Summary
Stress resistens er et af kendetegnene for lang levetid og er kendt for at være genetisk styret. Her har vi udviklet en neutral high-throughput metode til screening for mutationer, som bibringer resistens i stress ES-celler til at tilskynde musemodeller for levetiden undersøgelser.
Introduction
Holdbarhed har et intimt forhold til stress modstand. Generelt ofte langlivede arter som viser øget resistens mod flere stressfaktorer, såsom hydrogenperoxid, paraquat (PQ), UV, varme og tungmetaller 1,2. Derimod øget følsomhed over for stress tendens til at forudsige kortere levetid og / eller en mere sygdomsfri tilbøjelige fænotype. Antioxidanten fjernende pathway har længe været spekuleret at spille en vigtig rolle i giver belastningsmodstand til dyret. Men med få undtagelser, studier fra en række transgene dyr med manipulationer i forskellige anti-oxidant enzymer (f.eks SOD) indikerer, at forøgelse af størrelsen af oxidant fjernende enzymer ikke øger levetiden eller helbred span 3. Disse data tyder på, at stress resistens træk konsistent i de langlivede dyr medieres af andre cellulære veje endnu at blive afdækket.
Vi tog en fordomsfri fremadgenetiske tilgang til at identificere gener, som ved muteret, kan indebære en belastningsmodstand fænotype i dyrkede embryonale stamceller (ES-celler). ES-celler har to store fordele i denne undersøgelse: (1) avancerede genetiske manipulationer er tilgængelige til at modificere genomet af ES-celler; og (2) eventuelle stress-resistente ES-celler udvundet fra skærmen direkte kan anvendes til produktion mus, som muliggør en hurtig oversættelse til hele dyreforsøg til at måle levetid og sundhed span.
I denne rapport, vi beskrev brugen af C9 ES cellelinje, hvor BLM alleler var under kontrol af en tetracyclin lydhør element. Behandling af doxycyclin (DOX) forbigående slukket udtryk for Blm fører til øget hændelse af søsterkromatid udveksling. Denne korte sigt Blm knock-out tilladt for generering af homozygote mutationer i den heterozygote befolkning, så recessive mutationer for stress modstand kunne fanget i screeningsprocessen. Viogså beskrevet anvendelsen af piggyBac (PB) transposon som mutagen til tilfældigt indsætte en poly-A-trap kassette (PB-UPA) at mutere gener i genomet. Celler med forstyrrelse af et gen af poly-A-fælde blev G418-resistente og kunne genvindes, således at en samling af gen-trap-mutanter (gen-trap bibliotek) kunne foretages, og efterfølgende screenet for mutantkloner der var slidstærkt.
Stress-resistente kloner udvundet fra udvælgelsen kunne karakteriseres ret hurtigt ved hjælp af molekylære teknikker med hensyn til antallet af insertioner (qPCR), insertionsstedet (splinkerette PCR), identiteten af den afbrudte gen (BLAST), og dets ekspression niveau ( RT-qPCR). PB insertion kunne mobiliseres ved transient ekspression af MPB transposasen i klonen for at gendanne DNA-sekvensen vildtype og dermed teste for tab af belastningsmodstand. Disse er effektive måder at bekræfte kausalitet af mutationen, som bør gøres, indentil dyre muse produktion. Tidligere undersøgelser har vist, at celler udsat for stressfaktorer mistet deres pluripotens 4,5. Således i denne protokol, bevarelse af en replika sæt af mutant celler, som ikke ville blive behandlet med stressfaktorer er afgørende for en vellykket mus produktion.
Vores laboratorium har udviklet C9 ES-cellelinien og PB-UPA vektor, begge er til rådighed for andre forskere efter anmodning. Protokollen rapporteret her, vil begynde med dannelsen af de novo bibliotek af gen-fanget ES-celler med PB-UPA (figur 1A) efterfulgt af replikaudpladning og stress valg at isolere stress resistente kloner (figur 1B). Vi demonstrerede markeringen med paraquat, en potent frie radikaler generator i celler. Stort set enhver cytotoksisk forbindelse eller et toksin, for eksempel, ER stressfaktorer (f.eks thapsigargin og tunicamycin), neuronal oxidant (f.eks MPP +, 6-hydroxy dopamin og rotenon), varme og tungemetaller (f.eks Cd, Se), kan tilpasses til den metode til at selektere for respektive resistente mutanter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Gene-fanget ES Cell Bibliotek Byggeri Brug piggyBac Transposon
- Forbered primære muse embryonale fibroblaster (PMEF) som fødere til ES cellekultur
- Tø et hætteglas med mitomycin C-inaktiveret PMEF (5,0 x 10 6) i et 37 ° C vandbad. Overfør cellerne i 5 ml ES-celle-medium (DMEM indeholdende 15% FBS, 1.000 enheder / ml leukæmiinhiberende faktorer, 100 pM ikke-essentielle aminosyrer, 2 mM glutamin, 55 uM 2-mercaptoethanol og 25 enheder / ml penicillin / streptomycin ), og der centrifugeres ved 100 xg i 5 min.
