Summary
Stresstoleranse er et av kjennetegnene for lang levetid og er kjent for å være genetisk styrt. Her har vi utviklet en objektiv høy gjennomstrømming metoden for å screene for mutasjoner som stresstoleranse i ES-celler med å utvikle musemodeller for lang levetid studier.
Introduction
Longevity har et intimt forhold til stresstoleranse. Generelt er langlivede arter ofte demonstrere økt resistens mot flere stressfaktorer, slik som hydrogenperoksyd, paraquat (PQ), UV, varme, og tungmetaller 1,2. I kontrast, økt følsomhet for påkjenninger har en tendens til å forutsi forkortet levetid og / eller et mer sykdoms utsatt fenotype. Den anti-oxidant fjerningsveien har lenge vært spekulert å spille en viktig rolle i overdragelse stresstoleranse til dyret. Imidlertid, med få unntak, studier fra en rekke av transgene dyr med manipuleringer i forskjellige anti-oksiderende enzymer (f.eks SOD) indikerer at ved å øke nivået av oksidant fjernende enzymer ikke øker levetiden eller helse span 3. Disse data tyder på at stresstoleranse egenskap konsekvent observert i langlivede dyr som er mediert av andre cellulære veier som ennå ikke er avdekket.
Vi tok en objektiv fremgenetisk tilnærming for å identifisere gener, som ved mutert, kan konferere en stresstoleranse fenotype i dyrkede embryoniske stamceller (ES-celler). ES-celler gir to store fordeler i denne studien: (1) sofistikerte genetiske manipulasjoner er tilgjengelige for å modifisere genomet til ES-celler; og (2) eventuelle belastnings resistente ES-celler utvinnes fra skjermen kan brukes direkte for mus produksjon, noe som muliggjør rask oversettelse til hele dyrestudier for å måle levetid og helse span.
I denne rapporten, vi beskrevet anvendelse av C9 ES-cellelinjen, hvor BLM lene var under kontroll av en tetracyklin-reagerende element. Behandling av doksycyklin (DOX) midlertidig slått av uttrykk for Blm fører til økt hendelse av søsterkromatidutveksling. Denne korttids Blm knock-out tillatt for generering av homozygote mutasjoner innenfor heterozygote populasjonen slik at recessive mutasjoner for stresstoleranse kan bli fanget i screening prosessen. Viogså beskrevet anvendelse av piggyBac (PB) transposon som mutagen for å sette inn et tilfeldig poly-A felle kassett (PB-UPA) å mutere gener i genomet. Celler med avbrudd av et gen av poly-A-felle ble G418-resistente og kunne utvinnes, slik at en samling av gen-felle mutanter (gen-bibliotek felle) kan bli gjort, og deretter screenet for mutante kloner som var resistente belastning.
Stress resistente kloner utvinnes fra utvalget kan være preget snarere raskt ved molekylære teknikker med hensyn på antall innsettinger (qPCR), stedet for innsetting (splinkerette PCR), identiteten til forstyrret genet (BLAST), og dets ekspresjon nivå ( RT-qPCR). PB innsetting kan remobilized ved transient ekspresjon av MPB transposase i klon for å gjenopprette villtype DNA-sekvensen og således teste for tap av stresstoleranse. Dette er kraftige måter å bekrefte kausalitet av mutasjonen, som bør gjøres førtil dyre mus produksjon. Tidligere studier har vist at celler eksponert for stressfaktorer mistet sin pluripotency 4,5. Således, i denne protokollen, er bevaringen av en replika sett av mutante celler, noe som ikke ville bli behandlet med stressfaktorer kritisk for vellykket mus produksjon.
Vår lab har konstruert den C9 ES cellelinje og PB-UPA vektor, begge er tilgjengelige for andre forskere på forespørsel. Av protokollen angitt her, vil starte ved generering av de novo bibliotek av gen-fanget ES-celler med PB-UPA (figur 1A), etterfulgt av kopiplate og utvelgelse spenning for å isolere belastnings resistente kloner (figur 1B). Vi demonstrerte valget med paraquat, et potent fri radikal generator inne i cellene. Praktisk talt hvilken som helst cytotoksiske forbindelse eller toksin, for eksempel, ER stressfaktorer (f.eks thapsigargin og tunicamycin), neuronal oksidasjonsmiddel (f.eks MPP +, 6-hydroksy-dopamin- og rotenon), varme og tungmetaller (f.eks, Cd, Se), kan være tilpasset til fremgangsmåten for å selektere for de respektive resistente mutanter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Gene-fanget ES Cell Bibliotek Construction Bruke piggyBac Transposon
- Forbered primære mus embryonale fibroblaster (PMEF) som fôrings ES cellekultur
- Tine ett hetteglass med mitomycin C-inaktivert PMEF (5,0 x 10 6) i en 37 ° C vannbad. Overfør cellene inn i 5 ml ES celle medium (DMEM inneholdende 15% FBS, 1000 emne / ml av leukemi-inhiberende faktorer, 100 mM ikke-essensielle aminosyrer, 2 mM glutamin, 55 mM 2-merkaptoetanol, og 25 enheter / ml penicillin / streptomycin ), og sentrifuger ved 100 xg i 5 minutter.
