를 각)와 두 100 mm 플레이트 (10 ㎖ 각각)로 분배 하였다 ES 세포 배지 30 ㎖에 세포를 재현 탁. 24 시간 동안 37 ℃, 5 % CO 2에서 배양한다.
- 문화와 C9 ES 세포를 확장
- 37 ℃의 수욕 C9 ES 세포의 한 바이알 (0.5ml를 2.5 × 106 세포)를 해동하고 전송할ES 세포 배지 5 ㎖로 세포. 5 분 동안 100 XG에 원심 분리기.
- 피더 T25 플라스크에 도금이어서 상등액과 ES 세포 배지 5ml에 재현 탁 ES 세포를 대기음. 37 ℃, 5 % CO 2에서 품어. 매일 ES 세포 매체를 교체합니다.
- 배양 2 일 후에, ES 세포는 ~ 80 %가 합류하고, 계대 될 준비가 된 것이다. (2 + 2 + 및 마그네슘 칼슘없이) PBS의 5 ml의 세포를 세척 한 후 2.5 ml의 추가 트립신 EDTA 0.25 %를 미리 예열. 10 분 동안 37 ℃에서 배양한다. 트립신을 중지 2.5 ml의 ES 세포 매체를 추가; 최대 피펫과 15 배 아래로 세포 덩어리를 파괴 할 수 있습니다. 5 분 동안 100 XG에 원심 분리기.
- ES 세포 배지 4 ㎖에 재현 탁하고 세포 상등액을 흡인. 전사 9 ML의 ES 세포 배지를 함유하는 100-mm 플레이트 당 1 ml의 세포; 두 개의 100-mm의 판을 준비합니다. 8 통로 :이 1입니다. 10 ㎖의 ES 세포 배지로 매일 세포 피드.
- 라이브러리에 대한 96 웰 피더 플레이트를 준비합니다
- 1.1.1에 설명 된 바와 같이, 33.3 ML의 ES 세포 배지와 각 바이알로부터 세 미토 마이신 C의 바이알 PMEF를 불 활성화 (각각 포함하는 5 × 106 세포) 재현 탁하고 세포를 해동. 100 ml의 세포 현탁액을 수득 세포 수확기.
- 잘 위에 열 96 웰 플레이트 당 플레이트 (100)는 μL 세포. 이 96- 웰 플레이트 피더 PB 트랜스포존과 C9 ES 세포를 형질 감염 전에 적어도 하루 하루 준비되어야한다.
- PB-UPA 벡터와 C9 ES 세포의 전기
- 를 Trypsinize 및 자동화 세포 계수기를 사용하여 확장 된 C9 ES 세포를 카운트. 10 ml의 PBS로 C9 ES 세포의 각 100 mm 판을 씻으십시오. 8 ML을 추가 0.25 % 트립신 EDTA를 미리 예열 10 분 동안 37 ° C에서 품어.
- 2ml의 ES 세포의 배지를 첨가함으로써 트립신을 멈춘다. 세포 덩어리를 분리 휴식 15 ml의 튜브와 피펫 위아래로 15 회에 세포 현탁액을 전송합니다. 즉시 상층 액을 흡입 한 다음 5 분 동안 100 XG에 원심 분리기.
- 재현 탁 셀10 ㎖의 ES 세포 배지에서 S 및 혈구를 사용하여 ES 세포를 카운트. 세포 현탁액 15 ml를 여섯 튜브 함유 각각 5 × 106 ES 세포를 준비한다. 5 분 동안 100 XG에 원심 분리기. 뜨는을 대기음 및 0.8 ml의 PBS에 각각의 세포 펠렛을 재현 탁.
- 여섯 전기 큐벳 (4mm 간격) 0.8 ml의 세포를 전송하기를 준비합니다. 각각의 큐벳에, 1 μg의 PB-UPA 20 μg의 MPB의 트랜스 (mPBase)를 추가; 로 pipetting 아래로 부드럽게 섞는다. 얼음에 큐벳을 넣습니다. 250 V의 지수 설정을 사용 electroporator, 500 μF, 무한대의 옴으로 전기를 수행합니다.
주 : 일반적으로, 시간 상수는 약 10 내지 5 × 106 세포 당 약 1,500 2,000 G418 내성 형질 전환 체를 수득 성공적인 일렉트로 12 밀리,이다. - 검색 98 ML의 ES 세포를 함유하는 배지 T75 플라스크에 세포를 형질 수영장. 부드럽게 피펫 팅하여 세포를 혼합 한 다음 저장 부 (50 ㎖)에 세포를 옮긴다. 우리12- 채널 피펫을 보내고, (총 10)를 미리 제조 한 96 웰 플레이트에 피더 세포를 웰 당 100 ㎕를 전송. 37 ℃, 5 % CO 2에서 품어.