- Aspirer supernatanten og resuspender cellerne i 30 ml ES-celle medium efterfulgt af fordeling i to T25 kolber (5 ml hver) og to 100-mm-plader (10 ml hver). Der inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2 i 24 timer.
- Kultur og udvide C9 ES-celler
- Tø et hætteglas C9 ES-celler (2,5 x 10 6 celler i 0,5 ml) i et 37 ° C vandbad og overføreceller i 5 ml ES-celle-medium. Centrifuger ved 100 x g i 5 min.
- Aspirer supernatanten og resuspender ES-celler i 5 ml ES-celle medium efterfulgt af udpladning i T25 feeder kolbe. Der inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2. Erstat ES-celle medium dagligt.
- Efter 2 dages dyrkning, bør ES-celler bliver ~ 80% sammenflydende, og er klar til at blive overført. Vask cellerne med 5 ml PBS (uden Ca2 + og Mg2 +) og derefter tilføje 2,5 ml forvarmet 0,25% trypsin-EDTA. Der inkuberes ved 37 ° C i 10 minutter. Tilføj 2,5 ml ES-celle medium at stoppe trypsin; pipettere op og ned 15 gange for at bryde op celleklumper. Centrifuger ved 100 x g i 5 min.
- Aspirer supernatanten og resuspender cellerne i 4 ml ES-celle-medium. Overføres 1 ml celler pr 100-mm-plade indeholdende 9 ml ES-celle medium; udarbejde to 100-mm plader. Dette er en 1: 8 passage. Feed cellerne dagligt med 10 ml ES-celle medium.
- Forbered 96-brønds plader for feeder biblioteket
- Som beskrevet i 1.1.1, tø tre hætteglas med mitomycin-C inaktiveret PMEF (hver indeholdende 5 x 10 6 celler) og resuspender celler fra hvert hætteglas med 33,3 ml ES-celle medium. Kombiner celler til opnåelse af en 100-ml cellesuspension.
- Plade 100 celler pi per brønd på ti 96-brønds plader. Disse 96-brønds feeder-plader bør være forberedt mindst en dag før transfektion C9 ES-celler med PB transposon.
- Elektroporering af C9 ES-celler med PB-UPA vektor
- Trypsinisér og tælle de ekspanderede C9 ES-celler under anvendelse af en automatiseret celletæller. Vask hver 100 mm plade C9 ES-celler med 10 ml PBS. Tilsæt 8 ml forvarmet 0,25% trypsin-EDTA og inkuberes ved 37 ° C i 10 minutter.
- Stop trypsin ved tilsætning af 2 ml ES-celle-medium. Overfør cellesuspensionen til 15 ml rør og pipette op og ned 15 gange for at bryde ud celleklumper. Umiddelbart centrifugeres ved 100 xg i 5 minutter efterfulgt af opsugning af supernatanten.
- Resuspender celles i 10 ml ES-celle-medium og tæl ES-celler under anvendelse af et hæmocytometer. Forbered seks 15 ml rør cellesuspension hver indeholdende 5 x 10 6 ES-celler. Centrifuger ved 100 x g i 5 min. Aspirer supernatanten og resuspender hver cellepellet i 0,8 ml PBS.
- Forbered seks elektroporation kuvetter (4 mm gap), som 0,8 ml cellerne overføres. Til hver kuvette, tilsættes 1 pg PB-UPA og 20 pg MPB transposasen (mPBase); bland forsigtigt ved pipettering op og ned. Sæt kuvetterne på is. Udfør elektroporering med en elektroporator hjælp af eksponentielle indstilling ved 250 V, 500 uF og uendelig ohm.
BEMÆRK: Typisk er tidskonstanten ca. 10 til 12 msek for en vellykket elektroporering, som giver omkring 1.500 til 2.000 G418-resistente transformanter pr 5 x 10 6 celler. - Hente og samle de transficerede celler til en T75 kolbe, der indeholdt 98 ml ES-celle-medium. Bland cellerne ved forsigtig pipettering og derefter overføre cellerne til et reservoir (50 ml). Osing en 12-kanals pipette 100 pi celler pr til den tidligere fremstillede 96-brønds fødepladerne (10 i alt). Der inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2.
- Efter 24 timer, fodre cellerne dagligt med frisk ES-celle-medium indeholdende G418 (150 ug / ml) for at selektere for gen-fanget kloner.
BEMÆRK: Typisk hver brønd vil indeholde omkring ti G418-resistente kolonier. Når disse kolonier vokse til tilstrækkelig størrelse (typisk 5-7 dage), vil de 96 brønde (bibliotekets) blive gentaget i 2 sæt til opbevaring og udvælgelse, hhv. Hver plade i biblioteket er udpeget som "sub-bibliotek", så i dette tilfælde, der er 10 sub-biblioteker.
2. Bibliotek Replication
- Repliker Master plader
- 24-48 timer før G418 resistente kolonier nå 50-60% konfluens, tø yderligere tre hætteglas med mitomycin C-inaktiveret PMEF på ti 96-brønds plader som foderautomater (se afsnit 1.3). Gelatineize ti 96-brønds plader ved at inkubere 0,1% gelatine (100 pl / brønd) ved 37 ° C i mindst 15 - 30 minutter; O / N inkubering er acceptabel.