- Aspirer supernatanten og resuspender cellene i 30 ml ES celle medium, etterfulgt av fordeling inn i to T25 kolber (5 ml hver) og to 100 mm plater (10 ml hver). Inkuber ved 37 ° C, 5% CO2 i 24 timer.
- Kultur og utvide C9 ES-celler
- Tine en ampulle av C9 ES-celler (2,5 x 10 6 celler i 0,5 ml) i et 37 ° C vannbad og overføreceller i 5 ml ES cell medium. Sentrifuger ved 100 xg i 5 minutter.
- Aspirer supernatanten og resuspender ES-celler i 5 ml av ES cellen medium etterfulgt av plettering inn i materen T25-kolbe. Inkuber ved 37 ° C, 5% CO2. Bytt ES celle medium daglig.
- Etter 2 dager med kultur, bør ES-celler blir ~ 80% sammenflytende, og er klar til å bli passert. Vask cellene med 5 ml PBS (uten Ca 2+ og Mg2 +) og tilsett 2,5 ml forvarmet 0,25% trypsin-EDTA. Inkuber ved 37 ° C i 10 min. Legg 2,5 ml ES celle medium for å stoppe trypsin; pipette opp og ned 15 ganger for å bryte opp celleklumper. Sentrifuger ved 100 xg i 5 minutter.
- Aspirere supernatanten og resuspender cellene i 4 ml ES celle medium. Overføring 1 ml celler pr 100 mm-plate inneholdende 9 ml ES cellemedium; forberede to 100 mm-plater. Dette er en 1: 8 passasje. Mate cellene daglig med 10 ml ES celle medium.
- Forbered 96-brønns mater plater for biblioteket
- Som beskrevet i 1.1.1, tine tre ampuller med mitomycin-C inaktivert PMEF (hver inneholder 5 x 10 6 celler) og resuspender celler fra hvert hetteglass med 33,3 ml ES celle medium. Kombiner celler for å gi en 100-ml cellesuspensjon.
- Plate 100 ul celler per brønn til ti 96-brønners plater. Disse 96-brønners mater plater bør utarbeides minst en dag før trans C9 ES-celler med PB transposonet.
- Elektroporering av C9 ES-celler med PB-UPA vektor
- Trypsineres og telle de utvidede C9 ES-celler ved hjelp av en automatisk celleteller. Vask hver 100 mm skål av C9-ES-celler med 10 ml PBS. Tilsett 8 ml forvarmet 0,25% trypsin-EDTA og inkuber ved 37 ° C i 10 min.
- Stoppe trypsin ved å legge 2 ml ES celle medium. Overfør cellesuspensjonen til en 15-ml tube og pipette opp og ned 15 ganger for å bryte hverandre celleklumper. Umiddelbart sentrifuger ved 100 xg i 5 minutter, fulgt av aspirering av supernatanten.
- Resuspender celles i 10 ml ES cellemedium og tell ES-celler ved bruk av et hemocytometer. Forbered seks 15-ml rør av cellesuspensjonen hver inneholder 5 x 10 6 ES-celler. Sentrifuger ved 100 xg i 5 minutter. Aspirer supernatanten og resuspender hver celle pellet i 0,8 ml PBS.
- Forbered seks electroporation kyvetter (4 mm gap) som 0,8 ml celler overføres. Til hver kyvette, tilsett 1 mikrogram PB-UPA og 20 mikrogram MPB transposase (mPBase); bland forsiktig ved å pipettere opp og ned. Sett kyvettene på is. Utfør elektroporering med en electroporator bruke eksponentiell innstillingen på 250 V, 500 uF, og uendelig ohm.
MERK: Vanligvis er tidskonstanten omtrent 10 til 12 millisekunder for en vellykket elektroporering, som gir ca. 1500 til 2000 G418 resistente transformanter pr 5 x 10 6 celler. - Hente og basseng de transfekterte cellene til en T75 flaske inneholdende 98 ml ES celle medium. Bland celler ved forsiktig pipettering, og deretter overføre celler til et reservoar (50 ml). Ossing en 12-kanals pipette, overføres 100 ul av celler per brønn til den tidligere fremstilte 96-brønners mateplater (10 totalt). Inkuber ved 37 ° C, 5% CO2.
- Etter 24 timer, mate cellene daglig med friskt ES celle medium inneholdende G418 (150 ug / ml) for å selektere for gen-fanget kloner.
MERK: Vanligvis hver brønn vil inneholde omtrent ti G418 resistente kolonier. Når disse koloniene vokse til tilstrekkelig størrelse (vanligvis 5-7 dager), vil 96-brønners plater (bibliotekets) bli kopiert inn i 2 sett for lagring og valg, henholdsvis. Hver plate i biblioteket er betegnet som "sub-bibliotek", så i dette tilfellet er det 10 underbibliotek.