- 24 시간 후, 유전자 갇혀 클론 선택 신선한 ES 세포 매체 포함 G418 (150 μg의 / ml)로 매일 세포를 공급.
참고 : 일반적으로 각 웰 약 10 G418 방지 식민지를 포함합니다. 이러한 식민지 (일반적 5-7일) 충분한 크기로 성장할 때, 96 웰 플레이트 (라이브러리)는 각각 저장 및 선택, 2 세트로 복제됩니다. 이 경우, 10 개의 서브 - 라이브러리가 존재하도록 라이브러리의 각 판은, '서브 - 라이브러리'로 지정된다.
2. 라이브러리 복제
- 마스터 판을 복제
- 24 ~ 48 시간 50-60%의 포화 상태에 도달 G418 방지 식민지 이전에, 피더 (1.3 절 참조)로 열 96 웰 플레이트에 마이 토마 이신 C-불 활성화 PMEF의 또 다른 세 개의 튜브를 해동. 젤라틴적어도 15 37 ° C에서 0.1 % 젤라틴을 배양하여 열 96 웰 플레이트이지는 (/ 잘 100 μL) - 30 분; O / N 배양 허용됩니다.
- 트립신에 의해 96 웰 플레이트에서 단일 세포 현탁액을 준비합니다. 대기음 96 웰 플레이트에서 중간 (칼슘, 마그네슘 2+없이) PBS의 동일한 볼륨 번 씻는다. 미리 예열 0.25 % 트립신 - EDTA의 50 μl를 추가, 10 분 동안 5 % CO 2에서 37 ° C에서 품어. ES 세포 매체의 50 μL와 트립신 중지합니다. 멀티 채널 피펫 아래로 15 회를 피펫 팅에 의해 세포 덩어리 떨어져 휴식.
- 전사 이미 150 μL ES 세포 배지를 함유하는 공급 판 (마스터)와 이미 150 μL ES 세포 배지를 함유하는 젤라틴 화 플레이트 (레플리카)의 대응하는 행에 나머지 50 μL의 대응하는 행에 트립신 세포 현탁액 50 μL. 마스터 및 복제 접시에 세포의 각 행을 처리합니다. 지금은 200 μL의 C를 포함하는 (판을 품어37 ° C에서 ulture 부피), 5 % CO 2 O / N.
참고 : 이십 96 웰 플레이트는 지금이 있습니다. - 익일에 150 μg의 / ㎖의 G418을 함유하는 100 ㎕의 신선한 ES 세포 배지로 세포를 공급. 우물 80~90% 합류 할 때까지 매일 매체를 교체합니다.
- 마스터 판을 동결
- 마스터 플레이트를 약 80 % 컨 플루 언트 할 때 (섹션 2.1.2 참조) 한 바와 같이, 세포를 Trypsinize.
- 플레이트를 제거하고 중간 (60 % ES 세포 매체, 20 % FBS, 20 % DMSO)를 동결 배의 50 μL와 트립신 반응을 중지합니다. 피펫은 최대 및 멀티 채널 피펫 10 배 아래로 동결 매체의 적절한 혼합을 보장합니다.
- 밀봉 스티로폼 상자에 96 웰 플레이트를 넣어 최대 네 개의 개월 저장 -80 ° C 냉장고에 넣습니다. 네 달은 스트레스 선택을 완료하고 마스터 판에서 우물 관심의 클론을 포함하는 식별하는 데 충분한 시간을 허용 할 것이다.
참고 : -80 & #에 저장176; C 이상 4개월는 세포 생존 능력의 감소가 발생합니다. 하나의 스토리지 장기간 액체 질소의 증기 상에 저장 될 수있는 96 웰 형식 극저온 튜브를 이용할 수있다.
- 복제 판에서 DNA 플레이트 및 하위 라이브러리 풀을 준비
- 24 ~ 48 시간 서브 라이브러리 풀에 마이 토마 이신 C-불 활성화 PMEF와 열 100 mm의 판을 준비, DNA 플레이트 및 하위 라이브러리 풀에 추가로 복제하기 전에, 그리고 DNA 판은 복제에 대한 열이 96 웰 플레이트를 호화. 일반적인 절차에 대한 1.3 절을 참조하십시오.
- 96 웰 복제 판에서 세포를 Trypsinize (섹션 2.1.2 참조). 10 분 트립신 단계 중 대기음 DNA 판에서 젤라틴과 150 μL ES 세포 매체 포함 G418 (150 μg의 / ml)로 교체합니다. 또한, 100-mm 플레이트 피더로 '서브 - 라이브러리'풀링 용 ES 세포 배지 5 ㎖을 함유하는 저장소를 준비한다.