- Forbered enkelte cellesuspensioner i 96-brønds plader ved trypsinisering. Aspirer medium fra 96-brønds plader og vask en gang med samme volumen PBS (uden Ca2 +, Mg2 +). Der tilsættes 50 pi foropvarmede 0,25% trypsin-EDTA, inkuber ved 37 ° C i 5% CO2 i 10 min. Stop trypsin med 50 pi ES-celle medium. Bryde ud af celleklumper ved pipettering op og ned 15 gange med multikanalpipette.
- Transfer 50 pi trypsiniseret cellesuspension til den tilsvarende række af fødepladen (Master) allerede indeholder 150 pi ES-celle-medium og de resterende 50 pi til den tilsvarende række af gelatinerede plade (replika) allerede indeholder 150 pi ES-celle-medium. Trin gentages for hver række af celler til en Master og replika plade. Inkubér pladerne (der nu indeholder en 200 pi cULTUR volumen) ved 37 ° C, 5% CO 2 O / N.
BEMÆRK: Der er nu tyve 96-brønds plader. - Den næste dag fodre cellerne med 100 gl frisk ES-celle-medium indeholdende 150 ug / ml G418. Udskift mediet dagligt, indtil brøndene er 80-90% sammenflydende.
- Frys Master plader
- Når master plader er omkring 80% sammenflydende, Trypsinisér cellerne som beskrevet (se afsnit 2.1.2).
- Fjern pladerne og trypsin omsætning med 50 pi 2x frysemedium (60% ES-celle medium, 20% FBS, 20% DMSO) stoppe. Pipette op og ned 10 gange med en multikanalpipette at sikre korrekt blanding af indefrysning medium.
- Sæt 96-brønds plader i en tæt forseglet boks styrofoam og placere den i -80 ° C fryser i op til fire måneders lagring. Fire måneder vil give tilstrækkelig tid til at gennemføre valget stress og til at identificere, hvilke brønde fra Master pladen indeholder kloner af interesse.
BEMÆRK: Opbevaring ved -80 & #176; C længere end 4 måneder vil resultere i fald i cellelevedygtighed. Man kan udnytte kryo-rør i 96-brønds format, der kan lagres i dampfasen af flydende nitrogen til længere tids opbevaring.
- Forbered DNA plader og sub-bibliotek puljer fra replika plader
- 24-48 timer før replikere yderligere til DNA plader og sub-bibliotek puljer, forberede ti 100-mm plader med mitomycin C-inaktiveret PMEF for sub-biblioteket pool og ti gelatineret 96-brønds plader for DNA pladen replikater. Se afsnit 1.3 til almindelig procedure.
- Trypsinisér cellerne i de 96 brønde replika-plader (se afsnit 2.1.2). Under 10 min trypsinisering trin Aspirer gelatine fra DNA plader og erstat med 150 pi ES-celle-medium indeholdende G418 (150 ug / ml). Også forberede et reservoir indeholdende 5 ml ES-celle medium for sammenlægning af de "sub-bibliotekernes ind i 100-mm feeder plade.
- Efter trypsinisering, holder prøvepsin med 50 pi ES-celle medium én række ad gangen ved hjælp af en 12-kanals pipette. Pipette op og ned 10 gange for at bryde ud celleklumper.
- Transfer 50 pi af cellesuspensionen til den tilsvarende række af DNA pladen og overføre de resterende 50 pi til reservoiret indeholdende 5 ml ES-celle-medium. Efter at have afsluttet en fuld 96-brønds plade, aspireres mediet af en 100 mm fødepladen hvortil de samlede celler overføres. Disse samlede mutageniserede celler betegnes som en "sub-biblioteket '.
- Gentag for de resterende ni 96-brønds plader. Feed 96 brønds-plader og DNA 100 mm poolet "underbibliotek 'plader dagligt med ES-celle-medium indeholdende G418 (150 ug / ml).
BEMÆRK: Der er nu ti 96-brønd 'DNA' plader, og ti 100-mm 'sub-bibliotek' plader.
- Frys DNA plader. Når cellerne i DNA pladen er 80-90% sammenflydende, aspireres mediet, vaskes cellerne to gange med 100pi PBS og opbevares ved -20 ° C til senere genomisk DNA-isolering 6. Disse DNA plader vil blive screenet ved PCR at identificere, hvilke svarer godt i "Master" plade indeholder klon af interesse.
3. doxycyclin-induceret Homozygote mutanter
- Frys sub-bibliotek pools og passage celler til doxycyclin behandling
- 24 timer forud for de 100 mm 'sub-bibliotek' plader med kolonier store nok til at give 70-80% konfluens, udarbejde et sæt af ti gelatinerede 100-mm plader til doxycyclin behandling.