2. Library Replication
- Replikere Master plater
- 24-48 timer før de G418 resistente kolonier nådde 50-60% konfluens, tine ytterligere tre ampuller med mitomycin C-inaktivert PMEF på ti 96-brønners plater som forer (se avsnitt 1.3). Gelatinize ti 96-brønners plater ved å inkubere 0,1% gelatin (100 ul / brønn) ved 37 ° C i minst 15 - 30 min; O / N inkubasjon er akseptabelt.
- Tilbered en enkelt cellesuspensjon i 96-brønners plater ved trypsinering. Aspirer medium fra 96-brønners plater og vask en gang med likt volum PBS (uten Ca 2+, Mg2 +). Tilsett 50 ul pre-oppvarmet 0,25% Trypsin-EDTA, inkuberes ved 37 ° C i 5% CO2 i 10 min. Stoppe trypsin med 50 ul ES celle medium. Dele opp celleklumper ved å pipettere opp og ned 15 ganger med multikanalspipette.
- Overføring 50 ul av trypsinert cellesuspensjon til den tilsvarende rad av materen platen (Master) som allerede inneholdt 150 mikroliter ES celle medium og de gjenværende 50 ul i den tilsvarende raden av gelatinert platen (kopier) som allerede inneholdt 150 mikroliter ES celle medium. Behandle hver rad med celler til en Master og replika plate. Inkuber platene (nå inneholdende en 200 mL cruk volum) ved 37 ° C, 5% CO 2 O / N.
MERK: Det er nå tjue 96-brønners plater. - Den neste dag mate cellene med 100 ul friskt medium ES-celle inneholdende 150 ug / ml G418. Sett på medium daglig til brønnene er 80-90% sammenflytende.
- Fryse Master plater
- Når master platene er ca 80% sammenflytende, trypsineres cellene som beskrevet (se avsnitt 2.1.2).
- Fjerne platene og stoppe trypsin omsetning med 50 ul av 2x frysemedium (60% ES celle medium, 20% FBS, 20% DMSO). Pipetter opp og ned 10 ganger med en multikanal pipette for å sikre riktig blanding av frysemedium.
- Sett 96-brønners plater i en tett forseglet styrofoam boks og legg den i -80 ° C fryser i opp til fire måneders lagring. Fire måneder vil gi nok tid til å fullføre valget stress og å identifisere hvilke brønner fra Master plate inneholde kloner av interesse.
MERK: Lagring ved -80 & #176 C i mer enn 4 måneder vil resultere i reduksjon av cellenes levedyktighet. Man kan benytte kryo-rør i 96-brønns format som kan lagres i dampfase av flytende nitrogen i lengre lagringsperiode.
- Forbered DNA-plater og sub-bibliotek bassengene fra replica plater
- 24-48 timer før replikere videre til DNA-plater og sub-bibliotek bassenger, forberede ti 100-mm plater med mitomycin C-inaktivert PMEF for sub-bibliotek basseng, og ti gelatineres 96-brønners plater for DNA-plate replikerer. Se kapittel 1.3 for generell prosedyre.
- Trypsineres cellene i 96-brønnen replica plater (se avsnitt 2.1.2). I løpet av 10 min trypsinering trinn, aspirere gelatin fra DNA-platene og erstatt med 150 ul ES celle medium inneholdende G418 (150 ug / ml). Også forberede et reservoar inneholder 5 ml ES celle medium for sammenslåing av de "under bibliotekenes inn i 100-mm mater plate.
- Etter trypsinization, slutter prøvepsin med 50 ul ES celle medium én rad om gangen med en 12-kanals pipette. Pipette opp og ned 10 ganger for å bryte hverandre celleklumper.
- Overføring 50 ul av cellesuspensjonen til den tilsvarende rad av DNA platen og overføre de gjenværende 50 ul til reservoaret inneholdende 5 ml ES celle medium. Etter å ha fullført en hel 96-brønners plate, aspirere mediet for en 100 mm plate mater til hvilken de sammenslåtte celler blir overført. Disse sammenslåtte mutageniserte cellene er utpekt som en "sub-bibliotek".
- Gjenta for de rester ni 96-brønners plater. Mate 96-brønners DNA-plater og 100-mm sammenslått 'sub-bibliotek' plater daglig med ES cell medium som inneholder G418 (150 mikrogram / ml).
MERK: Det er nå ti 96-brønn 'DNA' plater, og ti 100-mm "sub-bibliotek 'plater.
- Fryse DNA-plater. Når cellene i DNA platen er 80-90% konfluent, aspireres mediet, vaskes cellene to ganger med 100mL PBS og oppbevares ved -20 ° C for senere genomisk DNA isolert 6. Disse DNA-platene vil bli vist av PCR for å identifisere hvilke tilsvarende godt i "Master" plate inneholder klone av interesse.
3. Doxycycline-indusert Homozygote Mutants
- Fryse sub-bibliotek bassenger og passasje celler for doksycyklin behandling
- 24 timer før de 100 mm "sub-bibliotek 'plater med kolonier som er store nok til å gi 70-80% konfluens, utarbeide et sett av ti gelatinized 100 mm-plater for doksycyklin behandling.