- 트립신을 따르면, 시도 중지12- 채널 피펫을 사용하여 한 번에 ES 세포 배지 한 행의 50 μL와 psin. 피펫은 최대 10 배 아래로 세포 덩어리를 깨지합니다.
- 트랜스퍼 (50) DNA 플레이트의 대응하는 행에 세포 현탁액 μL 및 5 ㎖의 ES 세포를 함유하는 배지 저장조에 나머지 50 μL를 전송. 하나의 완전한 96- 웰 플레이트를 완료 한 후, 100 mm 공급 플레이트의 매체가되는 풀링 된 셀이 전송하는 대기음. 이 풀 돌연변이 세포는 '서브 라이브러리'로 지정되어 있습니다.
- 나머지 9 96 웰 플레이트에 대해 반복합니다. ES 세포 매체 포함 G418 (150 μg의 / ml)로 매일 96 웰의 DNA 접시와 100 mm의 풀링 '서브 라이브러리'판을 공급.
참고 : 지금 열 96 웰 'DNA'플레이트 및 열 100 MM '서브 라이브러리'플레이트가 있습니다.
- DNA 판을 동결. DNA 플레이트에 세포를 80 ~ 90 %의 컨 플루 언트 될 때, 배지를 흡인 100 번 세포를 씻어이후 게놈 DNA 분리 6 -20 ℃에서 PBS와 매장 μL. 이러한 DNA 플레이트는 '마스터'판에 잘 대응하는 관심의 복제를 포함하는 식별하는 PCR에 의해 상영됩니다.
3. 독시사이클린 유도 동질 접합체 돌연변이
- 독시사이클린 처리 용 서브 - 풀 및 통로 라이브러리 세포를 동결
- 24 시간 70 ~ 80 %의 컨 플루 수율 독시사이클린 처리에 100-mm 플레이트 젤라틴 10 세트를 제조하기에 충분히 큰 콜로니를 갖는 100 mm '서브 - 라이브러리'플레이트에 앞서.
- 각각의 서브 라이브러리의 단일 세포 현탁액을 준비합니다 (섹션 1.4.1 및 자세한 내용은 1.4.2 참조). 독시 싸이클린 (1 μg의 / ㎖)와 젤라틴 100 mm 플레이트로 전송 5 × 10 6 세포; 37 ℃, 5 % CO 2에서 품어. 바이알 당 5 × 106 세포에 남아있는 비 독시사이클린 처리 서브 라이브러리 풀을 동결.
- 존재 통로 셀BLM을 노크 독시사이클린의
- 항로 1의 서브 라이브러리 : 최대 2 주 동안 독시 싸이클린 (1 μg의 / ㎖)의 존재 (8) 2-3 일마다는이 기간 동안 아웃 노크 BLM의 셀에 이형의 손실을 촉진 DOX 유도 인구, 동형 접합 돌연변이의 생성을 허용.
4. 스트레스 선택과 저항 클론의 분리
- 스트레스 선택을위한 주제 독시사이클린 처리 된 세포
- 준비하기 전에 스트레스 선택을 위해 독시사이클린 처리 된 세포를 계대 24 시간 10은 37 ℃, 5 % CO 2 가습 배양기에서 150 mm 플레이트, 장소를 호화.
- 트립신 처리에 의하여 각 서브 라이브러리의 단일 세포 현탁액을 제조 (섹션 1.4.1 및 1.4.2에 대한 세부 사항을 참조). 고르게 세포를 배포, 30 ml의 총 문화 볼륨에서 각 150 mm 판에 6.6 × 10 6 세포를 시드. 스트레스 (10 μm의 파라쿼트 또는 β-머 캅토 에탄올의 누락으로 세포를 품어,생존 세포 따기 콜로니로 성장할 수 있도록 정상 ES 세포 배지로 교체 한 후 7 일 동안 불 활성화 FBS를 7.5 % 열)를 함유하는 ES 세포 배지에서.
- 옵션 : 유리 병 당 5.0 × 10 6 세포에서 독시사이클린 처리 된 세포를 통해 왼쪽을 동결.
- 스트레스 저항하는 식민지를 선택
- 일주일 동안 정상적인 미디어를 복직 후, 저항하는 식민지가 존재 얼마나 많은 스트레스를 관찰합니다. 식민지의 수를 포착 할 수 있습니다에 따라, 96 웰 플레이트에 마이 토마 이신 C-불 활성화 PMEF 충분히 우물을 준비하는 일일 사전에 따라 (자세한 내용은 1.1 절 참조).
