Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Вперед генетический подход к Раскройте стрессоустойчивости генов в мышах - высокой пропускной экране в ЭС клетках

Published: November 11, 2015 doi: 10.3791/53062
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cell and Developmental Biology, University of Colorado Denver

Summary

Стрессоустойчивость является одним из признаков долголетия и, как известно, генетически регулируется. Здесь мы разработали метод объективную высокой пропускной для выявления мутаций, которые придают устойчивость к стрессам в ЭС клеток для разработки модели мыши для долголетия исследований.

Introduction

Стаж имеет интимные отношения с стрессоустойчивости. В общем, долгоживущие виды часто демонстрируют повышенную устойчивость к нескольким стрессовых, таких как перекись водорода, паракват (PQ), УФ, тепла и тяжелых металлов 1,2. В противоположность этому, повышенная чувствительность к стрессу, как правило, предсказать сокращению срока службы и / или более фенотип болезни подверженных. Антиоксидант вывоз мусора путь уже давно предположили, играть важную роль в придании стрессоустойчивость животному. Тем не менее, с некоторыми исключениями, исследования из различных трансгенных животных с манипуляциями в различных антиокислительных ферментов (например, SOD) показывают, что увеличение уровня окислительных ферментов, поглощающих не увеличивает продолжительность жизни или здоровья продолжительность 3. Эти данные позволяют предположить, что стресс признак устойчивости последовательно наблюдается в долгоживущих животных посредничестве других клеточных путей еще не обнаружили.

Мы взяли объективную впередгенетический подход к идентификации генов, которые при, мутировал, может придать стрессоустойчивости фенотип в культуре эмбриональных стволовых (ЭС) клеток. ЭС клетки предлагают два основных преимущества в этом исследовании: (1) сложные генетических манипуляций можно изменить геном ЭС клеток; и (2) любые устойчивые стресс ЭС клетки, выделенные из экрана могут быть непосредственно использованы для производства мыши, позволяя быстро перевод на целых исследований на животных для измерения продолжительности жизни и здоровья промежуток.

В этом докладе мы описали использование клеточной линии ES С9, в котором BLM аллелей под контролем с помощью тетрациклину элемента. Лечение доксициклина (DOX) временно отключен выражение Blm ведущую к увеличению инцидента сестра хроматид обмена. Эта краткосрочная BLM нокаут, разрешенных для производства гомозиготных мутаций в популяции гетерозиготного так, что рецессивные мутации для стрессоустойчивости может быть захвачен в процессе отбора. МыТакже описано применение PiggyBac (PB) транспозона мутагенеза случайно вставить поли-ловушка кассету (ПБ-УПА) мутировать генов в геноме. Клетки с нарушением гена, по поли-ловушка стал резистентные к G418, и могут быть восстановлены, так что совокупность генов ловушки мутантов (библиотеки генов-ловушка) может быть, а затем скрининг на мутант клонов, которые были устойчивы стресса.

Стресс резистентные клоны, выделенные из выбора можно охарактеризовать достаточно быстро с помощью молекулярных методов в отношении числа вставок (КПЦР), сайт инсерции (splinkerette ПЦР), идентичность нарушенного гена (BLAST), и его уровень экспрессии ( RT-КПЦР). Вставка РВ может быть remobilized по временной экспрессии MPB транспозазы в клоне, чтобы восстановить последовательность ДНК дикого типа и, таким образом проверить за потерю стрессоустойчивости. Эти мощные способы, чтобы подтвердить причинно-следственную связь мутации, которые должны быть сделаны додорогим производства мыши. Предыдущие исследования показали, что клетки подвергаются стресс-утратили плюрипотентности 4,5. Таким образом, в этом протоколе, сохранение набора реплик мутантных клеток, которые не будут обращаться с стресса является критическим для успешного производства мыши.

Наша лаборатория инженерии линии клеток C9 ES и вектор ПБ-УПА, и доступны для других исследователей по запросу. Протокол сообщил здесь начнется генерацией De Novo библиотеки генов-ловушке ЭС клеток с PB-УПА (рис 1А), с последующим реплик и выбор напряжения для изоляции стресс устойчивых клонов (Рис 1b). Мы показали, выделение параквату, мощного генератора свободных радикалов внутри клетки. Практически любая цитотоксического соединения или токсин, например, ER стресс-(например, тапсигаргин и туникамицина), нейронная окислителем (например, МРР +, 6-гидрокси допамина и ротенон), тепло, и тяжелаяметаллы (например, Cd, Se), могут быть адаптированы к способу для отбора соответствующих устойчивых мутантов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Джин-ловушке ES сотовый Библиотека Строительство Использование PiggyBac транспозонов