- Forberede enkeltcellesuspensjoner i hvert under bibliotek (se avsnitt 1.4.1 og 1.4.2 for detaljer). Overføring 5 x 10 celler 6 til gelatinert 100 mm plate med doksycyklin (1 pg / ml); Inkuber ved 37 ° C, 5% CO2. Fryse de resterende ikke-doxycycline behandlet sub-bibliotek bassengene på 5 x 10 6 celler per hetteglass.
- Passasje celler i nærværav doksycyklin å slå ut Blm
- Passage under bibliotekene på 1: 8 hver 2-3 dager i nærvær av doksycyklin (1 mikrogram / ml) i opptil to uker, hvorav tid DOX-indusert knock-out av Blm vil fremme tap av heterozygositet i cellen befolkning, slik at for generering av homozygote mutanter.
4. Stress Utvalg og Isolering av resistente kloner
- Subject doxycycline behandlede celler for valg stresset
- 24 timer før aging doxycycline behandlede celler for valg stress, forberede ten gelatinized 150 mm-plater, plass i en 37 ° C, 5% CO 2 fuktet inkubator.
- Forbered en enkelt celle suspensjon av hver sub-biblioteket ved trypsinering (se avsnitt 1.4.1 og 1.4.2 for detaljer). Seed 6.6 x 10 6 celler på hver 150 mm skål i 30 ml totale kulturvolum, fordele cellene jevnt. Inkuber celler med stressor (10 mm paraquat eller utelatelse av β-mercaptoethanol,i ES-celle-medium inneholdende 7,5% varme-inaktivert FBS) i 7 dager, hvoretter erstatte med normal ES celle medium for å tillate overlevende celler til å vokse til kolonier for plukking.
- Valgfritt: Frys overs doxycycline-behandlede celler på 5,0 x 10 6 celler per hetteglass.
- Plukk stresset resistente kolonier
- Etter gjeninnføre normal media for en uke, observere hvor mange stresset resistente kolonier er tilstede. Avhengig av antall kolonier å bli plukket, forberede nok brønner med mitomycin C-inaktivert PMEF på 96-brønners plater en dag på forhånd tilsvarende (se avsnitt 1.1 for detaljer).
- På dagen for plukke, aspirer og erstatte medium i 96-brønns mater plate med 100 mL frisk ES cell mellom, plassere tilbake i 37 ° C, 5% CO 2 fuktet inkubator. På dette tidspunkt fremstille en U-bunn 96-brønners plate med 50 pl 0,25% trypsin-EDTA per brønn. Aspirer medium fra 150-mm utvalg stresset plate og legge til equal volum av PBS.
- Sett mikropipette til to ul, og 'plukke' overlevende kolonier inn i U-bunn trypsin inneholder brønner, plukke en koloni per brønn. Det er akseptabelt å la platen sitte ved RT inntil det ønskede antall kolonier har blitt plukket. Deretter inkuberes det U bunnplaten ved 37 ° C, 5% CO2 i 10 min.
MERK: Vanligvis tar vi en time å plukke 96 kolonier. - Stoppe trypsin reaksjon én rad om gangen med 50 ul ES cellemedium med en multikanalspipette. Pipette opp og ned 15 ganger for å få en enkelt celle suspensjon og overføre 100 mL av celler til den tilsvarende raden av materen plate som allerede inneholder 100 mL av ES celle medium. Fullføre overføringen for hele platen. Kultur celler O / N i 200 ul. Neste morgen, aspirer medium og erstatte med 100 ul ES celle medium.
- Gjenskape 96-brønners plater
- Når brønnene i de plukkede koloniene er 80-90% confluent, replikere i to like plater, en for DNA-isolering og den andre for celler som back-up. Disse platene er gelatinisert og inneholder ikke mitomycin C-inaktivert PMEF.
- Aspirer medium, og vask med 100 ul PBS. Tilsett 50 ul 0,25% trypsin-EDTA til hver brønn, inkuber ved 37 ° C i 10 min. Stoppe trypsin med 150 ul ES celle medium, blandes ved pipettering, og overføre 100 ul cellesuspensjon til den tilsvarende rad med to 96-brønners plater. Endre medium daglig.
- Når platene er 80-90% konfluent, fryse ett sett med plater som en "back-up" (se avsnitt 2.2 for detaljer). Det andre settet av plater er ytterligere utvidet som beskrevet nedenfor.
- Voksende celler for genomisk DNA isolering
- Forbered en enkelt celle suspensjon i 96-brønns DNA plate (se 2.1.2 for detaljer).
- Overfør cellesuspensjonen fra hver brønn av 96-brønns plate i brønnen i en 24-brønners plate (samlet 4) ved hjelp av en MICRopipette. Sikre at det ikke smitte av noen celler, som "plukket kolonier er" klonal 'opprinnelse. Kultur celler i 0,5 ml ES cell medium, skiftende medium daglig inntil brønnene er 80-90% sammenflytende.