- Forbered enkelt celle suspensioner af hver sub-bibliotek (se afsnit 1.4.1 og 1.4.2 for detaljer). Overførsel 5 x 10 6 celler til den gelatinerede 100-mm-plade med doxycyclin (1 ug / ml); Der inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2. Frys resterende ikke-doxycyclin behandlede underbibliotek puljer med 5 x 10 6 celler pr hætteglas.
- Passage celler i nærværaf doxycyclin til at slå ud Blm
- Passage af underbiblioteker ved 1: 8 hver 2-3 dage i nærvær af doxycyclin (1 ug / ml) i op til to uger, i hvilket tidsrum DOX-induceret knock-out af Blm vil fremme tab af heterozygositet i cellen befolkning, mulighed for at generere homozygotiske mutanter.
4. Stress Valg og Isolering af resistente kloner
- Subject doxycyclin-behandlede celler til stress udvælgelse
- 24 timer før passage doxycyclin behandlede celler mod stress udvælgelse, forberede ti gelatineret 150 mm plader, sted i en 37 ° C, 5% CO2 befugtet inkubator.
- Forbered en enkelt celle suspension af hver sub-bibliotek ved trypsinisering (se afsnit 1.4.1 og 1.4.2 for detaljer). Seed 6.6 x 10 6 celler på hver 150 mm plade i 30 ml totalt volumen kultur, distribuere celler jævnt. Inkuber celler med stressor (10 pM paraquat eller undladelse af β-mercaptoethanol,i ES-celle-medium indeholdende 7,5% varmeinaktiveret FBS) i 7 dage, hvorefter erstatte med normal ES-celle-medium for at tillade overlevende celler at vokse ind kolonier til plukning.
- Valgfrit: Frys venstre løbet doxycyclin-behandlede celler på 5,0 x 10 6 celler pr hætteglas.
- Pick stress-resistente kolonier
- Efter at genindføre normale medier til en uge, observere, hvordan mange stress resistente kolonier er til stede. Afhængigt af antallet af kolonier, der skal plukkes, forberede nok brønde med mitomycin C-inaktiveret PMEF på 96-brønds plader en dag på forhånd i overensstemmelse hermed (se afsnit 1.1 for detaljer).
- På dagen for plukning, aspireres og erstatte medium i 96-brønds plade med feeder 100 pi frisk ES-celle medium, placere tilbage i 37 ° C, 5% CO2 befugtet inkubator. På dette tidspunkt, udarbejde en U-bund 96 brønd plade med 50 pi 0,25% trypsin-EDTA per brønd. Aspirer medium fra 150-mm stress valg plade og tilføje eQual volumen af PBS.
- Sæt mikropipette til 2 pi og "pick" overlevende kolonier i U-bund trypsin indeholdende brønde, picking en koloni per brønd. Det er acceptabelt at lade pladen sidde ved stuetemperatur, indtil det ønskede antal kolonier er blevet samlet. Derefter inkuberes U bundplade ved 37 ° C, 5% CO2 i 10 minutter.
BEMÆRK: Typisk tager vi 1 time at plukke 96 kolonier. - Stop trypsin reaktion én række ad gangen med 50 pi ES-celle medium ved anvendelse af en multikanalpipette. Pipette op og ned 15 gange for at opnå en enkelt cellesuspension og overføre 100 pi celler til den tilsvarende række af fødepladen allerede indeholder 100 pi ES-celle-medium. Fuldføre overførslen for hele pladen. Kultur celler O / N i 200 pi. Den næste morgen, aspireres medium og erstatte med 100 pi ES-celle medium.
- Replikere 96-brønds plader
- Når brøndene i de plukkede kolonier er 80-90% confluent, replikere i to matchende plader, en for DNA-isolering og den anden for celler back-up. Disse plader er gelatiniseret og ikke indeholder mitomycin C-inaktiveret PMEF.
- Aspirer medium, og vask med 100 pi PBS. Der tilsættes 50 pi 0,25% trypsin-EDTA til hver brønd, inkuberes ved 37 ° C i 10 minutter. Stop trypsin med 150 pi ES-celle medium, blandes ved pipettering, og overføre 100 pi cellesuspension til den tilsvarende række af to 96-brønds plader. Skift medium hver dag.
- Når pladerne er 80-90% sammenflydende, fryse et sæt plader som en "back-up" (se afsnit 2.2 for detaljer). Det andet sæt af plader er yderligere udvidet som beskrevet nedenfor.
- Ekspanderende celler til genomisk DNA-isolering
- Forbered en enkelt celle suspension i 96 brønde DNA plade (se 2.1.2 for detaljer).
- Overførsel cellesuspension fra hver enkelt brønd i 96-brønds plade til brønd i en plade med 24 brønde (4 i alt) ved anvendelse af en MICRopipette. Sørg for der er ingen krydskontaminering af eventuelle celler, som "plukket" kolonier "klonal« oprindelse. Kultur celler i 0,5 ml ES-celle medium, skiftende medium dagligt indtil brønde er 80-90% sammenflydende.
BEMÆRK: Den 24-brønds plade vil give tilstrækkelig udbytte af genomisk DNA for PCR-analyse.