- 그리고 따기, 흡인의 날, 100 μL 신선한 ES 세포 매체와 96 웰 공급 플레이트 중간 교체 37 ℃, 5 % CO 2 가습 인큐베이터에 다시 배치합니다. 이 때, 50 μL 0.25 % 트립신 - EDTA와 U-바닥 96 웰 플레이트를 준비마다 잘. 대기음 150 mm의 스트레스 선택 접시에서 매체 및 전자를 추가PBS의 QUAL 볼륨.
- 2 μL를 마이크로 피펫을 설정하고 잘 당 하나의 식민지를 따기, 우물을 포함하는 U-바닥 트립신에 식민지를 생존 '선택'. 이 콜로니 원하는 번호가 포착 될 때까지 플레이트를 실온에서가 앉지 좋다. 그 후, 10 분간 37 ° C, 5 % CO 2에서 U 바닥 판을 배양.
참고 : 일반적으로, 우리는 96 식민지를 선택하는 1 시간을. - 50 μL ES 세포 배지는 멀티 채널 피펫을 사용하여 한 번에 하나의 반응 트립신 행을 멈춘다. 피펫은 상하로 15 회 단일 세포 현탁액을 얻고 이미 ES 세포 배지 100 ㎕를 함유하는 공급 판의 대응하는 행에 세포 100 μl를 전송합니다. 전체 판의 전송을 완료합니다. 문화 세포 200 μL에 O를 / N. 다음 날 아침, 흡인 매체와 100 μL ES 세포 배지로 교체합니다.
- 96 웰 플레이트를 복제
- 고른 식민지의 우물 80-90 %의 conflue 경우NT, 두 개의 매칭 플레이트, DNA 격리를위한 하나의 세포 백업에 대한 다른에 복제합니다. 이 판 젤라틴 화하고 마이 토마 이신 C-불 활성화 PMEF 포함되어 있지 않습니다.
- 대기음 매체, 100 μL PBS로 씻는다. 각 웰에 50 ㎕를 0.25 % 트립신 EDTA를 추가, 10 분 동안 37 ° C에서 품어. 150 μL ES 세포 배지와 트립신을 중지 피펫 팅하여 혼합하고, 96 개의 웰 플레이트의 대응하는 행에 세포 현탁액 100 ㎕를 전송. 매체 매일을 변경합니다.
- 판 80~90% 합류 때, '백업'(자세한 내용은 2.2 절 참조)로 판의 한 세트를 동결. 판의 다른 세트는 후술하는 바와 같이 확장됩니다.
- 게놈 DNA의 분리를위한 확장 세포
- 96- 웰 플레이트 DNA (자세한 내용은 2.1.2 참조)에서 단일 세포 현탁액을 제조.
- MICR를 사용하여 24- 웰 플레이트 (총 4 개)의 웰에 96 웰 플레이트의 각 웰로부터 세포 현탁액을 전송할opipette. '픽업'식민지 기원 '클론'이기 때문에 모든 세포에는 교차 오염이 없다 확인합니다. 웰까지 매일 배지를 0.5 ml의 변화의 ES 세포 배지에서 배양 된 세포는 80-90 %의 융합 성이다.
참고 : 24 웰 플레이트 PCR 분석을 위해 게놈 DNA의 충분한 수율을 수 있습니다.
PB 삽입 사이트 및 갇혀 유전자 5. 확인
- 24 웰 플레이트에서 게놈 DNA의 분리 :를 Lyse의 24 웰 플레이트 세포와 RNA가없는 게놈 DNA를 분리.
- 7,8 바와 같이 PB 트랜스포존 통합 사이트를 플 랭킹 서열의 단편을 생성하기 위해 PCR Splinkerette (SpPCR)을 수행한다.
참고 : SpPCR하지만 시간 손에 매일 최소화, 5 일 과정이다.
돌연변이 클론 6. 유전자 분석
- 잘 마스터를 찾아 관심의 복제를 정화.
- PB 통합 사이트 되었으면매핑, PB 역방향 프라이머 (예 PB3'-1) 8 사용에 대응하는 DNA 플레이트를 선별 통합 부위의 상류 정방향 프라이머를 설계 같은 '서브 - 라이브러리'스트레스 내성 클론 촬상되었던. 전체 96 웰 DNA 판을 통해 하나의 긍정적 인 잘 찾을 것으로 예상된다. 피더에 24 웰 플레이트에 '마스터'판에서 정확한 아니라이를 해동하고 80-90%의 자랄 때까지 세포를 성장.