MERK: 24-brønns plate vil tillate tilstrekkelig utbytte av genomisk DNA for PCR-analyse.
5. Identifikasjon av PB Innleggelse og Trapped Genes
- Genomisk DNA isolert fra 24-brønns plate: Lyses cellene i 24-brønns plate og isolere RNA-fri genomisk DNA.
- Utfør Splinkerette PCR (SpPCR) for å generere sekvensen fragmenter flankerer PB transposonet integrering stedet som beskrevet 7,8.
MERK: SpPCR er en fem dagers prosess, men hands-on tid hver dag er minimal.
6. Genetisk Analyse av Mutant Clones
- Finn mester godt og rense klone av interesse.
- Når PB integrering området har værtkartlagt, utforme en fremtids primer oppstrøms for integrering området for å bruke med en PB revers primer (f.eks PB3'-1) 8 og skjermen DNA plate tilsvarende den samme "sub-bibliotek" som stress motstandsdyktig klonen ble plukket. Forvente å finne bare en positiv godt på tvers av hele 96 brønner DNA plate. Tine denne eksakte godt fra "Master" plate til en 24-brønns plate på matere og vokse celler inntil 80-90% konfluens.
MERK: På dette punktet, inneholder dette vel en blanding av gen-fanget kloner. - Når 24-brønns plate er 80-90% konfluent, Cellene trypsineres og platen 1000 ES-celler i en 100 mm plate mater (sørge for enkel cellesuspensjon). Passage de gjenværende cellene til en T25 kolbe på fôrings ekspansjon. Fryse cellene fra T25-kolbe når koloniene er 80-90% konfluent. Fryse 4 ampuller per T25 kolbe som back-ups.
- Tillat kolonier å vokse i 7 dager og deretter velge 96 kolonier i en 96-brønners feEder plate. Se kapittel 4.2 for å plukke prosedyre. Replikere plate når du er klar til en 'DNA' plate og fryse den andre som "2 nd-Master 'plate (se avsnitt 2.2 for frysing).
- Tillat kolonier å nå 80-90% konfluens. Screene DNA-plate for å finne brønner inneholdende den rensede klon av interesse. Utvide cellene fra den 96-brønns plate 2 nd-Master til 24-brønn og deretter til en T25-kolbe (alle på feeders). Fryse 4 ampuller per T25 kolbe.
MERK: Ved dette punktet genet fanget-cellelinje er klonal, har ikke vært utsatt for stressfaktorer, og er egnet for produksjon av mus.
- Når PB integrering området har værtkartlagt, utforme en fremtids primer oppstrøms for integrering området for å bruke med en PB revers primer (f.eks PB3'-1) 8 og skjermen DNA plate tilsvarende den samme "sub-bibliotek" som stress motstandsdyktig klonen ble plukket. Forvente å finne bare en positiv godt på tvers av hele 96 brønner DNA plate. Tine denne eksakte godt fra "Master" plate til en 24-brønns plate på matere og vokse celler inntil 80-90% konfluens.
- Bestem antall PB innsetting: Tine ett hetteglass med stress resistent cellelinje og utvide cellene i en gelatineres T25 kolbe. Isolere genomisk DNA og sjekk for kopiantall av PB transposonet. Dette kan oppnås ved å målrette qPCR neomycingenet.
- Måle genuttrykk nivå: Etter konfirming det er en enkelt PB integrering hendelse i cellelinje av interesse, måle nivået av ekspresjon av genet fanget ved RT-qPCR med bestemte TaqMan prober for hvert gen.
- Sekvensere den mutante mRNA: generere et cDNA fragment ved PCR ved anvendelse av en oppstrøms primer annealing til et ekson og en nedstrøms primer annealing å spleiseakseptoren sekvensen av genet felle kassetten. Sekvensen cDNA-fragment for å bekrefte at den forventede skjøting forekommer i fanget genet.
- Remobilize den piggyBac transposonet å teste for årsakssammenheng mellom fanget genet og stress motstand.
- 24-48 timer før tining celler for PB re-mobilisering, tine og plate DR4 forer på én T25 kolbe og to 100-mm plater. Minst én dag etter at DR4 brett er belagt på T25 kolbe, tine ett hetteglass med cellelinjen som inneholder PB innsetting og plate cellene i T25 kolbe med DR4 matere. Dyrke cellene i ES celle mediumi 48 timer, endring medium daglig.
- Forbered en enkelt celle suspensjon av ES-celler. Cellene telles med en automatisk celleteller, og overføre 5,0 x 10 6 ES-cellene til en 15-ml tube. Sentrifuger ved 100 xg, og resuspender cellene i 800 pl PBS. Overfør blandingen til en 4 mm kyvette.
- Tilsett 20 mikrogram mPBase Puro til kyvetten, bland ved pipettering, og electroporate celler (se avsnitt 1.4 for detaljer). Fordel de transfekterte cellene på to 100 mm-DR4 mater plater. Kultur celler O / N i ES celle medium.