5. Identifikation af PB Skillearks- steder og fanget Gener
- Genomisk DNA isoleret fra 24-brønds plade: Lyser celler i 24-brønds plade og isolere RNA-fri genomisk DNA.
- Udfør Splinkerette PCR (SpPCR) for at generere sekvensfragmenter flankerer PB transposon integration sted som beskrevet 7,8.
BEMÆRK: SpPCR er en fem dages proces, selv om hands-on tid hver dag er minimal.
6. Genetisk analyse af mutantklonerne
- Find mester godt og rense klon af interesse.
- Når PB integration site har væretkortlagt, designe en fremadrettet primer opstrøms af integrationen webstedet at bruge med en PB revers primer (f.eks PB3'-1) 8 og screene DNA plade, der svarer til den samme "sub-biblioteket 'hvorfra stress resistent klon blev plukket. Forvente at finde kun én positiv godt på tværs af hele 96 brønde DNA plade. Tø netop godt fra "Master 'plade til en 24-brønds plade på foderautomater og vokse celler indtil 80-90% konfluens.
BEMÆRK: På dette tidspunkt, denne brønd indeholder en blanding af gen-fanget kloner. - Når 24-brønds plade er 80-90% sammenflydende, Trypsinisér cellerne og pladen 1.000 ES-celler i en 100 mm fødepladen (sikre enkelt cellesuspension). Passage de resterende celler til en T25 kolben på fødere til ekspansion. Frys cellerne fra T25 kolbe, når kolonier 80-90% sammenflydende. Frys 4 hætteglas pr T25 kolbe som back-ups.
- Tillad kolonierne at vokse i 7 dage og derefter gå 96 kolonier i en 96-brønds feeder plade. Se afsnit 4.2 til plukning procedure. Repliker pladen når du er klar til en "DNA" plade og fryse den anden som "2. -Master 'plade (se afsnit 2.2 til frysning).
- Tillad kolonier for at nå 80-90% konfluens. Screen DNA pladen at finde brønde indeholdende det oprensede klon af interesse. Expand celler fra 96 brønde 2. -Master pladen med 24 brønde og derefter til en T25 kolbe (alle på foderautomater). Frys 4 hætteglas pr T25 kolbe.
BEMÆRK: På dette tidspunkt, som genet fanget cellelinie er klonal, har ikke været udsat for stressor, og er egnet til produktion mus.
- Når PB integration site har væretkortlagt, designe en fremadrettet primer opstrøms af integrationen webstedet at bruge med en PB revers primer (f.eks PB3'-1) 8 og screene DNA plade, der svarer til den samme "sub-biblioteket 'hvorfra stress resistent klon blev plukket. Forvente at finde kun én positiv godt på tværs af hele 96 brønde DNA plade. Tø netop godt fra "Master 'plade til en 24-brønds plade på foderautomater og vokse celler indtil 80-90% konfluens.
- Bestem antallet af PB indsættelse: optøs et hætteglas af stress resistent cellelinje og udvide cellerne i en gelatineret T25 kolbe. Isoler genomisk DNA og kontrollere, om kopiantallet af PB transposon. Dette kan opnås ved qPCR målretning neomycingenet.
- Mål genekspressionsniveau: Efter konfirming der er en enkelt PB integrationshændelse i cellelinjen af interesse, måle niveauet for ekspression af genet fanget ved hjælp af RT-qPCR anvendelse af specifikke Taqman prober til hvert gen.
- Sekventere mutant mRNA: generere et cDNA amplicon ved PCR under anvendelse af en opstrøms primer annealing til en exon og en nedstrøms primer annealing til splejsningsacceptorsekvens af genet fælde kassetten. Sequence cDNA-fragmentet for at bekræfte, at den forventede splejsning forekommer i fanget genet.
- Remobilisere den piggyBac transposonet at teste for årsagssammenhæng mellem fanget gen og stress modstand.
- 24-48 timer før optøning celler til PB remobilisering, tø og plade DR4 foderautomater på en T25 kolbe og to 100-mm plader. Mindst én dag efter DR4 foderautomater udplades på T25 kolbe, optø et hætteglas af cellelinien indeholdende PB indsættelse og pladen cellerne i T25 kolbe indeholdende DR4 foderautomater. Grow cellerne i ES-celle mediumfor 48 timer, skiftende medium dagligt.
- Der fremstilles en enkelt cellesuspension af ES-celler. Tæl cellerne med en automatiseret celletæller og overføre 5,0 x 10 6 ES-celler til en 15-ml rør. Der centrifugeres ved 100 xg, og cellerne resuspenderes i 800 pi PBS. Overfør suspensionen til et 4 mm kuvette.
- Tilføj 20 ug mPBase Puro til kuvetten, bland ved pipettering, og elektroporere celler (se afsnit 1.4 for detaljer). Fordel de transficerede celler på to 100-mm DR4 fødepladerne. Kultur celler O / N i ES-celle medium.