참고 :이 시점에서이 아니라이 유전자 갇혀 클론의 혼합물을 포함한다. - 24 웰 플레이트는 80-90% 합류,를 Trypsinize 세포와 100 mm의 공급 판에 1,000 ES 세포를 플레이트 (단일 세포 현탁액을 위해) 인 경우. 항로 확장을위한 피더에 T25 플라스크에 남아있는 세포. 콜로니를 80 ~ 90 %의 컨 플루 언트 할 때 T25 플라스크로부터의 세포를 동결. 백 업으로 T25 플라스크 당 4 병을 동결.
- 식민지 7 일 동안 성장 후 96 웰 철에 96 식민지를 선택하도록 허용에더 판. 절차를 따기 위해 4.2 절을 참조하십시오. 'DNA'판으로 판 준비 복제 및 판 '-master 2 차'와 같은 다른 동결 (동결에 대한 2.2 절 참조).
- 식민지 80-90%의 포화 상태에 도달 할 수 있습니다. 관심 정제 된 클론을 포함하는 웰을 찾기 위해 DNA 플레이트 화면. 24 웰에이어서 T25 플라스크 (공급기에있는 모든)에 96 - 웰 2 차 -master 판에서 세포를 확장합니다. T25 플라스크 당 4 병을 동결.
주 :이 시점에서, 클론 인 유전자 포획 세포주, 스트레스에 노출 및 마우스 생산에 적합하지 않은 것이다.
- PB 통합 사이트 되었으면매핑, PB 역방향 프라이머 (예 PB3'-1) 8 사용에 대응하는 DNA 플레이트를 선별 통합 부위의 상류 정방향 프라이머를 설계 같은 '서브 - 라이브러리'스트레스 내성 클론 촬상되었던. 전체 96 웰 DNA 판을 통해 하나의 긍정적 인 잘 찾을 것으로 예상된다. 피더에 24 웰 플레이트에 '마스터'판에서 정확한 아니라이를 해동하고 80-90%의 자랄 때까지 세포를 성장.
- PB 삽입의 수를 결정 스트레스 내성 세포주의 한 유리 병을 해동하고 호화 T25 플라스크에 세포를 확장합니다. 게놈 DNA를 분리하고, PB의 트랜스포존의 사본 번호를 확인합니다. 이것은 네오 마이신 유전자를 표적 qPCR에 의해 달성 될 수있다.
- 유전자 발현 수준을 측정한다 : 눌러 확인 후관심 세포주 PB 단일 통합 이벤트가 rming, 각각의 유전자에 대해 특정의 TaqMan 프로브를 사용하여 RT-qPCR에 의해 포획 된 유전자의 발현 수준을 측정한다.
- 돌연변이 mRNA의 염기 서열 : 엑손에 상류 프라이머 어닐링과 유전자 트랩 카세트의 스플 라이스 수용체 순서에 다운 스트림 프라이머 어닐링을 사용하여 PCR로 cDNA를 증폭 물을 생성합니다. 시퀀스의 cDNA 조각은 예상 접합이 갇혀 유전자에서 발생하는 것을 확인합니다.
- 포획 된 유전자 및 스트레스 저항 사이의 인과 관계를 테스트하는 피기 백 트랜스포존을 Remobilize.
- 24 ~ 48 시간 한 T25 플라스크에 PB 재 이동, 해동 및 플레이트 DR4 피더와 두 개의 100 mm 플레이트 세포를 해동하기 전에. DR4 피더 T25 플라스크에 도금 후 적어도 하루, PB 삽입 함유 세포주 한 바이알을 해동하고 DR4 모이 함유 T25 플라스크에 세포를 접시. ES 세포 배지에서 세포 성장48 시간 동안, 매일 매체를 변경.
- ES 세포의 단일 세포 현탁액을 제조. 자동 세포 계수기로 세포를 계산하고, 15 ml의 튜브에 5.0 × 10 6 ES 세포를 전송합니다. 100 XG에 원심 분리기 800 μL PBS에 세포를 재현 탁하고. 4mm의 큐벳에 현탁액을 전송합니다.
- , 큐벳에 20 μg의 mPBase 순수하지 않아 추가 피펫으로 혼합하고, electroporate 세포 (자세한 내용은 1.4 절 참조). 두 개의 100-MM DR4 공급 판에 형질 전환 세포를 배포합니다. 배양 세포 O / N ES 세포 배지.
- 다음날 아침, 48 시간 동안 1 μg의 / ㎖의 퓨로 마이신과 문화 세포와 ES 매체와 세포를 공급. 5 일간 세포를 퓨로 마이신 선택을 철회과 문화를 계속합니다. 식민지 따기위한 충분히 큰 경우, 96 웰 공급 판 (4.2 절 참조)로 선택합니다.