- Den neste morgen, mate cellene med ES-medium med 1 ug / ml puromycin og dyrke celler i 48 timer. Uttak puromycin utvalg og fortsetter til kulturen av cellene i 5 dager. Når koloniene er store nok for plukking, plukke opp en 96-brønns mater plate (se avsnitt 4.2).
- Når de plukkede celler har nådd 80-90% konfluens, delt 1/6 th av platen inn i en DNA-plate og 1/6 th av plspiste inn i en G418 plate, slik at 2/3 rds av cellene i den opprinnelige plate som skal fryses (se avsnitt 2.2 for frysing).
- Kultur DNA plate i ES-cellemedium for senere ekstraksjon av DNA, og G418-plate i 150 ug / ml G418 for å teste for tap av neomycin resistens. Brønner uten levedyktige celler etter 72-96 timer i kultur inneholder G418 angi vellykket re-mobilisering av genet-fangst PB transposonet.
- De tilsvarende brønner i "DNA" plate vil bli screenet ved PCR for å bekrefte PB transposon har blitt fjernet. Når DNA platen er 90% konfluent, isolere genomisk DNA i 96-brønners plateformat 4 for PCR-screening for restaurering av villtype-sekvensen, og fraværet av neo-IRES som et middel til å bekrefte tilbakevending.
- Tine de samsvar brønner fra Master plate til 24-brønns plate og utvide til en T25 kolbe (alle med matere). Fryse fire ampuller per T25 kolbe som back-up.
7. generasjon av Muse Mutants - Gjenopprette resistente ES-celler fra master plater og bruke dem for embryo injeksjon for å generere chimera. 15-20 ES-celler blir injisert inn i et individ C57BL / 6 blastocyst. Transfer 15 blastocysts per mus til livmor av en pseudopregnant kvinnelig (stamme ICR). Mate den mannlige chimera (indikert av ES-celler spesifikke agouti pelsfargen) utvinnes fra kull med flere unge jomfru C57BL / 6J kvinner å teste for bakterie nettoverføring, og å bygge opp en koloni av muterte musene.
- Isolere og test hale hudfibroblaster fra F1-mutante mus og villtype kull for reaktive oksygenforbindelser (ROS) nivå og motstand mot paraquat 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I et typisk eksperiment mutagenese, omfatter transfeksjon av en total på 3 x 10 7 ES-celler med PB-UPA og MPB transposase. Tallene for gen-fanget ES-celler ble generert i to uavhengige forsøk er oppsummert i tabell 1. Effektiviteten av gen-inneslutning er omtrent 0,04%. De samlede gen-felle bibliotekene inneholder 22.400 uavhengige mutanter, om en full dekning av musen genomet (23.000 gener). Overdreven dekning kan oppnås ved å generere flere mutanter ved gjentatt mutagenese og / eller oppskalering av prosessen.
På grunn av at gen-felle bibliotekene inneholder tilfeldige mutasjoner, er det ikke mulig å forutsi det antall mutanter som har et stresstoleranse fenotype. To uavhengige valg for PQ motstand ble utført; den kombinerte screening av 22,440 uavhengige gen-mutasjoner felle avdekket 17 mutasjoner som cellulær resistens overfor PQ (0,08%) (tabell 1).
<p class = "jove_content"> Vi har renset 3 mutant kloner, den Pigl, Tiam1, og Rffl, fra master plater for videre analyse og mus produksjon. Celler med heterozygot Rffl mutasjon ble vellykket talt til å produsere homozygot avkom ved å slå ut Blm. Imidlertid klarte vi å gi noen homozygote mutanter fra Pigl og Tiam1 mutanter, antagelig på grunn av en homozygositet bundet celle dødelighet. Den stresstoleranse av disse rensede kloner ble bekreftet ved å bruke 2 forskjellige typer belastninger: utelatelse av 2-merkaptoetanol (2-ME) og PQ (figur 2). Ved å fjerne PB fra disse kloner ble assosiert stresstoleranse fenotype også mistet (figur 2), som bekrefter at de gen-felle mutasjoner er årsaksfaktor. Karakterisering av kloner utvinnes fra master platene er avgjørende som det ville utelukke stokastisk lesjon under valget stresset som årsak til den observerte fenotype.Ut av 3mutante ES-celler som blir introdusert inn i blastocyster for produksjon mus (Tabell 2), 2 linjer (Pigl og Tiam1) viser kimlinje-overføring. Den Rffl injeksjon produsert bare én kvinnelig chimera som ikke var et optimalt antall chimera til å begynne med. Således er svikt i kimlinje-overføring av Rffl sannsynlig på grunn av en inkompetent kimæren. Vi testet den cellulære fenotype av hud-fibroblaster isolert fra mutante mus Pigl og viste at de opprettholdt en redusert nivå av endogene reaktive oksygenarter (ROS) så vel som stress motstand mot PQ (figur 3).