  1. Подготовка первичных эмбриональных фибробластов мыши (ПМЭФ) в качестве питателей для ES культуре клеток
    1. Разморозить один флакон митомицин С инактивированной ПМЭФ (5,0 х 10 6) в водяной бане при 37 ° C. Передача клеток в 5 мл ES клеточной среде (DMEM, содержащей 15% FBS, 1000 единиц / мл, ингибирующий лейкоз факторов, 100 мкМ заменимые аминокислоты, 2 мМ глутамина, 55 мкМ 2-меркаптоэтанола и 25 ед / мл пенициллина / стрептомицина ), и центрифугируют при 100 х г в течение 5 мин.
    2. Аспирируйте супернатант и ресуспендирования клеток в 30 мл среды ES клеток с последующим распространении на две колбы Т25 (5 мл каждая) и двух 100-мм пластин (10 мл каждый). Инкубируют при 37 ° С, 5% СО 2 в течение 24 часов.
  2. Культура и расширить С9 ЭС клеток
    1. Оттепель один флакон С9 ЭС клеток (2,5 х 10 6 клеток в 0,5 мл) в водяной бане при 37 °, и перечисляетклеток в 5 мл среды ЭС клеток. Центрифуга при 100 х г в течение 5 мин.
    2. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют ЭС клеток в 5 мл ЭС клеток среде с последующей металлизации в Т25 колбы фидера. Инкубируют при 37 ° С, 5% СО 2. Ежедневно Заменить ES клеток среду.
    3. После 2 дней культуры, стволовые клетки должны стать ~ 80% сливной и готовы к пассировать. Промыть клетки с 5 мл PBS (без Ca 2+ и Mg 2+), а затем добавить 2,5 мл предварительно нагретого 0,25% трипсина-ЭДТА. Инкубируют при 37 ° С в течение 10 мин. Добавить 2,5 мл ES клеток среду, чтобы остановить трипсина; пипетки вверх и вниз 15 раз, чтобы разбить скопления клеток. Центрифуга при 100 х г в течение 5 мин.
    4. Аспирата супернатант и ресуспендируют клеток в 4 мл среды ЭС клеток. Передача 1 мл клеток на 100 мм пластины, содержащей 9 мл ES клеточной среде; подготовить два 100-мм пластин. Это 1: 8 проход. Поток клеток ежедневно с 10 мл ES клеточной среде.
  3. Подготовка 96-а фидерных пластины для библиотеки
    1. Как описано в 1.1.1, оттепель три флакона Митомицин-C инактивированные ПМЭФ (каждый из которых содержит 5 х 10 6 клеток) и ресуспендирования клетки от каждого флакона с 33,3 мл ES клеточной среде. Смешайте клетки получением суспензии 100 мл клеток.
    2. Пластина 100 мкл клеток на лунку на десять 96-луночных планшетах. Эти фидерные 96-луночные должны быть готовы, по крайней мере за один день до трансфекции С9 ЭС клеток с PB транспозонов.
  4. Электропорация С9 ЭС клеток с вектором-УПА РВ
    1. Trypsinize и рассчитывать расширенные С9 ЭС клеток с использованием автоматизированного счетчика клеток. Вымойте каждый 100-мм пластины С9 ЭС клеток 10 мл PBS. Добавить 8 мл предварительно нагретого 0,25% трипсин-EDTA и инкубируют при 37 ° С в течение 10 мин.
    2. Остановка трипсин, добавив 2 мл клеточной среде ES. Передача клеточной суспензии в 15 мл трубки и пипетки вверх и вниз 15 раз развалится скопления клеток. Сразу центрифуге при 100 мкг в течение 5 мин, после чего надосадочную жидкость аспирацией.
    3. Ресуспендируют клетокс в 10 мл ES клеточной среде и считать ES клеток с использованием гемоцитометра. Подготовьте шесть 15-мл пробирки суспензии клеток, содержащей 5 каждый х 10 6 клеток ES. Центрифуга при 100 х г в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант и ресуспендирования каждый осадок клеток в 0,8 мл PBS.
    4. Подготовьте шесть электропорации кюветы (4 мм зазора), в которой 0,8 мл клетки переносятся. Для каждого кювете, добавить 1 мкг ПБ-УПА и 20 мкг МПБ транспозаза (mPBase); аккуратно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Положите кювет на льду. Выполните электропорации с использованием электропоратора экспоненциальный параметр на 250 V, 500 мкФ и бесконечности Ом.
      Примечание: Как правило, постоянная времени составляет около 10 до 12 мс для успешного электропорации, которые дают около 1500 до 2000, резистентные к G418 трансформантов на 5 х 10 6 клеток.
    5. Получить и бассейн трансфицированных клеток в T75 колбу, содержащую 98 мл ES клеток среду. Смешайте клетки осторожно пипеткой, а затем передать клетки с резервуаром (50 мл). НамIng пипетки 12-канальный, передавать 100 мкл клеток на лунку в предварительно приготовленный фидерных 96-луночных планшетах (10 в общей сложности). Инкубируют при 37 ° С, 5% СО 2.
    6. Через 24 часа питания клеток в день со свежим ES клеточной среде, содержащей G418 (150 мкг / мл), чтобы выбрать для гена-ловушке клонов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно каждый хорошо будет содержать около десяти G418 устойчивых колоний. Когда эти колонии растут до размера, достаточного (обычно 5-7 дней), 96-луночные планшеты (библиотеки) будет повторен в 2 комплекта для хранения и выбора, соответственно. Каждая пластина в библиотеке обозначен как «суб-библиотеки", так что в этом случае, есть 10 подбиблиотеки.