- Den næste morgen, fodre cellerne med ES-medium med 1 ug / ml puromycin og kultur-celler i 48 timer. Træk puromycinselektion og fortsætte med at dyrke cellerne i 5 dage. Når kolonierne er store nok til plukning, pick i en 96-brønds plade feeder (se afsnit 4.2).
- Når de plukkede cellerne har nået 80-90% konfluens, opdeles 1/6 th af pladen i en DNA plade og 1/6 th af plspiste i en G418 plade, der forlader 2/3 rds af cellerne i den oprindelige plade, der skal fryses (se afsnit 2.2 til frysning).
- Kultur DNA plade i ES-celle-medium til senere DNA-isolering, og G418 plade i 150 ug / ml G418 for at teste for tab af neomycinresistens. Brønde uden levedygtige celler efter 72-96 timer i kultur indeholdende G418 indikerer vellykket remobilisering af genet-fældefangst PB transposonen.
- De tilsvarende brønde i "DNA" plade vil blive screenet ved PCR for at bekræfte PB transposonet er blevet fjernet. Når DNA pladen er 90% sammenflydende, isolere genomiske DNA i 96-brønds pladeformat 4 til PCR-screening for genoprettelse af vildtypesekvensen og fraværet af neo-IRES som et middel til at bekræfte reversion.
- Optø matchende brønde fra Master pladen til 24-brønds plade og udvide til en T25 kolbe (alle med foderautomater). Frys fire hætteglas pr T25 kolbe som back-up.
7. generation af Mouse mutanter - Recover resistente ES-celler fra master plader og bruge dem til embryo injektion for at generere kimære. Omkring 15-20 ES-celler injiceres i et individ C57BL / 6 blastocyst. Overførsel 15 blastocyster pr mus til livmoderen af en pseudogravid kvindelig (stamme ICR). Mate den mandlige kimære (angivet med ES-celler specifikke agouti pelsfarve) udvundet fra kuldet med flere unge jomfruelige C57BL / 6J hunner til at teste for kim-line transmission, og til at opbygge en koloni af mutant mus.
- Isolere og test hale hudfibroblaster fra F1 mutante mus og vildtype kuld for reaktive oxygenarter plan og modstandsdygtighed (ROS) for paraquat 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I et typisk eksperiment mutagenese, transfektionen består af i alt 3 x 10 7 celler med ES PB-UPA og MPB transposasen. Antallet af gen-fanget ES-celler genereret i to uafhængige forsøg er opsummeret i tabel 1. Effektiviteten af gen-indfangning er ca. 0,04%. De kombinerede gen-trap-biblioteker indeholder 22.400 uafhængige mutanter, omkring en fuld dækning af musegenomet (23.000 kodning gener). Overdreven dækning kan opnås ved at generere flere mutanter ved gentagen mutagenese og / eller opskalering af processen.
Fordi genet-trap biblioteker indeholder tilfældige mutationer, er det ikke muligt at forudsige antallet af mutanter, som har et belastningsmodstand fænotype. To uafhængige valg for PQ resistens blev udført; den kombinerede screening af 22,440 uafhængige gen-trap mutationer afdækket 17 mutationer, som giver resistens over for cellulære PQ (0,08%) (tabel 1).
<p class = "jove_content"> Vi har renset 3 mutant-kloner, det Pigl, Tiam1, og Rffl, fra master plader til yderligere analyse og produktion mus. Celler med heterozygot Rffl mutation lykkedes induceret til at producere homozygot afkom ved at slå ud Blm. Mislykkedes Men vi at have nogen homozygote mutanter fra Pigl og Tiam1 mutanter, formentlig på grund af en homozygositet-linked celle dødelighed. Stress modstand af disse oprensede kloner blev bekræftet ved hjælp af 2 forskellige typer stressfaktorer: udeladelse af 2-mercaptoethanol (2-ME) og PQ (figur 2). Efter fjernelse af PB fra disse kloner blev den tilhørende stress resistensfænotype også tabt (figur 2), hvilket bekræfter, at genet-trap mutationer er den kausale faktor. Karakterisering af genvundne fra master plader klonerne er afgørende, da det ville udelukke stokastisk læsion under stress valg som årsag til den observerede fænotype.Ud af 3mutante ES-celler, der indføres i blastocyster for muse produktion (Tabel 2), 2 linjer (Pigl og Tiam1) viser kimlinjeoverførsel. Den Rffl injektion producerede kun én kvindelig kimære, som ikke var et optimalt antal kimære til at begynde med. Således skyldes sandsynligvis en inkompetente kimære svigt af kønscelleoverførsel af Rffl. Vi testede den cellulære fænotype af hudfibroblaster isoleret fra Pigl mutantmus og viste, at de vedligeholdes reduceret niveau af endogene reaktive oxygenarter (ROS) samt stress resistens over for PQ (figur 3).