- 고른 세포가 80-90%의 포화 상태에 도달하면, DNA 판으로 판의 1/6을 분할하고, PL의 1/6냉동 할 수있는 원판에있는 세포의 2/3 RDS를 떠나, G418 판에 먹고 (동결에 대한 2.2 절 참조).
- 배양 후 DNA 분리에 대한 ES 세포 배지에서 DNA 플레이트, 150 μg의 / ㎖의 G418에서 G418 플레이트는 네오 마이신 저항 손실을 테스트한다. G418을 포함하는 문화에 72-96 시간 후 아무 가능한 세포와 웰스는 유전자 트래핑 PB의 트랜스포존의 성공적인 재 이동을 나타냅니다.
- 'DNA'판의 해당 우물이 제거 된 PB의 트랜스포존을 확인하기 위해 PCR로 상영됩니다. DNA 플레이트는 90 % 컨 플루 언트 될 때, 야생형 서열의 복원 및 복귀를 확인하는 수단으로서 네오 IRES의 부재에 대한 PCR 스크리닝 용 96 웰 플레이트 포맷 (4)의 게놈 DNA를 분리.
- 24 웰 플레이트에 마스터 판에서 일치하는 우물을 해동 및 T25 플라스크 (공급기 모든)로 확장합니다. 백업으로 T25 플라스크 당 네 개의 튜브를 동결.
마우스 돌연변이의 7 세대 - 마스터 판에서 저항하는 ES 세포를 복구하고 키메라를 생성하는 배아 주입을 사용합니다. 15-20 ES 세포는 개개의 C57BL / 6 배반포에 주입된다. 전송 가임 (주 ICR)의 자궁에 마우스 당 15 포배. 세균 온라인 전송을 위해 테스트 및 돌연변이 생쥐의 식민지를 구축하기 위해 여러 젊은 처녀 C57BL / 6J 여성과 쓰레기에서 복구 (ES 세포 특정 아구 티 코트 색으로 표시) 남성 키메라 메이트.
- 분리 및 반응성 산소 종 (ROS) 및 저항 레벨 F1 돌연변이 마우스와 야생형 한배 새끼로부터 테스트 꼬리 피부 섬유 아세포 파라콰트 9.
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Representative Results
전형적인 돌연변이 유발 실험에서는 트랜 PB-UPA 및 MPB의 트랜스와 3 × 10 7 ES 세포의 전체로 구성되어있다. 두 독립적 인 실험에서 생성 된 유전자 포획 ES 세포의 숫자는 표 1에 요약되어있다. 유전자의 포집 효율은 약 0.04 %이다. 결합 된 유전자 트랩 라이브러리는 22,400 독립적 인 돌연변이 마우스 게놈에 대한 전체 범위 (23,000 코딩 유전자)를 포함한다. 과도한 따르면 반복 돌연변이 유발을 통해 더욱 돌연변이를 생성 및 / 또는 공정을 스케일링함으로써 달성 될 수있다.
유전자 트랩 무작위 돌연변이 라이브러리를 포함하기 때문에, 스트레스 내성 표현형을 갖는 돌연변이의 수를 예측하는 것은 불가능하다. PQ 저항에 대한 두 개의 독립적 선택은 수행되었다; 22440 독립적 인 유전자 트랩 돌연변이의 결합 심사는 PQ에 휴대 저항 (0.08 %) (표 1) 부여 (17) 돌연변이를 발견.
<P 클래스 = "jove_content은"> 우리는 추가 분석 및 마우스 생산을위한 마스터 플레이트에서 3 돌연변이 클론, Pigl, Tiam1 및 Rffl을 정제했다. 이형 Rffl 변이 세포가 성공적으로 BLM을 노크하여 동형 접합 자손을 생산하도록 유도했다. 그러나, 우리는 Pigl과 Tiam1 돌연변이 체에서, 아마도 때문에 동질 접합체 연결된 세포 치사 모든 동형 접합 돌연변이를 생산하는 데 실패했습니다. 2- 메르 캅토 에탄올 (2-ME) 및 PQ 누락 (도 2) 이들 클론의 정제 응력 저항은 스트레스의 두 가지 유형을 사용하여 확인 하였다. 이러한 클론에서 PB를 제거하면, 관련된 스트레스 내성 표현형은 유전자 트랩 돌연변이가 원인 인자임을 확인, (그림 2) 분실되었다. 이 관찰 된 표현형의 원인으로 스트레스 선택시 확률 적 병변을 배제하는 것처럼 마스터 플레이트에서 발견 한 클론의 특성은 매우 중요하다.3 중돌연변이 ES 세포는 마우스의 제조 (표 2), 2 라인 (Pigl 및 Tiam1) 생식선 전달을위한 표시 포배 내로 도입된다. Rffl 분사로 시작하는 키메라의 최적 수 없었다 단 하나의 여성 키메라를 생산했다. 따라서 Rffl 생식선의 송신 실패에 기인 한 무능 키메라 쉽다. 우리는 Pigl 돌연변이 생쥐에서 분리 된 피부 섬유 아세포의 세포 표현형을 시험하고 그들이 PQ에 감소 된 내인성 활성 산소 종의 레벨 (ROS)뿐만 아니라 스트레스 저항 (그림 3)을 유지하고 있음을 보여 주었다.