2. Библиотека репликации

  1. Репликация мастер пластины
    1. 24-48 ч до начала резистентных к G418 колоний, достигающих 50-60% слияния, оттаивают еще три пробирки с митомицином С инактивированной ПМЭФ на десять 96-луночных планшетах в качестве питателей (см раздел 1.3). ЖелатинИзе десять 96-луночных планшетах путем инкубации 0,1% желатина (100 мкл / лунку) при 37 ° С в течение не менее 15 - 30 мин; O / N инкубации является приемлемым.
    2. Подготовка одноклеточных суспензий в 96-луночных планшетах в обработкой трипсином. Отберите среду из 96-луночных планшетах и мыть один раз равным объемом PBS (без Ca 2+, Mg 2+). Добавьте 50 мкл подогретого 0,25% трипсина-ЭДТА, инкубировали при 37 ° С в 5% СО 2 в течение 10 мин. Остановка трипсином с 50 мкл клеточной среде ES. Разбивать клеточные скопления с помощью пипетки вверх и вниз 15 раз с многоканальной пипетки.
    3. Передача 50 мкл суспензии клеток трипсином в соответствующей строке подающего пластины (Master), уже содержащего 150 мкл ES клеток среду и остальных 50 мкл в соответствующей строке желированного пластины (реплики), уже содержащего 150 мкл ES клеток среду. Процесс каждую строку ячеек к Мастер и реплики пластины. Инкубируйте пластин (теперь содержащий 200 мкл CОбъем ulture) при 37 ° С, 5% СО 2 O / N.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Есть в настоящее время двадцать 96-луночных планшетах.
    4. На следующий день питания клеток 100 мкл свежей среды клеток ES, содержащей 150 мкг / мл G418. Замените среду ежедневно до лунки, не 80-90% вырожденная.
  2. Замораживание Мастер пластины
    1. Когда мастер пластины около 80% сливной, Trypsinize клетки, как описано (смотрите раздел 2.1.2).
    2. Удалить пластины и остановки реакции трипсина с 50 мкл 2x морозильных среды (60% Средний ES клеток, 20% FBS, 20% ДМСО). Пипетка вверх и вниз 10 раз с помощью многоканальной пипетки, чтобы обеспечить надлежащее смешение морозильной среды.
    3. Положите 96-луночных на в плотно закрытой коробке пенополистирола и поместить его в -80 ° C морозильнике до четырех месяцев хранения. Четыре месяца позволит достаточно времени, чтобы завершить выбор стресс и определить, какие из скважины Мастер пластины содержат клоны интерес.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хранение при -80 & #176; С больше, чем 4 месяца приведет к снижению жизнеспособности клеток. Можно использовать крио-пробирок в формате 96-луночного, которые могут храниться в паровой фазе жидкого азота в течение длительного хранения.
  3. Подготовка пластин ДНК и суб-библиотеки бассейны от реплик пластин
    1. 24-48 ч до тиражирования в дальнейшем пластин ДНК и суб-библиотеки бассейнов, подготовить десять 100-мм пластин с митомицином С инактивированной ПМЭФ для суб-библиотека бассейна, и десять клейстеризованный 96-луночных планшет для репликации ДНК. Обратитесь к разделу 1.3 для общей процедуры.
    2. Trypsinize клетки в 96-и реплик пластин (обратитесь к разделу 2.1.2). В трипсином шаге 10 мин, аспирации желатин с пластин ДНК и заменить 150 мкл клеток ES-среде, содержащей G418 (150 мкг / мл). Кроме того, подготовить резервуар, содержащий 5 мл ES клеточной среде для объединения в "подбиблиотек" в 100-мм пластины питателя.
    3. После трипсинизации, перестают пытатьсяpsin с 50 мкл клеток Е. среднего по одной строке за раз с помощью пипетки 12-канальный. Внесите вверх и вниз 10 раз развалится скопления клеток.
    4. Передача 50 мкл клеточной суспензии в соответствующей строке пластины ДНК и передавать оставшиеся 50 мкл в резервуар, содержащую 5 мл среды ES клеток. После завершения одного полного 96-луночного планшета, аспирации среды из 100-мм пластины питателя, в которой объединенные клетки переносят. Эти объединенные содержащие мутации клетки обозначаются как «суб-библиотеки".
    5. Повторите для остальных девяти 96-луночных планшетах. Поток 96-а ДНК и 100-мм объединяли "суб-библиотеки« тарелки ежедневно ES клеток, содержащей G418 средней (150 мкг / мл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Есть в настоящее время десять 96-луночных '', ДНК и десять 100-мм «суб-библиотека" пластины.
  4. Замораживание пластины ДНК. Когда клетки в тарелке ДНК 80-90% сплошности, аспирации среды, промыть клетки дважды 100мкл PBS и хранить при -20 ° С для выделения ДНК позже 6 геномной. Эти пластины ДНК будут демонстрироваться с помощью ПЦР для выявления которых соответствующие лунки в «Мастер» пластины содержит клон интерес.