Figur 1. ES celle mutagenese og seleksjon stress. (A) PB-UPA vektor. En objektiv polyA (UPA) felle vektor som består av en spleiseakseptor (SA), bovint veksthormon poly-adenylat-signal (pA), phosphoglycerate kinase (PGK) promoteren, neomycin fosfotransferase (neo), intern ribosomalt entry område (IRES), og et spleisedonor (SD) med kunstig ATG (i 3 forskjellige leserammer) ble klonet inn i piggyBac transposonet, flankert ved 3'- og 5 'lang terminal gjentagelse (LTR). (B) Tilfeldig mutagenese av ES-celler og seleksjon for stress-resistente kloner. ES-celler ble ko-transfektert ved elektroporering med PB-UPA og mPBase etterfulgt av belegging på 96-brønners plater. Gene fanget kloner ble selektert ved G418 resistens; gang konfluent, ble de delt inn i 2 replica sett. En kopi settet ble videre delt inn i to halv for DNA isolering og valg stress ved paraquat (PQ); den andre replikasett (master) ble frosset ned. De overlevende ES-cellekolonier utvinnes fra stress behandling ble analysert for molekylært PB innsetting av Sp-PCR. Primere ble deretter utviklet for å screene DNA-replika plate fra hvilken brønn som inneholder sibling PQ R-klon kan bli plassert på master plate. Disse cellene er for stresstoleranse analyse på ulike stressfaktorer og for mus produksjon. Modifisert fra Chick et al. 7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Stress motstand i mutante ES-celler. (A) Motstand mot 2-mercaptoethanol (2-ME) tilbaketrekking. (B) Motstand mot paraquat (PQ). Vist er de parenvilltype ES-celler (C9: gul), et slitesterkt kontroll ES-celle-klon, (4C11: rød), utvunnet fra en tidligere studie 5, og tre-gen-felle kloner (grå). Celler ble utsatt for stress behandling i to dager, hvoretter antallet levedyktige celler ble tellet. < em> Pigl, Tiam1, og Rffl heterozygotes. (PB / +: mørk grå) utstillings motstand mot begge disse stressfaktorer Rffl homozygoter (PB / PB: svart) utviser sterkere stresstoleranse i forhold til de heterozygotes. Motstand mot både stressfaktorer var tapt da PB innsett ble fjernet (+ / +: lys grå). Feilstolpene representerer standardavvik for gjennomsnitt (n = 4). * P <0.001, # P = 0,01 mellom de gene-felle kloner og villtype-foreldre C9, evaluert ved Students t-test. (C) ES celle kolonidannelse i henhold PQ (10 pM) behandling. Stress-resistente ES-kloner var i stand til å danne kolonier i kultur i henhold PQ behandling mens antallet og størrelsen av kolonier fra villtype-klonen ble betydelig redusert. Modifisert fra Chick et al. 7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Karakterisering av Pigl PB / + fibroblaster. (A) Reaktive oksygenarter (ROS) nivå. Tail hudfibroblaster isolert fra villtype (WT) og Pigl PB / + mus ble farget med CM-DCFCA og fluorescens ble normalisert mot Hoechst. ROS-innholdet ble uttrykt som relativ fluorescens-enhet (RFU). P-verdien ble bestemt ved to-halet Student t-test (n = 8). (B) PQ motstand. Tail hudfibroblaster fra villtype (WT) og Pigl PB / + mus ble eksponert for 4 mM PQ i 6 timer, hvoretter levedyktighet av cellene ble målt ved MTT-analyser. Prosentandelen av levende celler etter PQ behandling ble beregnet ved forholdet mellom absorbansen oppnådd fra PQ-behandlede cells og at fra un-behandlede celler. P-verdien ble evaluert ved en-halet Student t-test (n = 8). Modifisert fra Chick et al. 7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Bibliotek | Sub-biblioteker | ES cellestamme | Antall genet fanget klone | Antall PQ R kloner |
| 1 | C9PA01 - C9PA10 | C9 (Blm tet / tet) | 9000 | 7 |
| 2 | C9PA11 - C9PA20 | C9 (Blm tet / tet) | 13440 10 | |
| Total | 22440 | 17 |
Tabell 1. PiggyBac gen-felle bibliotek konstruksjon og utvinning av PQ resistente kloner. Modifisert fra Chick et al. 7.
| ES celleklon injisert | Antall chimera gjenvunnet | Kimlinje overføring * |
| Pigl PB / Pigl + | 4 | Ja |
| Tiam1 PB / Tiam1 + | 2 | Ja | </ tr>
| Rffl PB / Rffl + | 1 | Nei |
Tabell 2. generasjon av mus. Modifisert fra Chick et al. 7.