그림 1. ES 세포의 돌연변이 유발과 스트레스를 선택합니다. (A) PB-UPA 벡터. 스플 라이스 수용체 (SA), 소 성장 호르몬 폴리 아데 닐 신호 (PA), phosphog 구성된 편견 폴리 -A (UPA) 트랩 벡터lycerate 키나제 (PGK) 프로모터, 네오 마이신 포스 (신), 내부 리보솜 항목 사이트 (IRES), (3 가지 독서 프레임) 스플 라이스 기증자 인공 ATG와 (SD)는 3 '에 의해 측면, 피기 백 트랜스포존에 클로닝 하였다 5 '긴 터미널 반복 (LTR). 스트레스 내성 클론 (B) 임의의 ES 세포의 돌연변이 유발 및 선택. ES 세포는 96 웰 플레이트에 도금 다음 PB-UPA와 mPBase와 전기가 공동 형질 감염시켰다. 트랩 된 유전자 클론 G418 내성에 의해 선택 하였다; 합류되면, 그들은 2 복제 세트들로 분할 하였다. 하나의 복제 세트는 더 파라콰트 (PQ)에 의해 DNA의 분리 및 스트레스 선택을위한 두 개의 반으로 나누었다; 다른 복제 세트 (마스터) 아래로 동결했다. 스트레스 치료에서 발견 한 생존 ES 세포의 콜로니 SP-PCR에 의한 PB 삽입에 대한 분자 분석 하였다. 프라이머는 다음되는 잘 sibli를 포함하는 복제 DNA 플레이트를 선별하도록 설계되었습니다NG PQ R 클론 마스터 플레이트에 위치 할 수 있습니다. 이러한 세포는 다양한 스트레스에 스트레스 내성에 대해 분석 및 마우스 생산이다. 병아리 등. 7에서 수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
돌연변이 ES 세포 그림 2. 스트레스 저항. 2- 메르 캅토 에탄올 (2-ME) 철회 (A)의 저항. (B) 파라콰트 (PQ)에 대한 내성. 이전의 연구 5에서 회복 : (빨간색 4C11), 3 유전자 트랩 클론 (회색), 스트레스 저항 제어 ES 세포 클론 : 부모의 야생 형 ES 세포 (노란색 C9)을 보이고있는 바와 같다. 세포는 생존 세포의 수를 카운트 한 후 2 일 동안 치료를 강조 하였다. < EM> Pigl, Tiam1 및 Rffl 이형. (PB / + : 어두운 회색)이 스트레스의 양에 전시 저항 Rffl의 동형 접합체 (PB / PB : 블랙) 이형에 비해 강한 스트레스 저항을 나타낸다. (: 밝은 회색 + / +)를 PB 삽입이 제거 될 때 모두 스트레스에 대한 저항이 끊어졌습니다. 오차 막대는 평균의 SD를 나타냅니다 (N = 4). * P <0.001, # 1 P = 학생의 T는 - 테스트에 의해 평가 유전자 트랩 복제 및 야생 형 부모 C9 사이 0.01. PQ (10 μM) 처리에서 (C) ES 세포 콜로니 형성. 변형성 ES 클론은 야생형 클론의 콜로니 수와 크기가 현저히 감소하는 동안 PQ 처리 하에서 배양에서 콜로니를 형성 할 수 있었다. 병아리 등. 7에서 수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Pigl PB / + 섬유 아세포도 3 특성화. (A) 반응성 산소 종 (ROS) 레벨. 야생형 (WT) 및 Pigl PB / + 마우스의 꼬리로부터 단리 피부 섬유 아세포는 CM-DCFCA로 염색하고, 형광은 훽스트 대해 규격화 하였다. ROS의 콘텐츠는 상대적인 형광 단위 (RFU)로 나타내었다. P 값이 두 검정 스튜던트의 t -test으로 평가 하였다 (N = 8). (B) PQ 저항. 야생형 (WT) 및 Pigl PB / + 마우스의 꼬리 피부 섬유 아세포의 세포 생존력을 MTT 분석에 의해 측정하고, 그 후에 6 시간, 4 mM의 PQ 노출시켰다. PQ 처리 후의 생균의 백분율은 PQ 처리 CE로부터 얻어지는 흡광도의 비율로 계산 하였다LLS와 미처리 세포로부터의 것이다. P 값이 하나의 꼬리 스튜던트의 t -test으로 평가 하였다 (N = 8). 병아리 등. 7에서 수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 도서관 | 하위 라이브러리 | ES 세포주 | 유전자 갇혀 클론의 번호 | PQ R 클론의 번호 |
| 1 | C9PA01 - C9PA10 | C9 (BLM TET / TET) | 9,000 | 7 |
| (2) | C9PA11 - C9PA20 | C9 (BLM TET / TET) | 13,440 (10) | |
| 합계 | 22440 | (17) |
표 1. 피기 백 유전자 트랩 라이브러리 구축 및 PQ 내성 클론의 회복. 병아리 등에서 수정. 7.