3. Доксициклин индуцированных Гомозиготные Мутанты

  1. Замораживание суб-библиотека бассейны и прохождение клеток для лечения доксициклина
    1. 24 ч до 100-мм «суб-библиотека» пластин, имеющих колонии достаточно большой, чтобы дать 70-80% слияния, подготовить набор из десяти желатинизированного 100-мм пластин для лечения доксициклина.
    2. Подготовка одноклеточных суспензий из каждого суб-библиотеки (см разделах 1.4.1 и 1.4.2 для деталей). Передача 5 × 10 6 клеток на желатинированный 100-мм пластины с доксициклином (1 мкг / мл); инкубировать при 37 ° С, 5% СО 2. Замораживание оставшихся без доксициклина обработанные суб-библиотеки бассейны в 5 х 10 6 клеток на флакон.
  2. Прохождение клеток в присутствиидоксициклина выбить BLM
    1. Прохождение суб-библиотеки в 1: 8 каждые 2-3 дней в присутствии доксициклина (1 мкг / мл) на срок до двух недель, в течение которых DOX-индуцированной нокаут Blm будет способствовать потере гетерозиготности в клетке Население, что позволяет поколения гомозиготных мутантов.

4. Стресс Выбор и выделение устойчивых клонов

  1. Тема доксициклин-клеток, обработанных выбора напряжения
    1. 24 ч до пассажей доксициклина обработанных клеток для выбора напряжения, подготовить десять клейстеризованный 150-мм пластин, место в 37 ° C, 5% CO 2 увлажненном инкубаторе.
    2. Подготовка одного суспензии клеток каждого суб-библиотеки по трипсинизации (обратитесь к разделу 1.4.1 и 1.4.2 для деталей). Семенной 6,6 х 10 6 клеток на каждой 150-мм пластины в 30 мл общего объема культуры, распространять клетки равномерно. Инкубируйте клетки с стресс (10 мкМ параквата или бездействия -меркаптоэтанол,в клеточной среде ES, содержащий 7,5% инактивированной нагреванием FBS) в течение 7 дней, после чего заменить обычной среде ES клеток, чтобы позволить выжившие клетки расти в колонии для сбора.
    3. Дополнительно: Замораживание оставшихся доксициклин-клеток, обработанных в 5,0 х 10 6 клеток на флакон.
  2. Выберите стресс устойчивых колоний
    1. После восстановлении нормальной СМИ в течение недели, наблюдать, как многие стресс устойчивые колонии присутствуют. В зависимости от числа колоний, чтобы ее взяли, подготовить достаточно скважин с митомицином С инактивированной ПМЭФ на 96-луночных планшетах за один день заранее, соответственно (смотрите раздел 1.1 для более подробной информации).
    2. В день сбора, аспирации и заменить среду в фидерной 96-луночного планшета с 100 мкл свежей ES клеток средних, поместите обратно в 37 ° C, 5% CO 2 увлажненном инкубаторе. В это время, подготовить U-нижней 96-луночный планшет с 50 мкл 0,25% трипсина-ЭДТА на лунку. Аспирируйте среду из 150-мм пластины отбора стресс и добавить екаче объем PBS.
    3. Установите микропипетку 2 мкл, и "забрать" выживших колоний в U-нижней трипсина, содержащий скважин, выбирая один колонию на лунку. Это приемлемо, чтобы пластина сидеть при комнатной температуре до тех пор, необходимое количество колоний не была выбрана. Затем инкубируют нижнюю пластину U при 37 ° С, 5% СО 2 в течение 10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, мы берем 1 ч, чтобы забрать 96 колоний.
    4. Стоп трипсина реакции одну строку в то время с 50 мкл ES клеток среднего помощью многоканальной пипетки. Пипеток вверх и вниз 15 раз для получения суспензии отдельных клеток и передают 100 мкл клеток в соответствующей строке подающего пластины, уже содержащего 100 мкл ES клеточной среде. Завершить передачу для всей пластинки. Культуры клеток O / N в 200 мкл. На следующее утро, аспирация средних и заменить 100 мкл клеточной среде ES.
  3. Репликация 96-луночных на
    1. Когда скважины подобранных колоний 80-90% conflueнт, повторить на две согласующих пластин, по одному для выделения ДНК, а другой для клеток резервирования. Эти пластины желатинизированный и не содержат митомицин С инактивированной ПМЭФ.
    2. Аспирируйте среднего и промыть 100 мкл PBS. Добавить 50 мкл 0,25% трипсина-EDTA в каждую лунку, инкубируют при 37 ° С в течение 10 мин. Остановка трипсина с 150 мкл среды ЭС клеток, перемешать с помощью пипетки, и передавать 100 мкл клеточной суспензии в соответствующей строке двух 96-луночных планшетах. Изменить среднего ежедневно.
    3. Когда пластины 80-90% сливной, заморозить один набор пластин, как «резервного» (обратитесь к разделу 2.2 для более подробной информации). Другой набор пластин расширена, как описано ниже.
  4. Расширение клетки для изоляции геномной ДНК
    1. Подготовка суспензии отдельных клеток в пластине ДНК 96-луночного (см 2.1.2 для деталей).
    2. Передача клеточной суспензии из каждой отдельной лунке 96-луночного планшета с лунку 24-луночного планшета (4 объема) с использованием MICRopipette. Обеспечить нет перекрестное загрязнение ни клеток, как "определена" колонии "клональной 'происхождение. Культуры клеток в 0,5 мл среды ES клеток, не изменяя среду ежедневно до скважин 80-90% вырожденная.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Планшет 24-а позволит достаточный выход геномной ДНК для ПЦР-анализа.