Figur 1. ES-celle mutagenese og stress valg. (A) PB-UPA vektor. En fordomsfri polyA (UPA) fælde vektor bestående af en splejsningsacceptor (SA), bovint væksthormon poly-adenylat signal (PA) phosphoglycerate kinase (PGK) -promotoren, neomycin phosphotransferase (neo), internt ribosomalt indgangssted (IRES) og et splejsningsdonor (SD) med kunstig ATG (i 3 forskellige læserammer) blev klonet ind i piggyBac transposonet, flankeret af 3' og 5 gentagelse 'lange terminale (LTR). (B) tilfældig mutagenese af ES-celler og selektion for stress-resistente kloner. ES-celler blev co-transficeret ved elektroporering med PB-UPA og mPBase efterfulgt af udpladning på plader med 96 brønde. Gen fanget kloner blev selekteret ved G418-resistens; når sammenflydende, blev de opdelt i 2 replika sæt. Én replika sæt blev yderligere opdelt i to halve til DNA isolation og stress udvælgelse af paraquat (PQ); den anden replika sæt (master) var frosset ned. De overlevende ES celle kolonier udvundet fra stress behandling blev analyseret molekylært for PB indsættelse af Sp-PCR. Primere blev derefter beregnet til at screene replika DNA pladen hvorfra brønden indeholdende sibling PQ R klon kunne være placeret på master pladen. Disse celler er for belastningsmodstand assay på forskellige stressfaktorer og til produktion mus. Modificeret fra Chick et al. 7. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Stress resistens i mutante ES-celler. (A) Resistens over for 2-mercaptoethanol (2-ME) tilbagetrækning. (B) Modstandsdygtighed over for paraquat (PQ). Vist er de parentale vildtype-ES-celler (C9: gul), en stress-resistente kontrol ES celleklon, (4C11: rød), udvundet fra en tidligere undersøgelse 5, og tre-gen-trap-kloner (grå). Celler blev udsat for stress behandling i to dage, hvorefter antallet af levedygtige celler blev talt. < em> Pigl, Tiam1 og Rffl heterozygoter. (PB / +: mørkegrå) udviser resistens over for begge disse stressfaktorer Rffl homozygoter (PB / PB: sort) udviser stærkere stress modstand i forhold til de heterozygote. Resistens over for både stressfaktorer blev tabt, når PB insertioner blev fjernet (+ / +: lysegrå). Fejlsøjler repræsenterer SD af den gennemsnitlige (n = 4). * P <0,001, # P = 0,01 mellem gen-trap kloner og vildtype forældrenes C9, vurderet ved Student t-test s. (C) ES-celle kolonidannelse under PQ (10 uM) behandling. Stress-resistente ES-kloner var i stand til at danne kolonier i kultur under PQ behandling, mens antallet og størrelsen af kolonier fra vildtype-klonen blev væsentligt reduceret. Modificeret fra Chick et al. 7. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Karakterisering af Pigl PB / + fibroblaster. (A) reaktive oxygenarter (ROS) niveau. Tail hudfibroblaster isoleret fra vildtype (WT) og Pigl PB / + mus blev farvet med CM-DCFCA og fluorescensen blev normaliseret mod Hoechst. Den ROS Indholdet blev udtrykt som relativ fluorescens enhed (RFU). Den P-værdi blev vurderet ved tosidet Student t-test er (n = 8). (B) PQ modstand. Tail hudfibroblaster fra vildtype (WT) og Pigl PB / + mus blev udsat for 4 mM PQ i 6 timer, hvorefter levedygtigheden af cellerne blev målt ved MTT-assays. Procentdelen af levende celler efter PQ behandling blev beregnet som forholdet mellem absorbansen opnået fra PQ-behandlede ceLLS og fra FN-behandlede celler. P-værdien blev evalueret af en tailed Students t-test (n = 8). Modificeret fra Chick et al. 7. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Bibliotek | Sub-biblioteker | ES-celle-stamme | Antal gen fanget klon | Antal PQ R kloner |
| 1 | C9PA01 - C9PA10 | C9 (Blm tet / tet) | 9.000 | 7 |
| 2 | C9PA11 - C9PA20 | C9 (Blm tet / tet) | 13.440 10 | |
| Total | 22.440 | 17 |
Tabel 1. PiggyBac gen-trap bibliotek konstruktion og inddrivelse af PQ-resistente kloner. Modificeret fra Chick et al. 7.
| ES celleklon injiceret | Antal kimære genvundet | Kønscelleoverførsel * |
| Pigl PB / Pigl + | 4 | Ja |
| Tiam1 PB / Tiam1 + | 2 | Ja | </ tr>
| Rffl PB / Rffl + | 1 | Ingen |
Tabel 2. Generering af mus. Modificeret fra Chick et al. 7.