| ES 세포 클론 주입 | 키메라의 번호 복구 | 배아 전송 * |
| Pigl PB / Pigl + | 4 | 네 |
| Tiam1 PB / Tiam1 + | (2) | 네 | </ TR>
| Rffl PB / Rffl + | 1 | 아니 |
마우스의 표 2 세대. 병아리 등. 7에서 수정.
* 생식선 송신 PCR 유전자형 검출 유전자 트랩 대립 유전자의 유전에 의해 확인 하였다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vector | |||
| PB-UPA | |||
| mPBase | |||
| mPBasePuro | |||
| Tissue Culture | |||
| 500-ml Stericup filters | EMD Millipore | SCGPU05RE | |
| 250-ml Stericup filters | EMD Millipore | SCGPU02RE | |
| 50-ml Steriflip-GV filters | EMD Millipore | SE1M179M6 | |
| KO DMEM | Life Technologies | 10829-018 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| FBS | Tissue Culture Biologicals | 104 | |
| Heat Inactivated FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140148 | |
| β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Methyl Viologen dichloride (Paraquat) | Sigma-Aldrich | 856177 | |
| Dimethyl Sulphoxide Hybri-MAX | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| EmbryoMAX 0.1% gelatin | EMD Millipore | ES006B | |
| DPBS/Modified | HyClone | SH30028.02 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
| T25 Flask | Corning | 353108 | |
| T75 flask | Corning | 353135 | |
| 100-mm plate | Corning | 353003 | |
| 150-mm plate | Corning | 430599 | |
| 96-well plate | Corning | 3585 | |
| 96-well U-bottom plate | Corning | 3799 | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 50-ml reservoir | Corning | 4870 | |
| 15-ml tubes | VWR International, LLC | 82050-276 | |
| Primary Mouse Embryonic Fibroblasts | EMD Millipore | PMEF-NL | |
| DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts | Applied StemCell | ASF-1001 | |
| Mitomycin C | Fisher BioReagents | BP25312 | |
| Geneticin (G418) | Life Technologies | 11811-023 | |
| Doxycycline | Fisher BioReagents | BP26531 | |
| Cryotubes | Thermo Scientific | 377267 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 | |
| TC10 cell counter | Bio-Rad | ||
| Counting Slides (for TC10) | Bio-Rad | 1450011 | |
| Electroporation | |||
| Gene Pulser Xcell | Bio-Rad | 1652611 | |
| Gene Pulser Cuvettes (4 mm gap) | Bio-Rad | 1652088 | |
| Molecular Biology | |||
| Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercylcer ep Gradient S | |
| Puregene Core kit B | Qiagen | 158745 | |
| Topo-TA Cloning kit | Life Technologies | 450030 | |
| High Capacity cDNA synthesis kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
| NaCl | Fisher BioReagents | BP358-212 | |
| 100% ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2716 | |
| Double Processed Tissue Culture Water | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Sau3A1 | New England BioLabs | R0169L | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202T | |
| EcoRV | New England BioLabs | R3195S | |
| 96-well Lysis Buffer (Ramires-Solis et al. 1992) | |||
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher BioReagents | A144-212 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L5777 | |
| Proteinase-K | Fisher BioReagents | BP1700 | |
| Electrophoresis | |||
| Mini-Sub Cell GT | Bio-Rad | 170-4469EDU | |
| LE Agarose | GeneMate | E3120500 | |
| Ethidium Bromide | Fisher BioReagents | BP1302 | |
| 100 BP DNA Ladder | New England BioLabs | N3231S | |
| 1 Kb DNA Ladder | New England BioLabs | N3232S | |
| 2-log DNA Ladder | New England BioLabs | N3200L | |
References
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