5. Выявление PB Insertion сайтов и захваченных генов

  1. Геномную ДНК из изоляции 24-луночного планшета: лизировать клетки в тарелке 24-луночного и выделения РНК, свободной от геномной ДНК.
  2. Выполните Splinkerette ПЦР (SpPCR) для генерации последовательности фрагментов, фланкирующие интеграции транспозонов сайт PB, как описано 7,8.
    ПРИМЕЧАНИЕ: SpPCR является пятидневная процесс, хотя руки-на время каждый день минимальна.

6. Генетический анализ мутантных клонов

  1. Найдите господину хорошо и очистить клон интерес.
    1. При интеграции сайта ПБ былотображается, дизайн прямого праймера выше сайта интеграции для использования с обратным праймером Pb (например, PB3'-1) 8 и экран пластины ДНК, соответствующий тому же 'подбиблиотека', из которого напряжение устойчивый клон был выбран. Ожидать, чтобы найти только один положительный хорошо по всей пластине ДНК 96-а. Оттепель это точное и от «Мастер» пластины в 24-луночного планшета на фидерах и не растут клетки до 80-90% слияния.
      Примечание: В этот момент, это также содержит смесь генов-ловушке клонов.
    2. Когда 24-луночный планшет 80-90% сплошности, Trypsinize клетки и пластины 1000 ЭС клеток в 100 мм пластины питателя (обеспечить суспензии отдельных клеток). Прохождение оставшиеся клетки в Т25 колбы на питателей для расширения. Замораживание клетки от T25 колбу, когда колонии 80-90% вырожденная. Замораживание 4 флаконов в T25 колбу в качестве резервных копий.
    3. Разрешить колонии расти в течение 7 дней, а затем выбрать 96 колоний в 96-луночный FeЭдер пластины. Обратитесь к разделу 4.2 для получения процедуру. Репликация пластину, когда готовый в тарелке "ДНК" и заморозить другие, как "2-й -МАСТЕР 'пластины (обратитесь к разделу 2.2 для замораживания).
    4. Разрешить колонии достичь 80-90% слияния. Экран пластину ДНК, чтобы найти лунки, содержащие очищенный клон интерес. Expand клетки от 96-луночного 2-й -МАСТЕР пластины с 24 лунками, а затем в колбу Т25 (все от питателей). Замораживание 4 флаконов в T25 колбу.
      Примечание: В этот момент, ген-ловушке клеточной линией является клональной, не подвергается воздействию стрессора, и подходит для производства мыши.
  2. Определить количество PB вставки: Оттепель один флакон стресс устойчивостью клеточной линии и расширить клетки в клейстеризованного T25 колбу. Изолировать геномной ДНК и проверки числа копий транспозона PB. Это может быть достигнуто путем количественной ПЦР ориентации ген неомицина.
  3. Измерьте уровень экспрессии гена: После Конфиrming есть одно событие интеграция ПБ в клеточной линии интересов, измерить уровень экспрессии гена захваченного по РТ-КПЦР с использованием специфических зондов TaqMan для каждого гена.
  4. Последовательность мутантный мРНК: Создание кДНК ампликон помощью ПЦР с использованием праймеров, вверх по течению отжиг в экзоне и вниз по течению отжига праймеров к последовательности сплайсинга акцептора гена ловушки кассеты. Последовательность кДНК фрагмент, чтобы подтвердить, что ожидаемое сплайсинга происходит в ловушке гена.
  5. Remobilize в PiggyBac транспозон для проверки причинно-следственной связи между захваченного гена и стрессоустойчивости.
    1. 24-48 ч до оттаивания клеток для PB ремобилизации, оттепель и пластины питателей DR4 на одном Т25 колбы и два 100-мм пластин. По крайней мере, один день после того, как кормушки DR4 высевают на T25 колбу, оттепель один флакон клеточной линии, содержащей вставку PB и пластины клеток в T25 колбу, содержащую DR4 кормушки. Расти клетки ES клеточной средев течение 48 ч, изменение среды в день.
    2. Подготовка суспензии отдельных клеток из ЭС клеток. Граф клеток с автоматизированной счетчика клеток, и передачи 5.0 х 10 6 клеток ES в 15-мл пробирку. Центрифуга при 100 мкг, и ресуспендирования клеток в 800 мкл PBS. Перевести суспензии в 4 мм кювете.
    3. Добавить 20 мкг mPBase Puro в кювету, перемешать с помощью пипетки и электропорации клетки (обратитесь к разделу 1.4 для более подробной информации). Распределите трансфекции клеток на двух 100-мм пластин DR4 фидерных. Культуры клеток O / N в ES клеточной среде.
    4. На следующее утро, кормить клетки с ES среде с 1 мкг / мл пуромицин и культуры клеток в течение 48 часов. Вывод выбор пуромицину и продолжают культуры клеток в течение 5 дней. Когда колонии достаточно большой для сбора, выберите в питающий 96-луночного планшета (обратитесь к разделу 4.2).
    5. Когда определена клетки достигли 80-90% слияния, разделения 1/6 го пластины в пластину ДНК и 1/6 й ФЛели в G418 пластины, оставляя 2/3 выстр ячеек в оригинальной пластины должны быть заморожены (обратитесь к разделу 2.2 для замораживания).
    6. Культура пластина ДНК в ЭС клеток среда для изоляции позже ДНК, и G418 пластины в 150 мкг / мл G418, чтобы проверить на потерю устойчивости к неомицину. Скважины с не жизнеспособных клеток после 72-96 часов в культуре, содержащей G418 указывают на успешную ремобилизацию гена-захвата PB транспозонов.
    7. Соответствующие скважин в пластине '' ДНК будут демонстрироваться с помощью ПЦР, чтобы подтвердить PB транспозон был удален. Когда пластина ДНК 90% сливной, изолировать геномной ДНК в 96-луночного формата пластины 4 для ПЦР скрининга для восстановления последовательности дикого типа и отсутствием нео-IRES в качестве средства для подтверждения возвращение.
    8. Оттепель совпадающие скважин от Master пластины 24-луночного планшета и расширить до Т25 колбы (все с фидеров). Замораживание четыре флаконов в T25 колбу в качестве резервной.
    6. 7. Генерация мутантов мыши