* Kimlinje overføringen ble bekreftet ved arv av genet-fellen allel påvist ved PCR genotyping.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vector | |||
| PB-UPA | |||
| mPBase | |||
| mPBasePuro | |||
| Tissue Culture | |||
| 500-ml Stericup filters | EMD Millipore | SCGPU05RE | |
| 250-ml Stericup filters | EMD Millipore | SCGPU02RE | |
| 50-ml Steriflip-GV filters | EMD Millipore | SE1M179M6 | |
| KO DMEM | Life Technologies | 10829-018 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| FBS | Tissue Culture Biologicals | 104 | |
| Heat Inactivated FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140148 | |
| β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Methyl Viologen dichloride (Paraquat) | Sigma-Aldrich | 856177 | |
| Dimethyl Sulphoxide Hybri-MAX | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| EmbryoMAX 0.1% gelatin | EMD Millipore | ES006B | |
| DPBS/Modified | HyClone | SH30028.02 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
| T25 Flask | Corning | 353108 | |
| T75 flask | Corning | 353135 | |
| 100-mm plate | Corning | 353003 | |
| 150-mm plate | Corning | 430599 | |
| 96-well plate | Corning | 3585 | |
| 96-well U-bottom plate | Corning | 3799 | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 50-ml reservoir | Corning | 4870 | |
| 15-ml tubes | VWR International, LLC | 82050-276 | |
| Primary Mouse Embryonic Fibroblasts | EMD Millipore | PMEF-NL | |
| DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts | Applied StemCell | ASF-1001 | |
| Mitomycin C | Fisher BioReagents | BP25312 | |
| Geneticin (G418) | Life Technologies | 11811-023 | |
| Doxycycline | Fisher BioReagents | BP26531 | |
| Cryotubes | Thermo Scientific | 377267 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 | |
| TC10 cell counter | Bio-Rad | ||
| Counting Slides (for TC10) | Bio-Rad | 1450011 | |
| Electroporation | |||
| Gene Pulser Xcell | Bio-Rad | 1652611 | |
| Gene Pulser Cuvettes (4 mm gap) | Bio-Rad | 1652088 | |
| Molecular Biology | |||
| Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercylcer ep Gradient S | |
| Puregene Core kit B | Qiagen | 158745 | |
| Topo-TA Cloning kit | Life Technologies | 450030 | |
| High Capacity cDNA synthesis kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
| NaCl | Fisher BioReagents | BP358-212 | |
| 100% ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2716 | |
| Double Processed Tissue Culture Water | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Sau3A1 | New England BioLabs | R0169L | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202T | |
| EcoRV | New England BioLabs | R3195S | |
| 96-well Lysis Buffer (Ramires-Solis et al. 1992) | |||
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher BioReagents | A144-212 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L5777 | |
| Proteinase-K | Fisher BioReagents | BP1700 | |
| Electrophoresis | |||
| Mini-Sub Cell GT | Bio-Rad | 170-4469EDU | |
| LE Agarose | GeneMate | E3120500 | |
| Ethidium Bromide | Fisher BioReagents | BP1302 | |
| 100 BP DNA Ladder | New England BioLabs | N3231S | |
| 1 Kb DNA Ladder | New England BioLabs | N3232S | |
| 2-log DNA Ladder | New England BioLabs | N3200L | |
References
- Johnson, T. E., et al. Longevity genes in the nematode Caenorhabditis elegans also mediate increased resistance to stress and prevent disease. J Inherit Metab Dis. 25, 197-206 (2002).
- Murakami, S., Salmon, A., Miller, R. A. Multiplex stress resistance in cells from long-lived dwarf mice. Faseb J. 17, 1565-1566 (2003).
- Perez, V. I., et al. The overexpression of major antioxidant enzymes does not extend the lifespan of mice. Aging Cell. 8, 73-75 (2009).
- Martin, G. M. Genetic engineering of mice to test the oxidative damage theory of aging. Ann NY Acad Sci. 1055, 26-34 (2005).
- Chick, W. S., Drechsel, D. A., Hammond, W., Patel, M., Johnson, T. E. Transmission of mutant phenotypes from ES cells to adult mice. Mamm Genome. 20, 734-740 (2009).
- Ramirez-Solis, R., et al. Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples. Anal Biochem. 201, 331-335 (1992).
- Uren, A. G., et al. A high-throughput splinkerette-PCR method for the isolation and sequencing of retroviral insertion sites. Nat Protoc. 4, 789-798 (2009).
- Wang, W., Bradley, A., Huang, Y. A piggyBac transposon-based genome-wide library of insertionally mutated Blm-deficient murine ES cells. Genome Res. 19, 667-673 (2009).
- Chick, W. S., et al. Screening for stress-resistance mutations in the mouse. Front Genet. 5, 310 (2014).
- Salmon, A. B., et al. Fibroblast cell lines from young adult mice of long-lived mutant strains are resistant to multiple forms of stress. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, 23-29 (2005).
- Skarnes, W. C., et al. A public gene trap resource for mouse functional genomics. Nat Genet. 36, 543-544 (2015).
- Baker, K. E., Parker, R. Nonsense-mediated mRNA decay: terminating erroneous gene expression. Curr Opin Cell Biol. 16, 293-299 (2004).
- Shigeoka, T., Kawaichi, M., Ishida, Y. Suppression of nonsense-mediated mRNA decay permits unbiased gene trapping in mouse embryonic stem cells. Nucleic Acids Res. 33, e20 (2004).
- Symula, D. J., Zhu, Y., Schimenti, J. C., Rubin, E. M. Functional annotation of mouse mutations in embryonic stem cells by use of expression profiling. Mamm Genome. 15, 1-13 (2004).