* Kønscelleoverførsel blev bekræftet ved arv af genet-trap-allelen påvist ved PCR genotypning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vector | |||
| PB-UPA | |||
| mPBase | |||
| mPBasePuro | |||
| Tissue Culture | |||
| 500-ml Stericup filters | EMD Millipore | SCGPU05RE | |
| 250-ml Stericup filters | EMD Millipore | SCGPU02RE | |
| 50-ml Steriflip-GV filters | EMD Millipore | SE1M179M6 | |
| KO DMEM | Life Technologies | 10829-018 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| FBS | Tissue Culture Biologicals | 104 | |
| Heat Inactivated FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140148 | |
| β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Methyl Viologen dichloride (Paraquat) | Sigma-Aldrich | 856177 | |
| Dimethyl Sulphoxide Hybri-MAX | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| EmbryoMAX 0.1% gelatin | EMD Millipore | ES006B | |
| DPBS/Modified | HyClone | SH30028.02 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
| T25 Flask | Corning | 353108 | |
| T75 flask | Corning | 353135 | |
| 100-mm plate | Corning | 353003 | |
| 150-mm plate | Corning | 430599 | |
| 96-well plate | Corning | 3585 | |
| 96-well U-bottom plate | Corning | 3799 | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 50-ml reservoir | Corning | 4870 | |
| 15-ml tubes | VWR International, LLC | 82050-276 | |
| Primary Mouse Embryonic Fibroblasts | EMD Millipore | PMEF-NL | |
| DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts | Applied StemCell | ASF-1001 | |
| Mitomycin C | Fisher BioReagents | BP25312 | |
| Geneticin (G418) | Life Technologies | 11811-023 | |
| Doxycycline | Fisher BioReagents | BP26531 | |
| Cryotubes | Thermo Scientific | 377267 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 | |
| TC10 cell counter | Bio-Rad | ||
| Counting Slides (for TC10) | Bio-Rad | 1450011 | |
| Electroporation | |||
| Gene Pulser Xcell | Bio-Rad | 1652611 | |
| Gene Pulser Cuvettes (4 mm gap) | Bio-Rad | 1652088 | |
| Molecular Biology | |||
| Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercylcer ep Gradient S | |
| Puregene Core kit B | Qiagen | 158745 | |
| Topo-TA Cloning kit | Life Technologies | 450030 | |
| High Capacity cDNA synthesis kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
| NaCl | Fisher BioReagents | BP358-212 | |
| 100% ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2716 | |
| Double Processed Tissue Culture Water | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Sau3A1 | New England BioLabs | R0169L | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202T | |
| EcoRV | New England BioLabs | R3195S | |
| 96-well Lysis Buffer (Ramires-Solis et al. 1992) | |||
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher BioReagents | A144-212 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L5777 | |
| Proteinase-K | Fisher BioReagents | BP1700 | |
| Electrophoresis | |||
| Mini-Sub Cell GT | Bio-Rad | 170-4469EDU | |
| LE Agarose | GeneMate | E3120500 | |
| Ethidium Bromide | Fisher BioReagents | BP1302 | |
| 100 BP DNA Ladder | New England BioLabs | N3231S | |
| 1 Kb DNA Ladder | New England BioLabs | N3232S | |
| 2-log DNA Ladder | New England BioLabs | N3200L | |
References
- Johnson, T. E., et al. Longevity genes in the nematode Caenorhabditis elegans also mediate increased resistance to stress and prevent disease. J Inherit Metab Dis. 25, 197-206 (2002).
- Murakami, S., Salmon, A., Miller, R. A. Multiplex stress resistance in cells from long-lived dwarf mice. Faseb J. 17, 1565-1566 (2003).
- Perez, V. I., et al. The overexpression of major antioxidant enzymes does not extend the lifespan of mice. Aging Cell. 8, 73-75 (2009).
- Martin, G. M. Genetic engineering of mice to test the oxidative damage theory of aging. Ann NY Acad Sci. 1055, 26-34 (2005).
- Chick, W. S., Drechsel, D. A., Hammond, W., Patel, M., Johnson, T. E. Transmission of mutant phenotypes from ES cells to adult mice. Mamm Genome. 20, 734-740 (2009).
- Ramirez-Solis, R., et al. Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples. Anal Biochem. 201, 331-335 (1992).
- Uren, A. G., et al. A high-throughput splinkerette-PCR method for the isolation and sequencing of retroviral insertion sites. Nat Protoc. 4, 789-798 (2009).
- Wang, W., Bradley, A., Huang, Y. A piggyBac transposon-based genome-wide library of insertionally mutated Blm-deficient murine ES cells. Genome Res. 19, 667-673 (2009).
- Chick, W. S., et al. Screening for stress-resistance mutations in the mouse. Front Genet. 5, 310 (2014).
- Salmon, A. B., et al. Fibroblast cell lines from young adult mice of long-lived mutant strains are resistant to multiple forms of stress. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, 23-29 (2005).
- Skarnes, W. C., et al. A public gene trap resource for mouse functional genomics. Nat Genet. 36, 543-544 (2015).
- Baker, K. E., Parker, R. Nonsense-mediated mRNA decay: terminating erroneous gene expression. Curr Opin Cell Biol. 16, 293-299 (2004).
- Shigeoka, T., Kawaichi, M., Ishida, Y. Suppression of nonsense-mediated mRNA decay permits unbiased gene trapping in mouse embryonic stem cells. Nucleic Acids Res. 33, e20 (2004).
- Symula, D. J., Zhu, Y., Schimenti, J. C., Rubin, E. M. Functional annotation of mouse mutations in embryonic stem cells by use of expression profiling. Mamm Genome. 15, 1-13 (2004).