    1. Восстановление устойчивых ES клеток от мастер пластин и использовать их для инъекций эмбрионов для получения химеры. Около 15-20 ЭС клетки вводили в индивидуальной линии C57BL / 6 бластоцисты. Передача 15 бластоцисты на мышь в матку самки псевдобеременных (штамм ICR). Mate мужской химеру (указанную в ES-клетки, специфические агути цвета пальто), извлеченного из помета с несколькими молодыми целинных C57BL / 6J женщин, чтобы проверить для передачи зародышевой линии, и создать колонию мутантных мышей.
    2. Изолировать и фибробласты тест хвост кожу от F1 мутантных мышей и дикого типа однопометница для активных форм кислорода (АФК) уровне и устойчивости к параквату 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В типичном эксперименте мутагенеза, трансфекции состоит из в общей сложности 3 х 10 7 ЭС клеток PB-УПА и МПБ транспозазы. Числа гена-ловушке ЭС клеток, полученных в двух независимых экспериментов суммированы в таблице 1. Эффективность генной захвата составляет около 0,04%. Объединенные библиотеки генов ловушки содержат 22,400 независимых мутантов, о полный охват генома мыши (23000 генов, кодирующих). Чрезмерное освещение может быть достигнуто путем создания более мутанта с помощью повторного мутагенеза и / или масштабирования процесса.

Поскольку ген-ловушки библиотеки содержат случайные мутации, это не возможно предсказать количество мутантов, обладающих фенотип стрессоустойчивости. Были выполнены два независимых выбора для сопротивления PQ; комбинированное скрининг 22,440 независимых гена-ловушки мутаций раскрыты 17 мутаций, которые придают устойчивость к сотовой PQ (0,08%) (Таблица 1).

<р = класс "jove_content"> Мы очистили 3 мутантные клоны, то Pigl, Tiam1 и Rffl, от мастер-пластин для дальнейшего анализа и производства мыши. Клетки с гетерозиготной мутации Rffl успешно индуцировали для получения гомозиготного потомства, нокаутировав BLM. Тем не менее, мы не смогли произвести любые гомозиготных мутантов мутантов Pigl и Tiam1, по-видимому из-за гомозиготности связанный летальности клеток. Сопротивление стресс из этих очищенных клонов было подтверждено с помощью 2 различных типов стресса: упущение 2-меркаптоэтанола (2-ME) и PQ (рисунок 2). По удаления PB из этих клонов, связанный фенотип стрессоустойчивость также потерял (рисунок 2), подтверждая, что ген-ловушки мутации являются причинным фактором. Характеристика клонов, выделенных из основных пластин очень важно, поскольку это исключает стохастический поражение во время выбора напряжений в качестве причины наблюдаемой фенотипа.

Из 3мутантные стволовые клетки вводятся в бластоцисты мыши для производства (таблица 2), 2 строки (Pigl и Tiam1) показывают передачу зародышевой линии. Инъекция производится Rffl только одна женщина химеру, которая не была оптимальной количество химеры, чтобы начать с. Таким образом, отказ от передачи зародышевой линии в Rffl, скорее всего, из-за одного некомпетентным химера. Мы протестировали клеточного фенотипа фибробластов кожи, выделенных из мутантных мышей Pigl и показал, что они поддерживали сниженный уровень эндогенных активных форм кислорода (АФК), а также стрессоустойчивости к PQ (рисунок 3).

фигура 1
Рисунок 1. ES клеток мутагенеза и отбора стресс. (А) ПБ-УПА вектор. Объективный поли (УПА) ловушка вектор, состоящий из сплайсинга акцептора (SA), бычьего гормона роста поли-аденилат сигнала (PA), phosphoglycerate киназы (PGK), промотор неомицинфосфотрансферазы (нео), внутренний сайт рибосомного входа (IRES), и сросток донора (SD) с искусственным ATG (в 3 различных рамок считывания), был клонирован в PiggyBac транспозона, в окружении 3 ' и 5 'длинный концевой повтор (LTR). (Б) Случайный мутагенез ЭС клеток и отбор для стресс-устойчивых клонов. ЭС клетки совместно трансфицируют с помощью электропорации с PB-УПА и mPBase последующим покрытие на 96-луночных планшетах. Генные захваченные клоны отбирали по устойчивости к G418; когда сливной, они были разделены на 2 набора реплик. Один набор реплик была дополнительно разделена на две половины для выделения ДНК и отбора напряжения от параквату (PQ); другой набор реплик (мастер) был заморожен вниз. Выжившие колонии клеток ES, выделенные из лечения стресса были проанализированы молекулярно для вставки РВ СП-PCR. Праймеры затем предназначен для скрининга пластины реплики ДНК, из которой также содержащий Сиблинг PQ R клон может быть расположен на основной матрицы. Эти клетки для стрессоустойчивости анализа на различных стрессовых факторов и для производства мыши. Измененный Чик и др. 7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. Стресс сопротивления в мутантных клеток ES. (А) Сопротивление 2-меркаптоэтанола (2-ME) вывода. (Б) сопротивление параквата (PQ). Показаны родительские дикого типа ES клеток (C9: желтый), стресс-устойчивых управления ES клон клеток, (4C11: красный), восстановленные из предыдущего исследования 5, и три гена-ловушки клонов (серые). Клетки были подвергнуты обработке подчеркнуть в течение двух дней, после чего количество жизнеспособных клеток подсчитывали. < EM> Pigl, Tiam1 и Rffl гетерозиготы. (PB / +: темно-серый) Выставка сопротивление обоих этих факторов стресса Rffl гомозиготы (PB / PB: черный), проявляют сильное сопротивление стресс по сравнению с гетерозигот. Сопротивление обоих стресса погиб, когда PB вставки были удалены (+ / +: светло-серый). Усы представляют SD от среднего (п = 4). * Р <0,001, # р = 0,01 между геном ловушки клонов и дикого типа родительского С9, оцененных Стьюдента т Испытайте. Образование (С) ES клеток колонии под PQ (10 мкм) лечения. Стресс устойчивостью ES клоны были способны образовывать колонии в культуре под лечения PQ в то время как количество и размер колоний от дикого типа клона были значительно снижены. Измененный Чик и др. 7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

нт "FO: Keep-together.within-странице =" всегда "> Рисунок 3
Рисунок 3. Характеристика Pigl Pb / + фибробластов. (А) активные формы кислорода (АФК) уровень. Фибробласты кожи хвоста, выделенные из образцов дикого типа (WT) и Pigl Pb / + мышей окрашивали СМ-DCFCA и флуоресценцию нормализовалось против Hoechst. Было высказано содержание АФК в относительных единицах флуоресценции (РФС). Значение Р оценивали два Стьюдента т -TEST (N = 8). (Б) PQ сопротивление. Фибробласты кожи хвоста от дикого типа (WT) и Pigl Pb / + мышей подвергали воздействию до 4 мм PQ в течение 6 ч, после чего Жизнеспособность клеток измеряли с помощью МТТ анализа. Процент живых клеток после обработки PQ рассчитывали по отношению абсорбции, полученного из PQ-обработанной CEзаполняет и от ООН обработанных клеток. Значение Р оценивали по одному Стьюдента т -TEST (N = 8). Измененный Чик и др. 7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Библиотека Суб-библиотеки Штамм Е. клеток Количество генов в ловушке клона Количество PQ R клонов
1 C9PA01 - C9PA10 С9 (BLM тет / тет) 9000 7
2 C9PA11 - C9PA20 С9 (BLM тет / тет) 13440 10
Всего 22440 17

Таблица 1. PiggyBac ген-ловушка строительство библиотеки и восстановление PQ устойчивых клонов. Измененный Чик и др. 7.

</ TR>
ES клон клеток вводили Количество химеры восстановлены Передачи зародышевой линии *
Pigl PB / Pigl + 4 Да
TIAM1 PB / TIAM1 + 2 Да
Rffl PB / Rffl + 1 Нет

Таблица 2. Генерация мышей. Измененный Чик и др. 7.

* Половые передачи был подтвержден наследования гена-ловушки аллеля обнаружены с помощью ПЦР для генотипирования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vector
PB-UPA
mPBase
mPBasePuro
Tissue Culture
500-ml Stericup filters EMD Millipore SCGPU05RE
250-ml Stericup filters EMD Millipore SCGPU02RE
50-ml Steriflip-GV filters EMD Millipore SE1M179M6
KO DMEM Life Technologies 10829-018
DMEM Sigma-Aldrich D6429
FBS Tissue Culture Biologicals 104
Heat Inactivated FBS Sigma-Aldrich F4135-500
LIF EMD Millipore ESG1107
Non-essential Amino Acids Life Technologies 11140-050
GlutaMAX Life Technologies 35050-061
Pen/Strep Life Technologies 15140148
β-Mercaptoethanol Life Technologies 21985-023
Methyl Viologen dichloride (Paraquat) Sigma-Aldrich 856177
Dimethyl Sulphoxide Hybri-MAX Sigma-Aldrich D2650
EmbryoMAX 0.1% gelatin EMD Millipore ES006B
DPBS/Modified HyClone SH30028.02
0.25% Trypsin-EDTA Life Technologies 25200-056
T25 Flask Corning 353108
T75 flask Corning 353135
100-mm  plate Corning 353003
150-mm  plate Corning 430599
96-well  plate Corning 3585
96-well U-bottom plate Corning 3799
24-well plate Corning 3526
50-ml reservoir  Corning 4870
15-ml tubes VWR International, LLC 82050-276
Primary Mouse Embryonic Fibroblasts EMD Millipore PMEF-NL
DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts Applied StemCell ASF-1001
Mitomycin C Fisher BioReagents  BP25312
Geneticin (G418) Life Technologies 11811-023
Doxycycline Fisher BioReagents  BP26531
Cryotubes Thermo Scientific 377267
Centrifuge  Eppendorf Centrifuge 5702
TC10 cell counter Bio-Rad
Counting Slides (for TC10) Bio-Rad 1450011
Electroporation
Gene Pulser Xcell Bio-Rad 1652611
Gene Pulser Cuvettes (4 mm gap) Bio-Rad 1652088
Molecular Biology
Thermal Cycler Eppendorf Mastercylcer ep Gradient  S
Puregene Core kit B Qiagen 158745
Topo-TA Cloning kit Life Technologies  450030
High Capacity cDNA synthesis kit Applied Biosystems 4368814
NaCl Fisher BioReagents  BP358-212
100% ethanol Decon Laboratories, Inc. 2716
Double Processed Tissue Culture Water Sigma-Aldrich W3500
Sau3A1 New England BioLabs R0169L
T4 DNA Ligase New England BioLabs M0202T
EcoRV New England BioLabs R3195S
96-well Lysis Buffer (Ramires-Solis et al. 1992)
Trizma Base Sigma-Aldrich T1503
Hydrochloric Acid Fisher BioReagents  A144-212
EDTA Sigma-Aldrich E5134
N-Lauroylsarcosine sodium salt Sigma-Aldrich L5777
Proteinase-K Fisher BioReagents  BP1700
Electrophoresis
Mini-Sub Cell GT Bio-Rad 170-4469EDU
LE Agarose  GeneMate E3120500
Ethidium Bromide  Fisher BioReagents  BP1302
100 BP DNA Ladder New England BioLabs N3231S
1 Kb DNA Ladder New England BioLabs N3232S
2-log DNA Ladder New England BioLabs N3200L

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Johnson, T. E., et al. Longevity genes in the nematode Caenorhabditis elegans also mediate increased resistance to stress and prevent disease. J Inherit Metab Dis. 25, 197-206 (2002).
  2. Murakami, S., Salmon, A., Miller, R. A. Multiplex stress resistance in cells from long-lived dwarf mice. Faseb J. 17, 1565-1566 (2003).
  3. Perez, V. I., et al. The overexpression of major antioxidant enzymes does not extend the lifespan of mice. Aging Cell. 8, 73-75 (2009).
  4. Martin, G. M. Genetic engineering of mice to test the oxidative damage theory of aging. Ann NY Acad Sci. 1055, 26-34 (2005).
  5. Chick, W. S., Drechsel, D. A., Hammond, W., Patel, M., Johnson, T. E. Transmission of mutant phenotypes from ES cells to adult mice. Mamm Genome. 20, 734-740 (2009).
  6. Ramirez-Solis, R., et al. Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples. Anal Biochem. 201, 331-335 (1992).
  7. Uren, A. G., et al. A high-throughput splinkerette-PCR method for the isolation and sequencing of retroviral insertion sites. Nat Protoc. 4, 789-798 (2009).
  8. Wang, W., Bradley, A., Huang, Y. A piggyBac transposon-based genome-wide library of insertionally mutated Blm-deficient murine ES cells. Genome Res. 19, 667-673 (2009).
  9. Chick, W. S., et al. Screening for stress-resistance mutations in the mouse. Front Genet. 5, 310 (2014).
  10. Salmon, A. B., et al. Fibroblast cell lines from young adult mice of long-lived mutant strains are resistant to multiple forms of stress. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, 23-29 (2005).
  11. Skarnes, W. C., et al. A public gene trap resource for mouse functional genomics. Nat Genet. 36, 543-544 (2015).
  12. Baker, K. E., Parker, R. Nonsense-mediated mRNA decay: terminating erroneous gene expression. Curr Opin Cell Biol. 16, 293-299 (2004).
  13. Shigeoka, T., Kawaichi, M., Ishida, Y. Suppression of nonsense-mediated mRNA decay permits unbiased gene trapping in mouse embryonic stem cells. Nucleic Acids Res. 33, e20 (2004).
  14. Symula, D. J., Zhu, Y., Schimenti, J. C., Rubin, E. M. Functional annotation of mouse mutations in embryonic stem cells by use of expression profiling. Mamm Genome. 15, 1-13 (2004).

Tags

Биология развития выпуск 105 Стрессоустойчивость долговечность эмбриональные стволовые клетки PiggyBac вперед генетики функциональной геномики паракват мышь.
Вперед генетический подход к Раскройте стрессоустойчивости генов в мышах - высокой пропускной экране в ЭС клетках
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ludwig, M., Kitzenberg, D., Chick,… More

Ludwig, M., Kitzenberg, D., Chick, W. S. Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice — A High-throughput Screen in ES Cells. J. Vis. Exp. (105), e53062, doi:10.3791/53062 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter